倍半萜内酯类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用

1.本技术涉及生物医药技术领域，具体涉及倍半萜内酯类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。


背景技术：

2.白花地胆草(elephantopus mollis h.b.k.)，也叫牛舌草，归属于桔梗目菊科地胆草属植物，多见于我国广东省，福建省，以及海南省等沿海一带，具有抗菌消炎、清热解毒的功效，常用于腹痛、痢疾、跌打损伤等用药。
3.em-6是从白花地胆草中的提取鉴定的新型倍半萜内酯类化合物，化学分子式为c
19h22
o6，命名为elephanpene a，前期研究发现，乳腺癌细胞mda-mb-231、mda-mb-468都表现出较好的细胞活力抑制作用。但目前并没有关于em-6治疗肝癌的研究报道，其抗肝癌作用分子机制尚不明确。
4.另一方面，肝癌细胞对单一或者联合化疗药物产生耐药性，会导致肝癌的反复发生。对此，找到一种毒副作用小的新药物或者可以增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的新药物对于肝癌的临床治疗具有重大意义。


技术实现要素：

5.本技术旨在提供倍半萜内酯类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本技术的第一方面，提供倍半萜内酯类化合物在制备治疗或辅助治疗肝癌的药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：
[0008][0009]
本技术的第二方面，提供倍半萜内酯类化合物在制备抑制肝癌细胞增殖药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。
[0010]
本技术的第三方面，提供倍半萜内酯类化合物在制备用于阻滞细胞周期于s期、诱导细胞凋亡的阻滞剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。
[0011]
本技术的第四方面，提供倍半萜内酯类化合物在制备抗肝癌增效剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。
[0012]
本技术的第五方面，提供倍半萜内酯类化合物在制备抗肝癌耐药逆转剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。
[0013]
本技术的第六方面，提供倍半萜内酯类化合物与巴佛洛霉素a1(bafa1)联用在制备治疗或辅助治疗肝癌的药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。
[0014]
本技术还提出一种用于治疗肝癌的药物组合物，包括：式(i)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药分子。
[0015]
所述“药学上可接受的盐”为通式(i)化合物与无机酸或有机酸反应形成的常规的无毒盐。例如，所述常规的无毒盐可通过通式(i)化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，以及所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者通式(i)化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式(i)化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者通式(i)化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸和乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
[0016]
进一步具体地说，上述技术方案中，其剂型选自：注射剂、片剂、胶囊、试剂盒或贴剂。本领域技术人员可以根据具体情况将上述药物组合物制备成各种剂型，该制备方法为本领域的公知技术，因此本技术不作赘述。
[0017]
与现有技术相比，本技术实施例具有以下有益效果：
[0018]
1、发明人首先通过mtt实验发现，em-6对正常肝上皮细胞系lo2以及正常支气管上皮样细胞hbe的毒性均比较小，并且em-6显著抑制肝癌细胞系的细胞活力，其中以对huh-7细胞活力抑制程度最高，48h的ic
50
仅为1.83
±
0.306μm。同等浓度下，em-6对huh-7细胞活力的抑制程度比常规化疗药物顺铂要显著得多。
[0019]
2、em-6可以诱导huh-7细胞线粒体膜电位损伤，导致ros积累，并诱导s期阻滞和细胞凋亡。
[0020]
3、em-6可以激活ros/mapk通路，诱导huh-7细胞凋亡；且em-6联合nac共同处理后，p-jnk、p-p38的表达水平较em-6单独处理组显著减少，而p-erk表达改变不大。
[0021]
4、em-6可以通过阻断自噬，联合巴佛洛霉素a1(bafa1)促进细胞凋亡。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]
图1为em-6的高分辨电喷雾质谱图；
[0024]
图2为em-6的高效液相色谱图；
[0025]
图3为em-6对人肝癌细胞的抑制作用，a、b：mtt法检测结果；c、用em-6或cddp处理huh-7细胞48h，mtt法检测细胞活力；d和e为用edu法(d)和克隆形成法(e)检测em-6对huh-7细胞的增殖抑制作用；f、kegg和go富集分析来自rna-seq结果；
[0026]
图4为em-6诱导huh-7细胞s期阻滞和凋亡；
[0027]
图5为em-6诱导huh-7线粒体膜电位降低和细胞内ros积累；
[0028]
图6为em-6通过ros诱导huh-7细胞s期阻滞；
[0029]
图7为em-6通过ros诱导huh-7细胞凋亡；
[0030]
图8为em-6通过ros激活mapk信号通路；
[0031]
图9为em-6通过激活jnk、p38通路诱导细胞凋亡；
[0032]
图10为em-6阻断huh-7细胞自噬通量。
具体实施方式
[0033]
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0034]
单体em-6是一种从传统中草药白花地胆草中提取的新型倍半萜内酯类化合物，其化学分子式为c
19h22
o6，共9个不饱和度，分子量为346.37。em-6的化学结构式如式(i)所示，图1为em-6的高分辨电喷雾质谱图(hr-esi-msm/z:369.1309[m+na]+(calcdforc
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o6na,369.1309))。如图2所示，em-6高效液相色谱结果(hplc；ch3oh:h2o:ch3cooh,75:25:0.01,1421.46psi,25.22℃,210nm)中，单体em-6提取物仅在13.456min处有一个强吸收峰，表明em-6纯度达到95％以上。em-6母液使用dmso配制，浓度为100mm，分装并放于-80℃保存。
[0035][0036]
1.实验材料与方法
[0037]
细胞株：人肝癌细胞株hepg2、bel-7402、huh-7、smmc-7721、mhcc97-h以及人正常肝上皮细胞株lo2和人正常支气管上皮样细胞株hbe均购买自美国模式培养物集存库(american type culture collecti on,atcc)。
[0038]
方法：mtt实验检测em-6对肝癌细胞活力的影响以及对人正常细胞的毒性作用。edu和细胞克隆形成实验检测em-6对人肝癌细胞huh-7增殖能力的影响；rna-seq以及kegg_pathway和go分析检测em-6处理后，huh-7细胞中显著改变的生物学过程及相关信号通路。流式细胞术及免疫印迹检测em-6对细胞周期、凋亡以及mapk通路的影响。免疫荧光以及流
式细胞术检测细胞线粒体膜电位以及胞内ros水平的变化。免疫印迹、免疫荧光。
[0039]
mtt实验：(1)实验设计调零组，对照组以及加药组。调零组中只加培养基。加药组加入培养基、细胞以及实验用药。对照组加入最大药物浓度组的dmso体积。每组设置5个复孔。
[0040]
(2)细胞培养至对数生长期时，用含0.25％edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，含10％ fbs的培养基终止消化并吹打成单细胞悬液。再经过800rpm，低速离心3min收集细胞。培养液重悬细胞后计算细胞密度，按每孔4000-6000个细胞的密度，将100μl细胞悬液种进96孔板中，然后继续培养贴壁过夜。孔板外周圈用200μl 1
×
pbs填满，减少培养液蒸发。
[0041]
(3)采用倍比稀释法，将药物稀释至实验用浓度的两倍。加入100μl药物到细胞中，使得药物浓度稀释一倍至实验工作浓度。培养48h后，调零组、对照组以及实验组的每孔都加入20μl mtt溶液(5mg/ml)，然后继续培养4-6h。用真空抽吸泵吸尽培养基与mtt的混合液，然后每孔加入150μl dmso溶液，低速震荡10min。甲瓒蓝紫色结晶充分溶解后，使用多功能酶标仪检测570nm的吸光度，通过计算每组的平均吸光度值，计算每组的细胞的存活率。
[0042]
(4)细胞存活率(％)＝(实验组平均吸光度值-调零组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值-调零组平均吸光度值)
×
100％。使用ibm sps s statistics 20计算ic
50
(mean
±
sd)并使用graphpad prism 7.0作图。
[0043]
细胞增殖检测—edu法：(1)细胞培养至对数生长期时，消化后离心收集细胞，计数后按每孔5000细胞的密度，将100μl细胞悬液种入96孔板，每组设置3个复孔，继续培养过夜。
[0044]
(2)细胞贴壁后，吸去培养基，每孔再加入不同浓度的em-6，进行药物处理继续培养24h。
[0045]
(3)吸去培养基后，加入100μl含有10μm edu工作液的新鲜培养基继续孵育2.5h。
[0046]
(4)吸去edu标记液后，加入100μl 4％多聚甲醛固定20min，去除固定液后，加入100μl 2μg/μl的甘氨酸溶液继续室温孵育5min，除去残留的4％多聚甲醛。
[0047]
(5)吸除甘氨酸溶液，加入100μl 3％ bsa溶液洗涤1-2次，然后加入100μl 0.5％ triton x-100，室温孵育15min。
[0048]
(6)吸去0.5％ triton x-100，并用3％ bsa洗涤细胞1-2次，然后加入100μl按试剂说明书配制的click-it反应混合物，室温避光孵育30min。
[0049]
(7)去除反应混合物，每孔加入100μl 1
×
pbs洗涤1-2次，并加入100μl5μg/ml hochest33342溶液，室温避光孵育15min。然后用100μl1
×
pbs洗涤1-2次，加入50μl抗荧光淬灭剂。
[0050]
(8)在倒置荧光显微镜下进行拍照分析。kfluor488:ex/em＝495n m/519nm，绿色荧光。hoechst33342:ex/em＝350nm/461nm，蓝色荧光。
[0051]
细胞活性氧检测:(1)细胞培养至对数生长期时，消化后离心收集细胞，计数后6孔板中每孔种下3
×
105细胞，继续培养过夜。
[0052]
(2)细胞贴壁后，吸去培养基，每孔再加入不同浓度的em-6(0,2,4μm)继续培养24h。活性氧对照rosup仅在阳性对照孔中加入，dcfh-da探针孵育前30min加入rosup处理细胞，rosup 1:1000稀释使用。
[0053]
(3)将细胞培养液上清全部吸尽，加入预冷1
×
pbs清洗一遍，然后加入预先用无血
清培养基稀释好的含dcfh-da探针的培养液，放入37℃培养箱孵育1h。
[0054]
(4)将(3)中的含有dcfh-da探针的培养基吸尽，1
×
pbs洗一遍后，用不含edta的胰酶消化收集细胞，离心后再用无血清培养基重悬细胞，准备流式上机。dcf,ex/em＝488nm/525nm。
[0055]
qrt-pcr及rna测序：
[0056]
(1)总rna提取—trizol法
[0057]
药物作用于细胞24h后，吸除培养基上清，并用预冷1
×
pbs清洗两遍。
[0058]
于生物安全柜中，按6孔板每个孔加入1ml trizol裂解细胞。静置5min左右，转移至1.5ml无酶离心管中，然后提前打开高速冷冻离心机进行预冷。
[0059]
按trizol:氯仿＝5:1的比例，再加入200μl氯仿。涡旋仪剧烈振荡15s后，再次静置3min，观察到液相分层后，使用高速冷冻离心机，进行4℃，以不超过12000g/min的速度离心15min。
[0060]
离心结束后，转移上层水相至新的无酶微量离心管中，按trizol:异丙醇＝2:1加入500μl异丙醇，继续4℃，以不超过12000g/min的速度离心10min。
[0061]
观察到管底有白色沉淀后，弃上清，加入1ml用depc水配制的75％乙醇清洗沉淀，继续4℃，不超过7500g/min的速度离心5min，重复清洗两次。
[0062]
吸尽75％乙醇，并打开离心管盖口，倒置于37℃干燥箱，使得75％乙醇挥发完全。待观察到白色沉淀即将变透明时，加入无酶水溶解rna沉淀。使用nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测rna的浓度及纯度。
[0063]
(2)rna测序
[0064]
huh-7细胞用或者不用em-6(2μm)处理24h，实验组与对照组各3个生物学重复，收集细胞提取细胞总rna，送至华大基因通过测序平台bgiseq-500进行rna测序。
[0065]
(3)逆转录pcr
[0066]
去除基因组dna：混匀后，42℃孵育2min；其中总rna1μg、4*gdnawipermix各4μl，rnase-free ddh2o加至20μl。
[0067]
rt-pcr反应：共20μl体系，混匀后，50℃孵育15min,85℃孵育5sec。其中5
×
hiscriptii qrt supermixii各4μl，去除基因组dna中的反应液16μl。
[0068]
(4)实时荧光定量
[0069]
pcr预混液体系：20μl。每个处理样本检测的基因各设置3个复孔，cdna模板来自逆转体系的产物，稀释十倍使用。
[0070]
表1实时荧光定量的试剂体积
[0071]
[0072][0073]
qpcr程序：三步法
[0074]
预变性：95℃10min；扩增(40个循环)：变性：95℃15sec,退火：60℃30sec,延伸：72℃30sec；溶解曲线：95℃15sec,60℃1mi n,95℃15sec。引物均由北京tsingke合成。
[0075]
细胞凋亡与细胞周期检测：
[0076]
(1)pi单染色检测细胞周期
[0077]
细胞培养至对数生长期时，消化后离心收集细胞，计数后在6cm细胞培养皿中种下8.0
×
105细胞，继续培养过夜。
[0078]
细胞贴壁后，吸去培养基，加入不同浓度的em-6(0,1,2,4μm)，进行药物处理继续培养48h。活性氧清除剂nac(5mm)预先处理1h。
[0079]
药物处理结束后，去除上清培养液，预冷的1
×
pbs清洗两遍后，用不含edta的胰酶消化收集细胞。再向细胞沉淀中，先加入300μl 1
×
pbs重悬细胞，然后迅速滴加700μl预冷无水乙醇，边滴加，边振荡，4℃静置过夜。
[0080]
轻轻吹打重悬细胞，再通过830g/min的转速，离心3min收集细胞。去除固定液后，再加入1ml1
×
pbs重悬清洗细胞，离心收集细胞后，再清洗细胞一次。清洗完后，按rnase:pi＝1:9的比例，每个样本加入200μl染色液，室温静置，避光孵育30min。孵育结束后，用74μm细胞筛网过滤细胞悬液，使其成为单细胞悬液，然后通过流式分析仪检测样本的细胞周期分布情况。
[0081]
(2)annexin v-fitc/pi双染色检测细胞凋亡
[0082]
细胞培养至对数生长期时，消化后离心收集细胞，计数后在6孔板中每孔种下3.0
×
105细胞，继续培养过夜。
[0083]
细胞贴壁后，吸去培养基，加入不同浓度的em-6(0,1,2,4μm)，进行em-6处理继续培养48h。其中jnk抑制剂sp600125(20μm)、p38抑制剂sb203580(15μm)、erk抑制剂trametinib(25μm)预处理8h以及活性氧清除剂nac(5mm)预处理1h。
[0084]
用不含edta的胰酶消化收集细胞，避免edta与annexin v结合产生假阳性。细胞经预冷1
×
pbs清洗两遍后，向样本中先加入300μl bind buffer重悬细胞，然后加入3μl annexin v-fitc，混匀后室温避光孵育15min。pi染色：加入3μlpi染色液，轻轻吹打混匀细胞，室温避光孵育15min。然后通过流式分析仪检测样本的凋亡情况。
[0085]
线粒体膜电位检测:(1)细胞培养至对数生长期时，消化后离心收集细胞，计数后在6孔板中每孔种下3.0
×
105细胞，继续培养过夜。
[0086]
(2)细胞贴壁后，加入不同浓度的em-6(2,4μm)，进行药物处理继续培养24h。线粒体质子载体解偶联剂cccp(10μm)作为阳性对照，预处理20min。
[0087]
(3)吸除培养液，用预冷1
×
pbs清洗两遍，然后加入1ml jc-1染色液，放置co2培养箱，37℃孵育15min。结束后，吸除jc-1染液，用1
×
incubation buffer润洗两次，加入1ml细胞培养液，倒置荧光显微镜镜下分析红绿平均荧光强度比例。
[0088]
active caspase-3检测：(1)取对数生长期细胞，消化后离心收集细胞，计数后在6孔板中每孔种下3.0
×
105细胞，继续培养过夜。
[0089]
(2)细胞贴壁后，吸去培养基，加入不同浓度的em-6(0,1,2,4μm)，进行药物处理培
养48h。jnk抑制剂sp600125(20μm)、p38抑制剂sb203580(15μm)和erk抑制剂trametinib(25μm)预处理8h以及活性氧清除剂nac(5mm)预处理1h。
[0090]
(3)收集细胞后，用预冷1
×
pbs清洗两遍，然后用500μl bd cytofix/cytoperm solution重悬，并冰浴20min。
[0091]
(4)1000rpm离心4min收集细胞沉淀，然后用bd perm/wash buffer(1
×
)清洗两次，每个样本再加入100μl active caspase3 antibody与bd perm/wash buffer(1
×
)的预混液(antibody:wash buffer＝1:5)，室温避光孵育30min。
[0092]
(5)染色结束后，1000rpm离心4min，除去多余的抗体，并用bd perm/wash buffer(1
×
)清洗两次，最后用100μl 1
×
pbs重悬细胞，然后上流式检测。
[0093]
免疫荧光:(1)将玻底培养皿加入2ml培养液，再放入细胞培养箱中预平衡15min。然后种入1.5
×
105状态良好的细胞，加入1ml培养液摇匀后，培养过夜。然后加入不同浓度em-6(0,1,2,4μm)处理24h。
[0094]
(2)吸除培养液后，用预冷1
×
pbs清洗两次，每次洗3min。加入200μl4％多聚甲醛，固定细胞10min。
[0095]
(3)吸除4％多聚甲醛，用预冷1
×
pbs清洗两次，每次洗3min，然后加入0.1％triton-x，室温反应10min。
[0096]
(4)加入10％山羊血清至刚好覆盖细胞，37℃封闭孵育1h。
[0097]
(5)吸除10％山羊血清，预冷1
×
pbs清洗后，一抗按1:200的比例，使用5％ bsa稀释成工作液，4℃孵育过夜。孵育后一抗可回收多次利用，然后用含2％ tween20的1
×
pbs润洗细胞，清洗两次，每次3min。
[0098]
(6)加入相应的荧光二抗至刚好覆盖细胞，并在室温中孵育1h，荧光二抗也用5％ bsa稀释，稀释比例为1:100。孵育结束后，吸除二抗，并用含2％ tween20的1
×
pbs洗两次，每次3min，除尽二抗。
[0099]
(7)加入100μl即用型dapi染色液，室温避光孵育10min，然后用预冷1
×
pbs清洗两遍，并加入抗荧光淬灭剂封片，防止荧光淬灭。倒置荧光显微镜下观察荧光或者4℃避光保存。
[0100]
免疫印迹:(1)蛋白定量
[0101]
取生长状态良好的3.0
×
105细胞接种于6孔板中，过夜贴壁培养后，加入不同浓度em-6处理24h，其中jnk抑制剂sp600125(20μm)、p38抑制剂sb203580(15μm)、erk抑制剂trametinib(25μm)预处理8h以及活性氧清除剂nac(5mm)预处理1h。
[0102]
药物处理结束后，吸除培养基，加入预冷的1
×
pbs润洗，然后在冰上加入100-200μl ripa强裂解液，其中ripa强裂解液预先加入蛋白酶抑制剂pmsf以及蛋白磷酸酶抑制剂混合物。冰上裂解半小时后，将细胞裂解液收集至无酶微型离心管中。预先打开高速冷冻离心机，通过4℃,12000rpm离心15min分离蛋白上清。转移蛋白上清至新的无酶微型离心管中并通过bca试剂盒测定蛋白浓度。
[0103]
蛋白定量后，加入sds-page蛋白上样缓冲液(6
×
)使其稀释至1
×
，95℃金属浴加热5min。蛋白上清分装放于-80℃冻存。
[0104]
(2)电泳；按照检测目的蛋白的分子量大小，配制合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，组装好电泳装置后，加入1
×
电泳工作液。然后将彩虹蛋白marker与样品蛋白一起上样电泳。
80v电泳30min后，转120v继续电泳，直至目的蛋白大小分子量的彩虹蛋白marker充分跑开。
[0105]
(3)转膜；电泳结束后，切除多余凝胶部分，平放于转膜滤纸上。0.22μm pvdf膜需要用甲醇浸泡活化后使用，与胶贴合后，排走气泡，然后插入转膜夹中，灌满电转液后，用200ma恒定电流转膜90min，转膜槽外周装满冰块。
[0106]
(4)封闭；转膜结束后，将膜浸泡在5％封闭牛奶中，缓慢摇荡，室温孵育1h。
[0107]
(5)抗体孵育、化学发光成像；封闭结束后，用1
×
tbs缓冲液洗掉多余的牛奶颗粒。一抗用一抗稀释液1:1000稀释使用，然后将膜浸泡在一抗中，4℃孵育过夜。一抗孵育后，回收一抗，并加入1
×
tbst洗膜液，摇床设置130rpm，洗膜每次10min，共3次。洗膜结束后，加入1
×
tbst洗膜液，摇床设置130rpm，洗膜每次10min，共3次。洗膜结束后，使用特灵敏ecl化学发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集并分析实验结果。
[0108]
统计与分析：
[0109]
通过使用ibm spss statistics 20以及graphpad prism 7.0进行数据处理与分析，两组样本间通过student's t检验是否具有差异，两组样本以上比较通过one way anova检验组间差异。p《0.05视为统计结果具有显著差异。
[0110]
实施例1
[0111]
为了研究em-6是否对肝癌细胞具有良好增殖抑制作用，发明人通过mtt实验检测不同浓度em-6表现出对人肝癌细胞株hepg2、bel-7402、huh-7、smmc-7721、mhcc97-h细胞活力的影响，肝癌临床化疗药物顺铂作为阳性对照药。其中正常肝上皮细胞株lo2和人正常支气管上皮样细胞株hbe为正常细胞对照，旨在评估em-6在相同浓度下对人正常细胞的毒副作用。如图3a、表2所示，em-6对hepg2、bel-7402、huh-7、smmc-7721、mhcc97-h的半抑制浓度ic
50
(48h)分别为42.71
±
12.950μm、19.8
±
9.557μm、1.83
±
0.306μm、17.87
±
0.118μm、15.52
±
0.697μm。而对正常细胞株hbe和lo2的ic
50
值均在100μm以上，表明em-6对肝癌细胞能够明显抑制肝癌细胞的细胞活力，并对正常细胞的细胞活力影响较小，图3a最低的线段为对huh-7活力影响线段，表明em-6对肝癌细胞huh-7具有最强的细胞活力抑制作用。同时，如图3c所示，与化疗药物顺铂(cisplatin,cddp)相比，同等浓度的em-6比cddp具有更为显著的细胞活力抑制作用。
[0112]
表2em-6对(a)细胞系的ic
50
(48h)
[0113][0114]
edu实验进一步检测em-6是否具有显著细胞增殖抑制作用。以hu h-7细胞为实验对象，用不同浓度的em-6处理细胞24h。如图3d所示，与对照组相比，em-6处理组中，新生细胞数目比例随着em-6处理浓度的升高而减少，表明em-6能够以浓度依赖方式抑制肝癌细胞h uh-7细胞增殖。发明人还通过克隆形成实验来评估em-6对肝癌细胞h uh-7存活及增殖能力的影响，得到了与edu实验相一致的实验结果。如图3e所示，分别使用0.375μm、0.75μm、
1.5μm的em-6处理h uh-7细胞7d后，与对照组相比，实验组中细胞克隆数目随着em-6处理浓度的上升而显著减少，1.5μm处理组中几乎没有形成细胞克隆。以上实验结果表明，em-6对肝癌细胞具有良好的增殖抑制作用。
[0115]
为了深入研究em-6对huh-7细胞的增殖抑制作用及其抗肿瘤作用分子机制，发明人进一步通过rna-seq技术来检测2μm em-6处理huh-7细胞24h后，细胞中生理过程及相关信号通路的变化。如图3f所示，通过kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)以及go(gene ontology)富集分析，发明人发现，与对照组相比，em-6处理对huh-7细胞的细胞周期，凋亡以及自噬等生理过程的改变具有显著差异。
[0116]
实施例2
[0117]
rna-seq结果表明em-6处理可以从mrna水平显著改变huh-7细胞细胞周期及凋亡等生理过程(如图3f所示)。因此，发明人通过流式细胞术以及免疫印迹来进一步检测em-6是否对huh-7细胞的周期活动及凋亡产生影响。如图4a所示，与对照组相比，em-6在处理huh-7细胞48h后，随着em-6处理浓度的升高，huh-7细胞中s期细胞的比例增加显著，其中g2/m期细胞比例也有轻微上升，g0/g1期细胞比例显著减少，表明着em-6能够抑制细胞周期活动，并将细胞周期活动主要阻滞在s期。免疫印迹结果与流式结果相一致，如图4c所示，em-6处理huh-7细胞24h后，随着em-6处理浓度的升高，周期蛋白cyclin a2以及周期依赖性蛋白激酶cdk2的蛋白表达水平逐渐上升，并且周期蛋白cyclin d1的表达水平显著减少。同时，周期依赖性蛋白激酶cdk2的抑制蛋白p27以及p21的表达水平逐渐升高。以上结果表明em-6可以诱导huh-7细胞发生s期阻滞。
[0118]
通过annexin v-fitc&pi双染色检测em-6处理huh-7细胞48h后的细胞凋亡率。结果如图4b所示，早期凋亡细胞群(fitc阳性，pi阴性)及晚期凋亡细胞群(fitc阳性，pi阳性)的比例随着em-6处理浓度增大而逐渐增大，4μm em-6处理48h后，细胞凋亡率上升至49.83％。同时，不同浓度em-6处理huh-7细胞24h后，总的caspase-9、caspase-3以及parp随着em-6处理浓度的增大逐渐减少，而切割的parp逐渐增多，如图4d所示。并且，抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl以及mcl-1的表达水平也逐渐降低，而促凋亡蛋白bax逐渐增多。通过流式细胞术检测活化的caspase-3的表达水平，结果如图4e所示，fitc-cl-caspase-3细胞群的比例在4μm em-6处理huh-7细胞48h后增加到了35.84％。以上实验结果表明，em-6能够诱导肝癌细胞huh-7发生细胞凋亡。
[0119]
实施例3
[0120]
为了研究em-6对细胞线粒体是否会产生影响，发明人首先通过go分析em-6处理对huh-7细胞线粒体中生物过程的影响。结果如图5a所示，em-6的处理对huh-7细胞线粒体中氧化还原以及凋亡过程的影响具有显著差异。
[0121]
线粒体是活性氧(reactive oxygen species,ros)产生的主要场所，ros积累严重时更会对遗传物质核酸产生氧化损伤，导致细胞发生不可逆转的死亡。因此，发明人使用jc-1探针来检测em-6处理对线粒体膜电位的影响，进而检测em-6是否会对线粒体膜产生损伤。通过荧光显微镜下观察发现，绿色荧光强度和红色荧光强度的比值随着em-6处理浓度上升而逐渐上升，如图5b所示。以上实验结果表明，em-6可以对huh-7细胞线粒体膜产生损伤，造成线粒体跨膜电位下降。
[0122]
另外，流式细胞术检测em-6对huh-7细胞内活性氧的影响，实验结果如图5c所示。
与对照组相比，em-6以浓度依赖的方式增加了细胞内ros的水平。而使用活性氧清除剂nac(5mm)预处理1h后，再用4μm em-6处理huh-7细胞8h，细胞内ros的水平恢复到与对照组相差无几的水平，如图5d所示。以上结果表明，em-6可以损伤线粒体，造成线粒体膜电位下降，并诱导胞内ros积累。
[0123]
实施例4
[0124]
发明人进一步研究em-6是否会诱导ros积累，从而激活细胞发生线粒体主导的内源性细胞凋亡途径以及s期周期阻滞。如图6a所示，nac预处理1h后再用em-6处理48h，与(nac-,em-6+)处理组相比，(nac+,em-6+)处理组中s期细胞群的比例显著减少，并与对照组(nac-,em-6-)中s期细胞群的比例相差无几。同时，免疫印迹结果中表明，与(nac-,em-6+)处理组相比，(nac+,em-6+)处理组中nac的预处理使得周期蛋白cyclin a2、周期依赖性蛋白激酶cdk2以及周期抑制蛋白p27、p21的表达水平明显降低，而cyclin d1的蛋白表达水平有所上升，如图6b所示。另外，克隆形成抑制实验以及mtt实验同样证明，nac预处理逆转了em-6对huh-7细胞的增殖抑制作用，如图6c、d所示。
[0125]
与单独em-6处理相比，nac预处理使得em-6诱导的细胞凋亡率显著降低。如图7a所示，与对照组(nac-,em-6-)相比，em-6处理组(nac-,em-6+)中，细胞凋亡率上升至54.66％，而在nac联用组(nac+,em-6+)中，凋亡率又下降至3.25％。同时，在蛋白表达水平上，与em-6处理组(nac-,em-6+)相比，bax以及cleaved-parp都在nac联用组(nac+,em-6+)中下降，而bcl-2，总的caspase-9，caspase-3以及parp都有明显升高。这些实验结果表明，em-6可以通过ros诱导huh-7细胞发生s期阻滞及细胞凋亡。
[0126]
实施例5
[0127]
为了深入探究em-6潜在的抗肿瘤作用分子机制，发明人对rna-seq结果进行kegg信号通路富集分析。如图8a所示，富集出的具有显著差异的前20条信号通路中，mapk信号通路排第一，表明em-6在处理huh-7细胞时，对mapk信号通路产生的影响最大。为了进一步确认em-6是否激活了mapk信号通路，通过免疫印迹检测mapk家族蛋白成员jnk、erk以及p38的影响。western blotting结果如图8b所示，随着em-6处理浓度的升高，jnk、erk以及p38的表达水平无明显变化，但是磷酸化形式的p-jnk、p-p38显著增加，而p-erk呈相反趋势，随着em-6处理浓度升高而减少。另外，em-6同样显著增加了jnk下游c-jun的磷酸化形式p-c-jun的表达。以上实验结果表明，em-6处理激活了mapk信号通路。
[0128]
越来越多的研究表明，ros的积累可以激活mapk信号通路从而参与调控细胞凋亡、细胞增殖等生命活动。发明人通过活性氧清除剂nac来清除ros的影响，从而进一步验证em-6诱导的ros积累与em-6激活mapk信号通路的联系。免疫印迹结果如图8c所示，与(nac-,em-6+)处理组相比，(nac+,em-6+)组中p-jnk、p-p38、p-c-jun的蛋白表达水平均显著降低，而p-erk表达改变不大，表明em-6可以通过ros激活mapk信号通路。
[0129]
实施例6
[0130]
mapk家族蛋白是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞生长等细胞生理过程中，发挥着不可替代的关键调控作用，其主要包括p38 mapk，erk1/2，sapk/jnk这三条信号通路。因此，发明人进一步通过使用p38抑制剂sb203580、erk抑制剂trametinib以及jnk抑制剂sp600125来确认em-6是否会通过影响mapk通路来诱导细胞凋亡。
[0131]
如图9a-c所示，与(trametinib-,em-6+)组相比，(trametinib+,em-6+)处理组中，cleaved-parp的蛋白表达水平增加。与(sp600125-,em-6+)处理组相比，(sp600125+,em-6+)处理组中，p-jnk、p-c-jun以及cleaved-parp的表达水平显著减少。同时，与(sb203580-,em-6+)处理组相比，(sb203580+,em-6+)处理组中，p-p38及cleaved-parp的表达水平减少。另外，mtt及流式凋亡的结果与免疫印迹结果相一致，如图9d、9e所示。联用erk抑制剂trametinib后，细胞活力降低更多，细胞凋亡率明显增大，表明em-6与erk抑制剂具有协同促进凋亡的作用。而em-6在联用sb203580以及sp600125后，都表现出更强的细胞活力以及明显降低的细胞凋亡率，以上结果表明，em-6可以诱导胞内ros积累，从而激活jnk及p38通路，诱导huh-7细胞发生凋亡。
[0132]
实施例7
[0133]
rna测序结果进行生物学过程富集时，发明人也发现em-6对细胞自噬也产生了显著影响。自噬(autophagy)是细胞的一种自我保护机制之一，对于细胞在不利存活条件下维持细胞稳态至关重要。发明人首先通过qrt-pcr和免疫印迹实验验证em-6处理前后，自噬相关蛋白的mrna水平以及蛋白水平的改变。如fig.10a,b所示，sqstm1/p62以及lc3b的mrna表达水平随着em-6处理浓度的升高而显著增加，lc3
‑ⅱ
及p62的蛋白表达水平同样显著增加。p62的免疫荧光实验中，p62的平均荧光强度以em-6浓度依赖方式而增强，且呈聚集型分布，如fig.10c所示，提示em-6阻断了自噬流。同时，随着em-6处理浓度的升高，自噬相关基因atg5、atg7、atg12的mrna水平改变均无明显影响，但显著减少了becn1的mrna表达水平。免疫印迹结果表明，em-6处理浓度升高，对atg5、atg12的蛋白表达无明显影响，但显著抑制了beclin-1以及atg7的蛋白表达，如fig.10a,b所示。以上结果提示em-6处理抑制了自噬起始过程。另外，通过联用自噬阻断剂巴弗洛霉素a1(baf a1,100nm)，申请人发现em-6与baf a1联合处理对huh-7细胞的细胞活力抑制更为显著，如fig.10d所示。
[0134]
本技术中，发明人首先通过mtt实验发现，em-6对正常肝上皮细胞系lo2以及正常支气管上皮样细胞hbe的毒性均比较小，并且em-6显著抑制肝癌细胞系的细胞活力，其中对huh-7细胞活力抑制程度最高，48h的ic
50
仅为1.83
±
0.306μm。同等浓度下，em-6对huh-7细胞活力的抑制程度比常规化疗药物顺铂要显著得多。edu以及克隆形成实验进一步证明了em-6可以显著抑制huh-7细胞增殖，这些都表明em-6具有成为一种新的抗肿瘤药物的潜力。发明人通过rna测序，并通过kegg通路富集与go功能分析em-6对huh-7细胞具体的生命活动、细胞器功能甚至某条信号通路的影响。结果初步表明，em-6能够显著影响huh-7细胞的周期活动、凋亡以及自噬水平。
[0135]
流式结果表明em-6能够诱导huh-7细胞发生s期阻滞。而免疫印迹中，随着em-6处理浓度的升高，周期蛋白cyclin a2以及周期依赖性蛋白激酶cdk2的蛋白表达水平逐渐上升，并且周期蛋白cyclin d1的表达水平显著减少。同时周期依赖性蛋白激酶cdk2的抑制蛋白p27以及p21的表达水平也随着em-6处理浓度的升高而逐渐升高，表明周期蛋白依赖性激酶cdk2的活性受到了抑制，huh-7可以诱导细胞发生s期阻滞。通过流式细胞术检测到huh7的凋亡率和活化的caspase-3的细胞数目比例随着em-6浓度升高而升高，免疫印迹中也发现总的caspase-9、caspase-3逐渐减少以及切割的parp逐渐增多。并且，抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl以及mcl-1的表达水平也逐渐降低，而促凋亡蛋白bax则是表达水平逐渐增多。这些证据都表明，em-6可以通过诱导huh-7细胞s期阻滞以及细胞凋亡来抑制huh-7细胞增殖。
[0136]
rna测序结果进行生物学过程富集时，发明人也发现em-6对细胞自噬也产生了显著影响。发明人首先通过检测p62与lc3来检测em-6对huh-7的影响，发现em-6显著增加sqstm1以及map1lc3b mrna表达水平以及lc3
‑ⅱ
和p62的蛋白表达水平。同时，p62的免疫荧光结果进一步表明，随着em-6处理浓度的升高，p62的平均荧光强度逐渐升高，并且出现聚集型分布，如图10c所示。p62作为选择性自噬底物之一，在与lc3互作后，在溶酶体中通过溶酶体的酸性水解酶作用而一起降解，其蛋白含量的增多，预示着em-6阻断自噬流。
[0137]
除此之外，如图10所示，em-6的处理对自噬相关基因atg5,atg 7,atg12的mrna表达无影响，但是可以显著减少becn1的mrna表达水平。同时，免疫印迹结果中，em-6对atg5、atg12的蛋白表达水平无明显影响，但如图10a、10b所示，显著减少了beclin-1以及atg7的蛋白表达，以上表明em-6也可抑制自噬起始过程。同时，发明人的课题研究中，与em-6单独处理相比，如图10d所示，em-6与巴佛洛霉素a1(bafa1)联用对huh-7细胞具有更强的细胞活力抑制作用。
[0138]
综上所述，发明人发现em-6可以显著抑制多种人肝癌细胞的增殖，其中对huh-7的ic50(48h)最小，为1.83
±
0.306μm。并且，em-6对正常肝上皮细胞lo2和正常支气管上皮样细胞hbe的毒性较小。同时，发明人还证明了em-6可以通过ros诱导肝癌细胞huh-7发生s期阻滞及凋亡，并且em-6还能激活ros/mapk通路，诱导细胞凋亡。此外，发明人还发现em-6可以阻断了细胞自噬过程。本研究阐明了从白花地胆草中提取出的新型倍半萜内酯化合物em-6在肝癌细胞huh-7中的抗肿瘤作用及其分子机制，为em-6将来应用于肝癌将来应用于肝癌临床治疗提供实验依据。
[0139]
以上所述实施方式仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.倍半萜内酯类化合物在制备治疗或辅助治疗肝癌的药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：2.倍半萜内酯类化合物在制备抑制肝癌细胞增殖药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：3.倍半萜内酯类化合物在制备用于阻滞细胞周期于s期、诱导细胞凋亡的阻滞剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：4.倍半萜内酯类化合物在制备抗肝癌增效剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：
5.倍半萜内酯类化合物在制备抗肝癌耐药逆转剂中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：6.倍半萜内酯类化合物与巴佛洛霉素a1联用在制备治疗或辅助治疗肝癌的药物中的应用，所述倍半萜内酯类化合物为式(i)所示化合物、其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：7.一种用于治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，包括：式(i)所示倍半萜内酯类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或其前药分子：8.一种权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，其剂型选自：注射剂、片剂、胶囊、试
剂盒或贴剂。

技术总结
申请公开了倍半萜内酯类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用，本申请式(I)的白花地胆草单体EM-6是从白花地胆草中的提取鉴定的新型倍半萜内酯类化合物，对肝癌细胞具有较好增殖抑制作用，且对肝上皮LO2细胞以及支气管上皮样HBE细胞具有较低毒性；另一方面，EM-6可以通过ROS积累，造成肝癌细胞Huh-7细胞S期阻滞及激活MAPK通路，诱导细胞凋亡。此外，本申请首次发现EM-6与巴佛洛霉素A1(BafA1)联用在治疗肝癌中疗效显著，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：蒋建伟 侯昌炎 唐晶晶 张清 李强 周俊臻 古建仪 张小鹰 甘丹卉 洪泓
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/9