一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂及其制备方法与流程

1.本发明属于生物材料制备领域，具体涉及一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂及其制备方法。


背景技术：

2.一直以来，由交通事故、意外创伤、运动损伤和骨质疏松等引发的骨折问题备受关注。对于骨折的治疗策略，目前主要通过在体内嵌入金属板、钉、螺丝等固定方式恢复骨结构，促进机体组织的自我再生修复。然而，这些不可降解的装置或材料在骨修复完成后需要进行二次手术移除。不仅如此，由于应力遮挡，金属固定装置可能存在感染和损伤周围组织以及引发再次骨折等高风险问题。此外，金属植入材料会受到体内生理环境作用而发生腐蚀，进而产生毒副作用，而腐蚀后的金属植入材料会导致材料功能退变或失效，从而引发不良组织学反应如水肿、感染、组织坏死等。例如，在钴合金、钛合金等金属植入材料与骨骼之间产生的弹性模量差异会导致固定部位的局部张力和骨萎缩。因此，亟需开发新型生物医用材料用于临床骨折手术。
3.骨粘合剂作为一种新型生物医用材料，能够通过在湿态环境下形成坚固耐用的承重力来提供骨与骨和/或骨与种植体的粘接，并最终在新骨形成后自身代谢为无毒材料。与传统的侵入性固定材料如钢板或螺钉等相比，已制备的骨粘合剂证实不会产生继发性组织损伤和微生物感染的问题。在最近的几十年里，研究人员希求从大自然中获取灵感，包括模仿自然界中具有强粘附的生物或天然材料，开发用于骨组织的强生物活性粘合剂。理想的仿生骨粘合剂，应满足骨组织环境的各项参数要求，具体包括：在湿态环境中保持较强的粘附力、在生理条件下保持机械稳定、良好的生物相容性、与骨组织相近的弹性模量以及生物可降解性。
4.专利cn 111973804a公开了一种高度仿生活性骨组织的负载干细胞的可注射骨修复粘合剂，该粘合剂由高分子材料i型胶原、微米级球形羟基磷灰石以及多巴胺改性的透明质酸组成，并负载干细胞。该骨修复粘合剂在提高组织粘附性的同时可促进干细胞的粘附和增殖，增强干细胞的血管生成和成骨作用。但该材料中多巴胺的接枝率比较低，制备过程复杂，且该粘合剂的粘附强度不佳，无法固定在骨损伤部位，从而影响骨修复效率。又如，专利cn 110947026a公开了一种由邻硝基苄基修饰的天然生物大分子、光引发剂和纳米成骨颗粒组成的用于加速骨折愈合的骨粘合生物胶水。通过光照激活邻硝基苄基类扳机产生醛基，与组织中的氨基发生化学键合，从而粘合骨碎片与周边骨组织。随后，纳米成骨颗粒进入邻硝基苄基修饰的天然生物大分子的分子间隙孔富集并矿化，加速新骨生成。然而，这种借助外部光源设备才能成胶并粘合的使用方式，增加了操作的繁琐度和使用条件的限制，不利于在紧急情况下的应用。再如，专利cn 102307941a公开了一种由磷酸四钙和有效结构上类似于磷酸丝氨酸的物质反应生成具有粘性的胶状物质，该胶状物质可粘结骨缺损部位，固定骨骼。该胶状物质虽能在干态环境下具有很强的粘附性，且在体外实验中对缺损骨
骼能够有效粘结，但在湿态环境下，该胶状物质的粘附性能下降，且该粘合剂一年内在动物体内降解仅为70%，其降解速率与成骨速率不相匹配，故该粘合剂在体内的应用严重受限。
5.由海洋贻贝分泌的贻贝粘附蛋白（mfp）富含的3,4-二羟基苯丙氨酸（dopa）可以排出组织月界面间的水分子和离子盐，并形成强大的共价键和非共价键，从而表现出强粘附能力。藤壶能通过产生特定的粘附蛋白混合物（cps）对界面进行粘附。此粘附蛋白混合物主要由蛋白cp19k组成，含有大量阳离子赖氨酸和疏水氨基酸。据推测，藤壶接触到界面时，在相邻疏水氨基酸的协同作用下，阳离子与带负电的表面形成强烈的静电相互作用后带来强的湿态粘附作用。同时，cp19k蛋白富含淀粉样蛋白β-sheet，它垂直于纤维轴定向并通过致密氢键网络连接，可以连续延伸成超过数千个分子单元的超级大分子，增加了藤壶在界面水下粘附作用。
6.基于此，本发明提供了一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂及其制备方法。该双仿生骨粘合剂主要由单宁酸等仿生海洋贻贝生物物质、海藻酸钠等仿生海洋藤壶生物物质与丝素蛋白组成，并引入钙离子（ca
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）和镁颗粒自组装来稳定粘合剂内部结构。在使用时经简单混合后，所述的双仿生骨粘合剂可以直接注射在损伤部位并原位成胶。实验结果表明，该双仿生骨粘合剂具有快速固化、良好的生物相容性、强湿态组织粘附和匹配骨组织强度的力学性能；而基于镁颗粒与水反应产生氢气和镁离子（mg
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）的机理，该粘合剂同时具有抗炎并调节间充质干细胞的分化以促进骨骼修复的潜力，能够在骨损伤早期修复中起到良好的固定作用及潜在的促进骨再生能力。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂及其制备方法。其中，引入的单宁酸等仿生海洋贻贝生物物质能够与邻苯二酚基团形成π-π堆积以诱导丝素蛋白从无规则卷曲构象转变为更稳定的β-sheet蛋白折叠构象；同时，单宁酸等仿生海洋贻贝生物物质也可以与ca
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和mg
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形成金属-酚类配位键，其稳定的金属配位键使动态网络结构的粘合剂具有良好的机械性能与力学强度，能够起到固定骨折部位的作用，可以保护骨骼形态和结构，从而提高异植物的植入率促进损伤部位的修复效率。而基于镁颗粒与水反应产生氢气和镁离子的机理，所述的粘合剂还具有抗炎并调节间充质干细胞的分化以促血管化的功能。因此，本发明骨粘合剂展示出强粘附性、强可塑性、良好的生物相容性、优异的力学性能、广泛的适用范围、安全无毒以及便于操作的优点，有望作为稳固骨骼和修复缺损部位的潜在临床材料。
8.为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂，其制备方法包括以下步骤：（1）将无水碳酸钠加入到煮沸的去离子水中，搅拌混匀，然后加入蚕丝进行脱胶；清洗干燥后，产物用溴化锂溶液或氯化钙/无水乙醇/水三元溶液溶解，然后在去离子水中进行透析；透析后的溶液经离心过滤得到溶液s1；（2）将仿生海洋藤壶生物物质加入去离子水中，在一定温度下搅拌混合均匀，得到溶液s2；（3）将氯化钙粉末加入去离子水中，在室温下搅拌混匀，得到溶液s3；（4）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，然后向其中加入镁粉，搅拌混合
均匀，得到仿生海洋贻贝生物物质-镁颗粒的混合溶液s4；（5）在室温下，将溶液s1、s2、s3混合并加入混合溶液s4，充分搅拌混合，即得到所述可注射双仿生骨粘合剂材料。
9.进一步地，步骤（1）中所述脱胶的时间为5-120 min。
10.进一步地，步骤（1）中所述干燥的时间为1-50 h，温度为5-100 ℃。
11.进一步地，步骤（1）中所述透析的时间为36-100 h。
12.进一步地，步骤（1）中所得溶液s1的质量浓度为0.1-50.0%，优选为1-15.0%。
13.进一步地，步骤（2）中所述仿生海洋藤壶生物物质为海藻酸钠、聚丙烯酸-羟基琥珀酰亚胺酯、聚天冬酰胺、trx-balcp19k融合蛋白、巯基化透明质酸和球蛋白中的一种或多种，优选为海藻酸钠。
14.进一步地，步骤（2）中所述搅拌的温度为10-80 ℃，优选为15-80 ℃，时间为5-72 h，优选为8-24 h。
15.进一步地，步骤（2）中所得溶液s2的质量浓度为0.1-80.0%，优选为0.1-20.0%。
16.进一步地，步骤（3）中所述搅拌的时间为1-120 min，优选为5-15 min。
17.进一步地，步骤（3）中所得溶液s3的质量浓度为0.01-20.0%，优选为0.1-10.0%。
18.进一步地，步骤（4）中所述仿生海洋贻贝生物物质为酚羟基壳聚糖、多巴胺、单宁酸、没食子酸和酚羟基化丙氨酸中的一种或多种，优选为单宁酸。
19.进一步地，步骤（4）中所得混合溶液s4的质量浓度为0.1-60.0%，优选为1-50.0%，其中所含镁粉的质量为0.001-10.0%。
20.进一步地，步骤（5）中所用溶液s1与溶液s2的体积比为1:1000-1000:1，优选为1:15-15:1；所述用溶液s1与溶液s3的体积比为1:1000-1000:1，优选为1:15-15:1；所用混合溶液s4与溶液s1、s2、s3混合液的体积比为1:1000-1000:1，优选为1:20-20:1。
21.进一步地，步骤（5）中搅拌混合的时间为1-180 min，优选为1-20 min，温度为5-50 ℃，优选为15-30 ℃。
22.与现有技术相比，本发明受海洋贻贝和藤壶水下粘附机理的启发，引入单宁酸等仿生海洋贻贝生物物质和海藻酸钠等仿生海洋藤壶生物物质与ca
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和mg
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形成金属-酚类配位键，以制备具有强机械性能和动态网络结构的粘合剂。其中，仿生海洋藤壶生物物质侧链上的羧基能够吸收界面中的水分以打破界面与水层的结合，提高动态网络与界面的结合强度，从而提高粘合剂的粘附性能。同时，通过π-π堆积相互作用，仿生海洋贻贝生物物质能够诱导粘合剂中的丝素蛋白从无规则卷曲构象转变为更稳定的β-sheet蛋白折叠构象以提高动态网络的内聚力，进而提高粘合剂的粘附强度。此外，作为骨愈合过程中必不可少的成分，mg
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具有抗炎并调节间充质干细胞的分化以促血管化的功能，可以促进骨损伤的修复。因此，本发明设计制备的双仿生骨粘合剂具有湿态粘附性强、韧性好、适用范围广、安全无毒、生物相容性好的优点，有望实现临床中体内骨损伤的固定和修复中的应用。
附图说明
23.图1为实施例2所制备双仿生骨粘合剂的扫描电镜图像。
24.图2为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂的傅里叶红外光谱对比图。
25.图3为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂的机械性能对比图，其中，a. 拉
伸应力-应变曲线图，b. 拉伸强度，c. 拉伸杨氏模量，d. 压缩应力-应变曲线图，e. 压缩强度。f. 压缩杨氏模量。
26.图4为实施例2所制备双仿生骨粘合剂的粘附性能图，其中，a. 在各种基材表面的粘附行为。b. 在基材上的剥离过程。c. 水下粘附的能力。d. 猪皮肤组织粘附性的搭接剪切试验的应力-应变。e. 猪皮肤组织的平均搭接剪切强度。
27.图5为实施例2所制备双仿生骨粘合剂在模拟人体断裂股骨3d打印模型中的应用情况图。
28.图6为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂与nih/3t3细胞共培养1、3和7天的cck-8结果图。
29.图7为实施例2所制备双仿生骨粘合剂与nih/3t3细胞共培养1、3和7天的活/死染色图。
实施方式
30.一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂，其制备方法包括以下步骤：（1）将无水碳酸钠加入到煮沸的去离子水中，搅拌混匀，然后加入蚕丝脱胶5-120 min；清洗后5-100 ℃干燥1-50 h，产物用9 mol/l溴化锂溶液或以氯化钙/无水乙醇/水（摩尔比1:8:2）三元溶液溶解1-80 h，然后在去离子水中透析36-100 h；透析后的溶液经离心过滤得到质量浓度为0.1-50.0%的溶液s1；（2）将仿生海洋藤壶生物物质加入去离子水中，10-80 ℃搅拌5-72 h使其混合均匀，得到质量浓度为0.1-80.0%的溶液s2；（3）将氯化钙粉末加入去离子水中，在室温下搅拌1-120 min使其混合均匀，得到质量浓度为0.01-20.0%的溶液s3；（4）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，然后向其中加入镁粉，搅拌混合均匀，得到质量浓度为0.1-60.0%的仿生海洋贻贝生物物质-镁颗粒的混合溶液s4，其中镁粉的质量为0.001-10.0%；（5）在室温下，按溶液s1与溶液s2的体积比为1:1000-1000:1，溶液s1与溶液s3的体积比为1:1000-1000:1分别量取溶液s1、s2、s3，之后将溶液s1、s2、s3混合，再按混合液与混合溶液s4的体积比为1000:1-1:1000加入混合溶液s4，5-50 ℃充分搅拌混合1-180 min，即得到可注射双仿生骨粘合剂材料。
31.其中，所述仿生海洋藤壶生物物质为海藻酸钠、聚丙烯酸-羟基琥珀酰亚胺酯、聚天冬酰胺、trx-balcp19k融合蛋白、巯基化透明质酸和球蛋白中的一种或多种。
32.所述仿生海洋贻贝生物物质为酚羟基壳聚糖、多巴胺、单宁酸、没食子酸和酚羟基化丙氨酸中的一种或多种。
33.经过体内和体外实验证实，该材料不仅具有良好的细胞和血液生物相容性，而且集强湿态粘附和高力学性能优点于一体。在及时粘附固化以及高强硬度的支撑下，材料能够承受骨骼处的压力，并且与骨组织形成强结合力。此外，这种可替代骨钉、金属板的新一代复合型促进骨折愈合材料能够从技术层面解决因术后护理不当导致的感染坏死等并发症的问题，对固定骨折部位和诱导骨细胞再生具有积极作用。
34.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是
应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
实施例
35.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的丝素蛋白（sf）溶液；（2）将1.5 g海藻酸钠（sa）溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为3%的sa溶液；（3）将0.4 g氯化钙（cacl2）粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g单宁酸（ta）溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸-镁颗粒（ta-mg）溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
36.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
37.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；
（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.2 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为1%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
38.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将3 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为15%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
39.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入40 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
40.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入60 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
41.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:7:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
实施例
42.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将0.4 g cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；
（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，加入20 mg镁粉，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta-mg溶液；（5）在室温下，按体积比8:8:3:1将ta-mg溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到用于促进骨折愈合的可注射stsa-mg双仿生骨粘合剂材料。
43.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将2.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为5%的sa溶液；（3）将40 mg cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即stsa双仿生骨粘合剂材料。
44.（1）将8 g碳酸钠加入到煮沸的去离子水（5 l）中，搅拌混匀，加入15 g蚕丝脱胶处理20 min；产物用去离子水充分洗涤5次后，放于60 ℃烘箱中干燥6 h。之后将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入42 ml、9 mol/l溴化锂溶液中60 ℃溶解5 h，然后在去离子水中透析72 h；透析后的溶液经过滤离心，得到质量分数约为3%的sf溶液；（2）将1.5 g sa溶解于50 ml去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量分数为3%的sa溶液；（3）将40 mg cacl2粉末溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌10 min混匀，得到质量分数为2%的cacl2溶液；（4）将6 g ta溶解于20 ml去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的ta溶液；（5）在室温下，按体积比4:8:3:1将ta溶液加入到sf溶液、sa溶液、cacl2溶液的混合液中，充分搅拌混合，即得到stsa双仿生骨粘合剂材料。
45.对实施例和对比例制得的双仿生骨粘合剂进行力学性能测试，结果见表1。
46.表1 所制备双仿生骨粘合剂的拉伸/压缩力学强度和粘附强度测试结果
47.由表1可知：与实施例2相比，实施例1制得的材料湿态粘附不理想，这是由于随着sa的浓度降低导致侧链羧基含量降低，从而使材料去除界面水的能力随之降低；同时，由于sa也能够与ca
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以及mg
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产生金属-酚类配位键，所以导致实施例1材料的力学性能有所减弱。结果说明，sa的浓度对于材料的力学性能和粘附性能有很大影响。
48.与实施例2相比，实施例3制得的材料力学性能较弱，这是由于ca
2+
可以与ta和sa分别形成金属-酚类配位键和离子网络，有利于提高材料的力学性能，而ca
2+
含量的减少会导致材料力学性能减弱。由此证明，ca
2+
含量对于材料的力学性能也有一定影响。
49.与实施例2相比，实施例4-6所制得的材料力学性能都有所降低，且实施例5、6所得材料的粘附性能也有所减弱。这是由于ta与ca
2+
以及mg
2+
产生金属-酚类配位键，而实施例4中ta含量降低导致配位键减少，从而使上述材料的力学性能相对于实施例2略有降低。而镁颗粒的加入会与材料里的水分子形成mg
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和氢气，产生更多的气泡，导致材料内部结构坍塌，因而造成实施例5、6所得材料的粘附性能和力学性能均下降。
50.与实施例2相比，由于实施例7提高了sa的含量，制备出的材料力学性能显著下降，无法适应于骨折修复；而实施例8由于提高了ta-mg的含量，制备出的材料结构松散，硬度和粘附力下降，且由于加入ta比例过高使得材料的ph值下降，也不利于骨损伤修复和骨折区域愈合。
51.图1为实施例2所制备的stsa-mg双仿生骨粘合剂的扫描电镜图。通过高、低倍数下显微镜观察发现，所得stsa-mg双仿生骨粘合剂具有高度多孔的网络结构，这种结构有利于提高骨粘合剂的机械性能，而且能够为细胞提供生长增殖的支架，有利于加速修复过程。
52.图2为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂材料的傅里叶红外光谱分析。由谱图可见，stsa-mg双仿生骨粘合剂在1641 cm
−1的特征峰归属于sf中酰胺i带c=o的伸缩振动，这是由mg
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和ta之间金属-酚配位键与ta（邻苯二酚基团）和sf（酰胺基团）之间氢键的形成产生“竞争性交联”引发的结果，表明stsa-mg双仿生骨粘合剂的成功制备。
53.图3为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂的机械性能对比图。结果表明，加入镁颗粒后形成的stsa-mg双仿生骨粘合剂的拉伸和压缩强度都有所提高，这是由于引入的mg
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与ta和sa分别形成的金属-酚配位和离子键，提高了材料的力学性能。
54.图4为实施例2所制备双仿生骨粘合剂的粘附性能图。结果表明，stsa-mg双仿生骨粘合剂适用于各种湿态粘附场景：塑料、橡胶、金属、木头、玻璃、磁铁的表面以及在水流冲刷下的塑料和猪皮表面。猪皮肤粘附性的搭接剪切试验表明，stsa-mg双仿生骨粘合剂展现出优异的湿态粘附强度。以上结果表明，该材料能在体内液态环境中对骨组织实现强粘附。
55.图5为实施例2所制备的stsa-mg双仿生骨粘合剂在模拟人体断裂股骨3d打印模型中的应用情况图，即将stsa-mg双仿生骨粘合剂粘附在两根断裂的股骨之间进行固定，并对它进行约30 g的负载。结果表明，stsa-mg双仿生骨粘合剂能固定在骨断裂处并能承受一定的负载。
56.图6为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂与nih/3t3细胞共培养1、3和7天的cck-8结果图。由图中可见，各个材料组共培养的nih/3t3细胞在第3天、第7天均表现出良好的细胞增殖趋势，其中，stsa-mg仿生骨粘合剂组展现出更好的细胞增殖情况。
57.图7为实施例2和对比例1所制备双仿生骨粘合剂与nih/3t3细胞共培养1、3和7天的活/死染色图。其试验结果与cck-8定量结果一致，即stsa-mg骨粘合剂与nih/3t3细胞共培养后，大部分nih/3t3细胞染色结果呈绿色（活细胞），表明材料具有良好的生物相容性。
58.以上实施例说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
59.对所公开的实施例的上述说明，是本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将无水碳酸钠加入到煮沸的去离子水中，搅拌混匀，然后加入蚕丝进行脱胶；清洗干燥后，将产物溶解，然后在去离子水中进行透析；透析后的溶液经离心过滤得到溶液s1；（2）将仿生海洋藤壶生物物质加入去离子水中，在一定温度下搅拌混合均匀，得到溶液s2；（3）将氯化钙粉末加入去离子水中，在室温下搅拌混匀，得到溶液s3；（4）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，然后向其中加入镁粉，搅拌混合均匀，得到仿生海洋贻贝生物物质-镁颗粒的混合溶液s4；（5）在室温下，将溶液s1、s2、s3混合并加入混合溶液s4，充分搅拌混合，即得到所述可注射双仿生骨粘合剂。2. 根据权利要求1所述的一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述脱胶的时间为5-120 min；所得溶液s1的质量浓度为0.1-50.0%。3. 根据权利要求1所述的一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述仿生海洋藤壶生物物质为海藻酸钠、聚丙烯酸-羟基琥珀酰亚胺酯、聚天冬酰胺、trx-balcp19k融合蛋白、巯基化透明质酸和球蛋白中的一种或多种；所述搅拌的温度为10-80 ℃，时间为5-72 h；所得溶液s2的质量浓度为0.1-80.0%。4.根据权利要求1所述的一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所得溶液s3的质量浓度为0.01-20.0%。5.根据权利要求1所述的一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述仿生海洋贻贝生物物质为酚羟基壳聚糖、多巴胺、单宁酸、没食子酸和酚羟基化丙氨酸中的一种或多种；所得混合溶液s4的质量浓度为0.1-60.0%，其中所含镁粉的质量为0.001-10.0%。6.根据权利要求1所述的一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所用溶液s1与溶液s2的体积比为1:1000-1000:1；所述用溶液s1与溶液s3的体积比为1:1000-1000:1；所用混合溶液s4与溶液s1、s2、s3混合液的体积比为1:1000-1000:1。7.一种如权利要求1-6任一方法制备的用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂。

技术总结
本发明公开了一种用于促进骨折愈合的可注射双仿生骨粘合剂及其制备方法，属于生物材料制备领域。其是受海洋贻贝、藤壶水下粘附机理的启发，利用仿生海洋贻贝物质（如单宁酸）、仿生海洋藤壶物质（如海藻酸钠）、丝素蛋白、氯化钙和镁颗粒组成具有湿态粘附性的双仿生骨粘合剂。基于各组分之间形成的氢键、金属-酚配位键、静电相互作用以及β-sheet蛋白折叠构象，所得双仿生骨粘合剂不仅具有良好的生物相容性、优异的湿态粘附和匹配骨组织强度的力学性能，可用于骨折骨固定与修复，且具有原位成胶的能力，可直接在损伤处注射。本发明制备的粘合剂所使用的原料安全且来源广泛，因此，有望在骨损伤的固定和修复中实现潜在的临床应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：张进 宋文静 潘高星 郭瑾瑜 杨黄浩
受保护的技术使用者：清源创新实验室
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/7