一种可注射温敏性复合水凝胶及其在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用的制作方法

1.本发明属于组织工程及生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射温敏性复合水凝胶及其在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用。


背景技术：

2.利用注射的方法将生物材料或人工合成的生物相容性好的面部填充剂注射入真皮层或皮下减少皮肤褶皱，是目前广泛使用的整形美容方法。面部填充剂根据作用机理分为以下两类：一类面部填充剂用于直接增大组织体积从而达到扩增组织的目的；另一类面部填充剂在注射后一定时间内引起自体的免疫反应，从而长期诱导自体胶原蛋白的产生。
3.高分子微球填充具有降解速度可控，维持时间长，且高分子微球中可以负载相关促组织再生的生长因子，实现原位缓释促进组织生长的效果。然而单独使用聚乳酸等高分子微球刺激自体成纤维细胞形成胶原的填充剂，填充效果会因人而异，可能导致与预期效果差别过大，且注射后可能会由于材料在体内的降解，引起对细胞增殖不良的微环境，最终引起强烈的炎症反应，形成组织坏囊肿甚至组织坏死。此外，单独注射微球容易使得大量微球沉积，对周围组织产生刺激而导致局部炎症。
4.使用水凝胶材料实现高分子微球的包覆，同时提高注射液的粘度，可保证高分子微球在组织中均匀分布，可达到长期美容的效果。但是，目前采用常见的水凝胶材料如透明质酸、明胶作为水凝胶成分与高分子微球形成的填充剂体系不具有温度敏感性，注射后不能在组织中快速形成均匀的凝胶填充形态，且组织再生效果不佳。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可注射温敏性复合水凝胶及其在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用，本发明提供的可注射温敏性复合水凝胶能够在溶胶状态下保证高分子微球的预先均匀分散，可注射性良好，实现高分子微球的均匀注入，同时注射后迅速形成凝胶状态，完成高分子微球的均匀植入与填充；且生物相容性高，促进细胞的迁移生长，填充效果好。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种可注射温敏性复合水溶胶，包括有机物微球、动物组织脱细胞外基质和水溶液；所述有机物微球为左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；
8.所述有机物微球与所述动物组织脱细胞外基质的质量比为(0.1～10)：(2.5～40)；所述动物组织脱细胞外基质的质量和所述水溶液的体积之比为(2.5～40)g：(1～500)ml。
9.优选的，所述左旋聚乳酸微球的粒径为30～70μm。
10.优选的，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球为负载人脐带间充质干细胞分
泌物的左旋聚乳酸微球。
11.优选的，当所述有机物微球为左旋聚乳酸微球时，所述左旋聚乳酸微球的制备方法包括以下步骤：
12.将l-聚乳酸、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第一聚乙烯醇；
13.当所述有机物微球为负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球时，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的制备方法包括以下步骤：
14.将l-聚乳酸、干细胞分泌物、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第二聚乙烯醇。
15.优选的，所述第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇的重均分子量独立地为1～50万。
16.优选的，所述动物组织脱细胞外基质的制备方法包括以下步骤：
17.将动物皮肤、十二烷基硫酸钠和水混合，得到预处理动物组织基质，所述动物皮肤包括猪皮、牛皮和鱼皮中的一种或多种；
18.将所述预处理动物组织基质和dna酶溶液混合进行dna酶解反应，得到去除dna的动物组织基质；
19.将所述去除dna的动物组织基质和蛋白酶溶液混合进行蛋白酶解反应，得到所述动物组织脱细胞外基质。
20.优选的，所述dna酶溶液的质量浓度为0.01～0.1mg/ml，所述预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比为(0.5～5)g：(100～500)ml。
21.优选的，所述蛋白酶溶液为胃蛋白酶溶液，所述蛋白酶溶液的质量浓度为1～5mg/ml。所述去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比为(0.5～5)g：(100～1000)ml。
22.优选的，所述可注射温敏性复合水溶胶的凝胶温度为36.5～37.5℃。
23.本发明提供了上述技术方案所述的可注射温敏性复合水溶胶在制备面部塑形和/或修复的填充材料中的应用。
24.本发明提供了一种可注射温敏性复合水溶胶，包括有机物微球、动物组织脱细胞外基质和水溶液；所述有机物微球为左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；所述有机物微球与所述动物组织脱细胞外基质的质量比为(0.1～10)：(2.5～40)；所述动物组织脱细胞外基质的质量和所述水溶液的体积之比为(2.5～40)g：(1～500)ml。本发明以动物组织脱细胞外基质和水溶液形成的溶胶作为基质与左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球形成复合水溶胶，其中，动物组织脱细胞外基质具有三维网络的特点，与左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球相互配合形成的复合水溶胶，能够在溶胶状态下保证左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的预先均匀分散，可注射性良好，实现左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的均匀注入；且动物组织脱细胞外基质中由于存在胶原分子，溶胶具有温敏特性，且溶胶向凝胶转变的温度与人体的体温相似，注射后能够迅速形成凝胶状态，完成了高分子微球的均匀植入与填充，另一方面，动物组织脱细胞外基质具有机械强度高的特点，使凝胶态的填充物稳定性高是，使用时间长；同时，动物组织脱细胞外基质生化性能好，可以与皮下组织桥接联系，促进细胞的迁移生长，并初步稳定混悬的高分子微球位置；作为功能
填充物脱细胞外基质不仅为组织再生提供支撑结构，还具有调节再生细胞的功能。其次，脱细胞外基质可以在溶胶状态下保证高分子微球的预先均匀分散，实现注射后凝胶状态下高分子微球的均匀植入。最后，缓慢降解的高分子微球-脱细胞外基质复合水凝胶可达到长效填充效果。
附图说明
25.图1为本发明实施例1中所制备猪皮脱细胞外基质和猪皮原组织对比的扫描电子显微镜图；
26.图2为本发明实施例1中制备的猪皮脱细胞外基质溶胶的温敏性能分析；
27.图3为本发明实施例1中制备的左旋聚乳酸微球形貌分析；
28.图4为本发明实施例1中可制备的可注射温敏性复合水溶胶的温敏性能分析；
29.图5为本发明实施例1制备的猪皮脱细胞外基质与明胶和透明质酸在37℃条件下的实物对比图；
30.图6为本发明实施例1制备的可注射温敏性复合水溶胶的在动物皮下注射7天后的主要脏器切片对比图；
31.图7为本发明实施例1和实施例2制备的可注射温敏性复合水溶胶在动物皮下的填充效果；
32.图8为本发明实施例1和实施例2制备的可注射温敏性复合水溶胶在动物皮下注射7天后的cd31免疫荧光染色结果。
具体实施方式
33.本发明提供了一种可注射温敏性复合水溶胶，包括有机物微球、动物组织脱细胞外基质和水溶液；所述有机物微球为左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；
34.所述有机物微球与所述动物组织脱细胞外基质的质量比为(0.1～10)：(2.5～40)；所述动物组织脱细胞外基质的质量和所述水溶液的体积之比为(2.5～40)g：(1～500)ml。
35.在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
36.本发明提供的可注射温敏性复合水溶胶包括有机物微球。所述有机物微球为左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球。
37.在本发明中，所述左旋聚乳酸微球的粒径优选为30～70μm，更优选为35～65μm。
38.在本发明中，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的粒径优选为30～70μm，更优选为35～65μm。
39.在本发明中，所述左旋聚乳酸微球的制备方法优选包括以下步骤：将l-聚乳酸、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第一聚乙烯醇。在本发明中，所述极性溶剂优选为有机溶剂和水。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述第一聚乙烯醇的重均分子量优选为1～50万，更优选为10～40万，更优选为15～35万。在本发明中，所述l-聚乳酸和乳化剂的质量比
优选为(0.5～10)：(0.1～5)，更优选为(1～8)：(1～5)。在本发明中，所述l-聚乳酸、极性溶剂和乳化剂混合的步骤优选包括以下步骤：将l-聚乳酸溶解于部分极性溶剂中，得到l-聚乳酸溶液；将所述乳化剂溶解于剩余极性溶剂中，得到乳化剂溶液；将所述l-聚乳酸溶液和所述乳化剂溶液混合。在本发明中，所述部分极性溶剂为极性溶剂中的有机溶剂，所述剩余极性溶剂为极性溶剂中的水。所述l-聚乳酸溶液的质量浓度优选为1～10wt％，更优选为5wt％。所述乳化剂溶液的质量浓度优选为0.5～2wt％，更优选为1wt％。所述乳化的温度优选为室温，所述乳化的优选在高速剪切的条件下进行。在本发明中，所述高速剪切的转速优选为300～1000rpm，更优选为500～800rpm。在本发明中，所述乳化过程中，所述极性溶剂中的有机溶剂发生挥发去除。在本发明中，所述固液分离优选为过滤，本发明对所述过滤的具体实施方式没有特殊要求。
40.在本发明中，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球优选为负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球。
41.在本发明中，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的制备方法优选包括以下步骤：将l-聚乳酸、干细胞分泌物、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第二聚乙烯醇。在本发明中，所述极性溶剂优选为有机溶剂和水。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述干细胞分泌物优选为人脐带间充质干细胞分泌物。所述第二聚乙烯醇的重均分子量优选为1～50万，更优选为10～40万，更优选为15～35万。在本发明中，所述l-聚乳酸和乳化剂的质量比优选为(0.5～10)：(0.1～5)，更优选为(1～8)：(1～5)。所述l-聚乳酸和干细胞分泌物的质量比优选为1g：0.1mg。在本发明中，所述l-聚乳酸、干细胞分泌物、极性溶剂和乳化剂混合的步骤优选包括以下步骤：将l-聚乳酸和干细胞分泌物溶解于部分极性溶剂中，得到l-聚乳酸和干细胞分泌物溶液；将所述乳化剂溶解于剩余极性溶剂中，得到乳化剂溶液；将所述l-聚乳酸和干细胞分泌物溶液和所述乳化剂溶液混合。在本发明中，所述部分极性溶剂为极性溶剂中的有机溶剂，所述剩余极性溶剂为极性溶剂中的水。所述l-聚乳酸和干细胞分泌物溶液中l-聚乳酸的质量浓度优选为1～10wt％，更优选为5wt％。所述乳化剂溶液的质量浓度优选为0.5～2wt％，更优选为1wt％。所述乳化的温度优选为室温，所述乳化的优选在高速剪切的条件下进行。在本发明中，所述高速剪切的转速优选为300～1000rpm，更优选为500～800rpm。在本发明中，所述乳化过程中，所述极性溶剂中的有机溶剂发生挥发去除。在本发明中，所述固液分离优选为过滤，本发明对所述过滤的具体实施方式没有特殊要求。
42.本发明提供的可注射温敏性复合水溶胶包括动物组织脱细胞外基质。
43.在本发明中，所述动物组织脱细胞外基质的制备方法优选包括以下步骤：
44.将动物皮肤、十二烷基硫酸钠和水混合，得到预处理动物组织基质；
45.将所述预处理动物组织基质和dna酶溶液混合进行dna酶解反应，得到去除dna的动物组织基质；
46.将所述去除dna的动物组织基质和蛋白酶溶液混合进行蛋白酶解反应，得到所述动物组织脱细胞外基质。
47.本发明将动物皮肤、十二烷基硫酸钠和水混合，得到预处理动物组织基质。在本发明中，所述动物皮肤优选包括猪皮、牛皮和鱼皮中的一种或多种。在本发明中，所述动物皮
肤与十二烷基硫酸钠和水混合之前，本发明优选对所述动物皮肤进行前处理，在本发明中，所述前处理优选包括：依次进行切碎和洗涤。在本发明中，所述动物皮肤和十二烷基硫酸钠的质量比优选为(0.5～5)：(0.1～5)，更优选为(0.5～5)：(0.1～5)。在本发明中，所述十二烷基硫酸钠和水形成的溶液的质量百分含量优选为0.1～5wt％，优选为0.5～4wt％，进一步优选为1～3wt％。在本发明中，所述混合的温度优选为室温，所述混合的时间优选为12～72h。
48.在本发明中，所述十二烷基硫酸钠能够去除所述动物皮肤中的细胞膜。在本发明中，所述动物皮肤、十二烷基硫酸钠和水混合后得到预处理液，本发明优选对所述预处理液进行后处理，得到所述预处理动物组织基质。在本发明中，所述后处理优选包括：将所述预处理液依次进行固液分离和水洗。在本发明中，所述水洗优选去除所述固液分离得到的固相产物表面的十二烷基硫酸钠。
49.得到预处理动物组织基质后，本发明将所述预处理动物组织基质和dna酶溶液混合进行dna酶解反应，得到去除dna的动物组织基质。
50.在本发明中，所述dna酶溶液的质量浓度优选为0.01～0.1mg/ml，更优选为0.02～0.08mg/ml。所述预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比优选为(0.5～5)g：(100～500)ml，更优选为(1～4)g：(150～450)ml，进一步优选为(1.5～3)g：(200～400)ml。
51.在本发明中，所述dna酶解反应的温度优选为室温，所述dna酶解反应的时间优选为1～5h，更优选为2～4h。
52.在本发明中，所述dna酶解反应得到dna酶解反应液，本发明优选对所述dna酶解反应液进行后处理，得到所述去除dna的动物组织基质。在本发明中，所述后处理优选包括：将所述dna酶解反应液依次进行固液分离、水洗和干燥。在本发明中，所述水洗优选去除所述固液分离得到的固相产物表面的dna酶溶液。在本发明中，所述干燥优选为冻干。
53.得到去除dna的动物组织基质后，本发明将所述去除dna的动物组织基质和蛋白酶溶液混合进行蛋白酶解反应，得到所述动物组织脱细胞外基质。
54.在本发明中，所述蛋白酶溶液优选为胃蛋白酶溶液，所述蛋白酶溶液的质量浓度优选为1～5mg/ml，更优选为1.5～4mg/ml。所述去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比优选为(0.5～5)g：(100～1000)ml，更优选为(1～4)g：(150～900)ml。
55.在本发明中，所述蛋白酶解反应的温度优选为室温，所述蛋白酶解反应的时间优选为24～72h，更优选为34～36h。
56.在本发明中，所述蛋白酶解反应得到蛋白酶解反应液，本发明优选对所述蛋白酶解反应液进行后处理，得到所述动物组织脱细胞外基质。在本发明中，所述后处理优选包括：将所述蛋白酶解反应液依次进行固液分离、水洗和干燥。在本发明中，所述水洗优选去除所述固液分离得到的固相产物表面的蛋白酶溶液。在本发明中，所述干燥优选为冻干。
57.本发明提供了的可注射温敏性复合水溶胶包括水溶液。
58.在本发明中，所述水溶液具体优选为磷酸盐缓冲溶液。所述磷酸盐缓冲溶液的ph值优选为7.2～7.4。
59.在本发明中，所述有机微球与所述动物组织脱细胞外基质的质量比优选为(0.1～10)：(2.5～40)，更优选为(0.5～8)：(3～35)，进一步优选为(1～7)：(5～30)。
60.在本发明中，所述动物组织脱细胞外基质的质量和所述水溶液体积之比优选为(2.5～40)g：(1～500)ml，更优选为(3～35)g：(10～450)ml。
61.在本发明中，所述可注射温敏性复合水溶胶的凝胶温度为36.5～37.5℃。
62.本发明提供了上述技术方案所述的可注射温敏性复合水溶胶的制备方法，包括以下步骤：
63.将所述动物组织脱细胞外基质溶解于所述水溶液中，得到动物组织脱细胞外基质水溶胶；在本发明中，所述溶解优选在室温条件下进行。
64.将所述动物组织脱细胞外基质水溶胶和所述有机微球混合，得到所述可注射温敏性复合水溶胶。在本发明中，所述混合优选在室温条件下进行。
65.本发明提供了上述技术方案所述的可注射温敏性复合水溶胶在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用。
66.在本发明中，所述塑形和/或修复的填充材料优选为面部塑形和/或修复的填充材料。
67.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
68.实施例1
69.1)将新鲜猪皮(图1的左图所示)切割为1mm
×
1mm大小的小块组织，多次清洗；将切块的小块猪皮组织置于烧杯中，加入2wt％的十二烷基硫酸钠水溶液(其中，小块猪皮组织和十二烷基硫酸钠的质量比为0.5：0.1，连续搅拌一段时间，获得去除细胞膜成分的预处理液，过滤后水洗，得到预处理动物组织基质；在预处理动物组织基质中加入0.01mg/ml的dna酶溶液，其中预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比为0.5g：100ml，去除组织中存在的dna成分，过滤后反复清洗获得去除dna的动物组织基质，冻干保存；将冻干的去除dna的动物组织基质加入1.5mg/ml的胃蛋白酶溶液处理，其中，去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比为0.5g：100ml，去除组织中存在的蛋白成分，过滤后反复清洗，冻干得到猪皮脱细胞外基质(图1的右图所示)，低温存放；
70.2)将称量好的l-聚乳酸加入二氯甲烷，得到l-聚乳酸溶液(质量浓度为5wt％)，溶解充分后倒入重均分子量为20万的聚乙烯醇的水溶液(质量浓度为1wt％)中，其中l-聚乳酸和聚乙烯醇的质量比为0.5：0.1；高速剪切并挥发二氯甲烷，通过滤网过滤后可获得粒径大小均一，结构稳定的左旋聚乳酸微球；
71.3)将25mg冻干的猪皮脱细胞外基质称量，溶解于1.25ml磷酸盐缓冲液中，得到20mg/ml的猪皮脱细胞外基质水溶胶(decm)，低温存放；称取5mg的聚乳酸微球加入到猪皮脱细胞外基质水溶胶中，左旋聚乳酸微球和猪皮脱细胞外基质水溶胶的质量比1：5，均匀混合后获得可注温敏性复合水凝胶(记为plla+decm)。
72.图1为按照实施例1中所制备猪皮脱细胞外基质相比于猪皮原组织的结构、成分分析。猪皮脱细胞外基质呈现较为典型的纤维网状结构，组织连接较为松散。
73.图2为按照实例1方法制备得到的温敏猪皮脱细胞外基质水溶胶(decm)，左图为猪皮脱细胞外基质溶胶，右图为将猪皮脱细胞外基质溶胶在37℃孵育15min后，获得猪皮脱细胞外基质水凝胶。
74.图3是按照实例1方法制备得到的聚乳酸微球形貌，微球大小均一，粒径大小约为
30～70μm。
75.图4为按照实例1方法制备得到的可注射温敏性水溶胶，左图为猪皮脱细胞外基质-聚乳酸微球复合溶胶，右图为将猪皮脱细胞外基质-聚乳酸微球复合溶胶在37℃孵育15min后，获得猪皮脱细胞外基质-聚乳酸微球复合凝胶。
76.图5为本发明实施例1制备的猪皮脱细胞外基质(猪皮脱细胞外基质水溶胶decm)与明胶水溶胶和透明质酸水溶胶在37℃条件下的实物对比图。
77.图6为本发明实施例1制备的可注射温敏性复合水溶胶(plla+decm)的在大鼠皮下注射7天后的主要脏器切片对比图；由图6可以得出实施例1制备的可注温敏性复合水凝胶(plla+decm)在动物皮下注射7天后，相比于无plla微球注射组(decm组)，细胞浸润较多，填充结构稳定并且组织再生效果显著。
78.实施例2
79.1)将新鲜猪皮切割为1mm
×
1mm大小的小块组织，多次清洗；将切块的小块猪皮组织置于烧杯中，加入2wt％的十二烷基硫酸钠水溶液(其中，小块猪皮组织和十二烷基硫酸钠的质量比为0.5：0.1，连续搅拌一段时间，获得去除细胞膜成分的预处理液，过滤后水洗，得到预处理动物组织基质；在预处理动物组织基质中加入0.01mg/ml的dna酶溶液，其中预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比为0.5g：100ml，去除组织中存在的dna成分，过滤后反复清洗获得去除dna的动物组织基质，冻干保存；将冻干的去除dna的动物组织基质加入1.5mg/ml的胃蛋白酶溶液处理，其中，去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比为0.5g：100ml，去除组织中存在的蛋白成分，过滤后反复清洗，冻干得到猪皮脱细胞外基质，低温存放；
80.2)将称量好的左旋聚乳酸微球以及人脐带间充质干细胞分泌物(gfs)加入二氯甲烷，l-聚乳酸与人脐带间充质干细胞分泌物(gfs)的质量比为1g：0.1mg，得到l-聚乳酸和干细胞分泌物溶液溶液(l-聚乳酸质量浓度为5wt％)，溶解充分后倒入重均分子量为20万的聚乙烯醇的水溶液(质量浓度为1wt％)中，其中l-聚乳酸和聚乙烯醇的质量比为0.5：0.1；高速剪切并挥发二氯甲烷，通过滤网过滤后得到负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球(gfs-plla)。
81.3)将25mg冻干的猪皮脱细胞外基质称量，溶解于1.25ml磷酸盐缓冲液中，得到20mg/ml的猪皮脱细胞外基质水溶胶(decm)，低温存放；
82.将5mg的负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球加入到猪皮脱细胞外基质水溶胶中，负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球和猪皮脱细胞外基质水溶胶的质量比1：5，均匀混合后获得负载人脐带间充质干细胞分泌物的可注温敏性复合水凝胶(记为gfs-plla+decm)。
83.图7为本发明实施例1和实施例2制备的可注射温敏性复合水溶胶在小鼠皮下的填充效果；图7中的pbs表示1
×
磷酸盐缓冲液，图7中的plla表示实施例1制备的左旋聚乳酸微球在磷酸盐缓冲液中的形成的溶胶(具体制备方法为：将5mg的左旋聚乳酸微球加入1.25ml磷酸盐缓冲液中)，图7中的gfs-plla为实施例2制备的负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球在磷酸盐缓冲液中的形成的溶胶(具体制备方法为：将5mg的负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球加入1.25ml磷酸盐缓冲液中)，decm为猪皮脱细胞外基质水凝胶，plla+decm为实施例1制备的可注温敏性复合水凝胶，gfs-plla+decm为实施例
2制备的负载人脐带间充质干细胞分泌物的可注温敏性复合水凝胶。由图7可以得出：相比无gfs的组别(实施例1中plla+decm)，添加gfs的可注射复合水凝胶能够稳定的实现细胞浸润和组织生长，有利于面部和/或组织修复。
84.图8为实施例1和实施例2制备的可注射温敏性复合水溶胶在小鼠皮下注射诱导宿主血管生成效果对比图。图8中的plla表示实施例1制备的左旋聚乳酸微球在磷酸盐缓冲液中的形成的溶胶(具体制备方法为：将5mg的左旋聚乳酸微球加入1.25ml磷酸盐缓冲液中)，图8中的gfs-plla为实施例2制备的负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球在磷酸盐缓冲液中的形成的溶胶(具体制备方法为：将5mg的负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球加入1.25ml磷酸盐缓冲液中)，decm为猪皮脱细胞外基质水凝胶，plla+decm为实施例1制备的可注温敏性复合水凝胶，gfs-plla+decm为实施例2制备的负载人脐带间充质干细胞分泌物的可注温敏性复合水凝胶。由图8中：实施例1制备的可注温敏性复合水凝胶在小鼠皮下注射7天后的cd31免疫荧光染色结果显示，与单纯的decm组凝胶类似，实施例1所制备的复合水凝胶仍然具有诱导宿主血管生成的作用。实施例2制备的负载人脐带间充质干细胞分泌物的可注温敏性复合水凝胶(记为gfs-plla+decm)在小鼠皮下注射7天后的cd31免疫荧光染色，与单纯的decm组凝胶类似，所制备的复合水凝胶仍然具有诱导宿主血管生成的作用。
85.实施例3
86.1)将新鲜牛皮切割为1mm
×
1mm大小的小块组织，多次清洗；将切块的小块牛皮组织置于烧杯中，加入2wt％的十二烷基硫酸钠水溶液(其中，小块猪皮组织和十二烷基硫酸钠的质量比为5：2，连续搅拌一段时间，获得去除细胞膜成分的预处理液过滤后水洗，得到预处理动物组织基质；在预处理动物组织基质中加入0.1mg/ml的dna酶溶液，其中预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比为5g：500ml，去除组织中存在的dna成分，过滤后反复清洗获得去除dna的动物组织基质，冻干保存；将冻干的去除dna的动物组织基质加入1.5mg/ml的胃蛋白酶处理，其中，去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比为5g：1000ml，去除组织中存在的蛋白成分，过滤后反复清洗，冻干得到猪皮脱细胞外基质，低温存放；
87.2)将称量好的l-聚乳酸加入二氯甲烷，得到l-聚乳酸溶液(质量浓度为5wt％)中，溶解充分后倒入分子量为20万的聚乙烯醇的水溶液(质量浓度为1wt％)中，其中l-聚乳酸和聚乙烯醇的质量比为5：2，高速剪切并挥发二氯甲烷，获得粒径大小均一，结构稳定的聚乳酸微球；
88.3)将25mg冻干的牛皮脱细胞外基质材料称量，溶解于1.25ml磷酸盐缓冲液中，得到20mg/ml的猪皮脱细胞外基质水胶液，低温存放；称取5mg的聚乳酸微球加入到猪皮脱细胞外基质水溶胶液中，均匀混合后获得可注射面部塑形修复填充的温敏性复合水凝胶。
89.实施例4
90.1)猪皮脱细胞外基质制备方法同应用实例1；
91.2)将l-聚乳酸加入二氯甲烷，得到l-聚乳酸溶液(质量浓度为5wt％)中，高速剪切形成初乳，乳化充分后倒入重均分子量为20万的聚乙烯醇的水溶液(质量浓度为1wt％)中，其中l-聚乳酸和聚乙烯醇的质量比为3：1；高速剪切并挥发二氯甲烷，通过滤网过滤后可获得粒径大小均一，结构稳定的左旋聚乳酸微球；
92.3)将冻干的猪皮组织脱细胞外基质材料称量，溶解于磷酸盐缓冲液中，得到5mg/ml的脱细胞外基质溶胶液，低温存放；称取3mg聚乳酸微球加入到上述猪皮脱细胞外基质溶胶中，左旋聚乳酸微球和猪皮脱细胞外基质水溶胶的质量比1：5，均匀混合后获得可注射温敏性复合水凝胶。
93.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，包括有机物微球、动物组织脱细胞外基质和水溶液；所述有机物微球为左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；所述有机物微球与所述动物组织脱细胞外基质的质量比为(0.1～10)：(2.5～40)；所述动物组织脱细胞外基质的质量和所述水溶液的体积之比为(2.5～40)g：(1～500)ml。2.根据权利要求1所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述左旋聚乳酸微球的粒径为30～70μm。3.根据权利要求1或2所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球为负载人脐带间充质干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球。4.根据权利要求1或2所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，当所述有机物微球为左旋聚乳酸微球时，所述左旋聚乳酸微球的制备方法包括以下步骤：将l-聚乳酸、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第一聚乙烯醇；当所述有机物微球为负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球时，所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球的制备方法包括以下步骤：将l-聚乳酸、干细胞分泌物、极性溶剂和乳化剂混合，得到的混合溶液进行乳化后固液分离，得到所述负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球；所述乳化剂为第二聚乙烯醇。5.根据权利要求4所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇的重均分子量独立地为1～50万。6.根据权利要求1所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述动物组织脱细胞外基质的制备方法包括以下步骤：将动物皮肤、十二烷基硫酸钠和水混合，得到预处理动物组织基质，所述动物皮肤包括猪皮、牛皮和鱼皮中的一种或多种；将所述预处理动物组织基质和dna酶溶液混合进行dna酶解反应，得到去除dna的动物组织基质；将所述去除dna的动物组织基质和蛋白酶溶液混合进行蛋白酶解反应，得到所述动物组织脱细胞外基质。7.根据权利要求6所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述dna酶溶液的质量浓度为0.01～0.1mg/ml，所述预处理动物组织基质的质量和所述dna酶溶液的体积之比为(0.5～5)g：(100～500)ml。8.根据权利要求6所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述蛋白酶溶液为胃蛋白酶溶液，所述蛋白酶溶液的质量浓度为1～5mg/ml。所述去除dna的动物组织基质的质量和所述蛋白酶溶液的体积之比为(0.5～5)g：(100～1000)ml。9.根据权利要求1所述的可注射温敏性复合水溶胶，其特征在于，所述可注射温敏性复合水溶胶的凝胶温度为36.5～37.5℃。10.权利要求1～9任一项所述的可注射温敏性复合水溶胶在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用。

技术总结
本发明属于组织工程及生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射温敏性复合水凝胶及其在制备塑形和/或修复的填充材料中的应用。本发明提供的可注射温敏性复合水溶胶，包括左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球、动物组织脱细胞外基质和水溶液；左旋聚乳酸微球或者负载干细胞分泌物的左旋聚乳酸微球与动物组织脱细胞外基质的质量比为(0.1～10)：(2.5～40)。本发明能够在溶胶状态下保证左旋聚乳酸微球的预先均匀分散，可注射性良好，实现左旋聚乳酸微球的均匀注入；且本发明形成的溶胶具有温敏特性，且溶胶向凝胶转变的温度与人体的体温相似，注射后能够迅速形成凝胶状态，完成了高分子微球的均匀植入与填充。充。充。


技术研发人员：徐沛瑶 林涛
受保护的技术使用者：鑫华微（厦门）生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/9