蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用

1.本技术涉及中医药技术领域，特别涉及一种蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用。


背景技术：

2.偏头痛是一类发作性且常为单侧的搏动性头痛，是一种常见病、多发病，且多数患者有家族史。国内偏头痛的发病率大概为10％，欧美等发达国家发病率更高。大量偏头痛患者因而严重影响工作、学习和生活。
3.偏头痛急发作时患者甚为痛苦，目前认为药物治疗还是控制发作的最好办法，大致用药有血管收缩剂、激素、前列腺素抑制剂等，但是这些药物都有不同程度的副作用。中医药治疗偏头痛临床经验丰富，副作用较小，具有潜在的优势和良好前景，值得进一步挖掘和研究。


技术实现要素：

4.本技术为了丰富治疗偏头痛的中医药种类，提供一种蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用。
5.第一方面，本发明提供了蔓荆子水提物的第一种用途，本发明是采用以下技术方案得以实现的。
6.一种蔓荆子水提物在制备改善血管舒张功能药物中的应用。
7.第二方面，本发明提供了蔓荆子水提物的第二种用途，本发明是采用以下技术方案得以实现的。
8.一种蔓荆子水提物在制备保护神经药物中的应用。
9.第三方面，本发明提供了蔓荆子水提物的第三种用途，本发明是采用以下技术方案得以实现的。
10.一种蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用。
11.进一步的，所述蔓荆子水提物包括原儿茶酸、牡荆素、咖啡酸、山奈酚-3-o-葡萄糖苷、紫花牡荆素和牡荆内酯。
12.进一步的，所述蔓荆子水提物的提取方法如下：将蔓荆子粉碎，过20目筛，称取适量蔓荆子，加入4-6倍量去离子水，加热至沸腾后煎煮1-1.5h，趁热过滤，滤渣再加入4-6倍量去离子水采用相同方法煎煮提取，合并两次提取液，于50℃减压浓缩，得蔓荆子水提取浸膏。
13.本技术具有以下有益效果。
14.1.本发明的蔓荆子水提物可显著减少醋酸致痛实验小鼠扭体次数，提高小鼠痛阈值；
15.2.本发明的蔓荆子水提物可改善血管舒张功能，减轻炎症反应，缓解偏头痛程度；
16.3.本发明的蔓荆子水提物可通过抑制nf-κb通路，对tnf-α介导bend.3细胞的炎性
损伤发挥保护作用；
17.4.本发明的蔓荆子水提物可以通过抑制炎症反应，发挥神经保护作用。
附图说明
18.图1是本发明蔓荆子水提物对醋酸致痛实验小鼠扭次数的影响图(与control比较，
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p《0.05，
##
p《0.01，n＝10)；
19.图2是本发明蔓荆子水提物对硝酸甘油偏头痛模型行为学影响图(与control比较，
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p《0.05，
##
p《0.01；与gtn组比较，
*
p《0.05，n＝10)；
20.图3是本发明蔓荆子水提物对硝酸甘油致偏头痛大鼠血浆β-ep、cgrp、il-1β、pge2含量的影响图(与control比较，
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p《0.05；与gtn组比较，
*
p《0.05，n＝6)；
21.图4是硝酸还原酶法检测血清no含量的结果图(与control比较，
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p《0.01；与gtn组比较，
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p《0.05，
**
p《0.01，n＝6)；
22.图5是本发明三叉神经节nf-κb/nlrp3通路相关蛋白检测结果图(与control比较，
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p《0.05，
##
p《0.01；与gtn组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，n＝3)；
23.图6是本发明蔓荆子水提物对tnf-α诱导bend.3细胞il-6、sicam-1、svcam-1、p-iκbα表达的影响图(与control比较，
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p《0.05，
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p《0.01；与tnf-α组比较，
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p《0.05，
**
p《0.01，n＝5)；
24.图7是本发明蔓荆子水提物对tnf-α诱导bend.3细胞nf-κb核转移的影响图(与control比较，
##
p《0.01；与tnf-α比较，
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p《0.05，
**
p《0.01，n＝6)；
25.图8是本发明蔓荆子水提物对nf-κb表达的抑制作用结果图(与control比较，##p《0.01；与tnf-α组比较，**p《0.01，n＝6)；
26.图9是本发明正负离子模式总离子流图和活性组分图。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本专利申请进行进一步的说明。
28.以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；以下制备例和实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.所述蔓荆子水提物的提取方法如下：
30.取蔓荆子适量，粉碎，过20目筛，称取2kg。加入4倍量去离子水(w/v)，加热至沸腾后计时1h，其后趁热过滤，滤渣继续采用相同方法提取，合并两次提取液。于50℃减压浓缩，得蔓荆子水提取浸膏135.2g。
31.1.小鼠醋酸扭体实验
32.配制0.7％醋酸溶液制备小鼠扭体模型。将50只icr雄性小鼠随机分为空白组(control)、布洛芬组、蔓荆子水提物低剂量组(1.3g/kg)、蔓荆子水提物中剂量组(3.9g/kg)、蔓荆子水提物高剂量组(7.8g/kg)，每组10只。各组小鼠造模前7天进行灌胃给药(10ml/kg)，1次/日，空白组给予相应剂量的纯水，于末次给药30min后，各组腹腔注射0.7％醋酸溶液。观察20min内小鼠发生的扭体次数(小鼠出现腹部内凹，躯干与后肢伸张，臀部高起等行为反应，称为完整扭体反应一次)。
33.实验结果如图1所示，结果表明，蔓荆子水提物可显著减少醋酸致痛实验小鼠扭体
次数，提高小鼠痛阈值。
34.2.硝酸甘油偏头痛模型的制备及行为学观察
35.根据动物起始体重随机分笼分组并按组顺序编号，尽量保证各组动物实验条件均等。将60只sd雄性大鼠随机分为空白组(control)、硝酸甘油模型组(gtn)、布洛芬、蔓荆子水提物低剂量组(0.9g/kg)、蔓荆子水提物中剂量组(2.7g/kg)、蔓荆子水提物高剂量组(5.4g/kg)，每组10只。各组大鼠造模前7天开始按10ml/kg灌胃给药，1次/日，空白组和硝酸甘油组给予相应剂量的纯水。于末次给药30min后，参照tassorelli等报道(tassorelli c,joseph s a.systemic nitroglycerin induces fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat[j].brain res,1995,682(1-2):167-181.)的方法复制实验性偏头痛模型，除空白组外，其余各组大鼠给予腹腔注射硝酸甘油(gtn)10mg/kg，空白组注射等量的0.9％nacl溶液。使用数码摄像设备录制造模后30min内大鼠行为学变化情况，记录造模后大鼠挠头、爬笼、转圈、甩头、肢体晃动及清理毛发等行为学次数。实验结果参见图2。
[0036]
以上结果表明，蔓荆子水提物可显著减少醋酸致痛实验小鼠扭体次数，提高小鼠痛阈值；蔓荆子水提物可显著降低偏头痛大鼠挠头及甩头次数，减轻偏头痛大鼠疼痛程度。
[0037]
3.elisa方法测定血β-ep、cgrp、il-1β、pge2的含量
[0038]
将各组分离血浆或血清于-80℃取出，样品稀释液稀释3倍备用，按照elisa试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：(1)将elisa试剂盒放置室温平衡20-30min。(2)标准品工作液配制：将标准品于10000
×
g离心1min，加入标准品稀释液1ml，待充分溶解混匀后，配成标准品工作液，随后按推荐浓度梯度稀释，分别取100μl加于酶标板中，设置复孔。(3)每孔加3倍稀释后的待测样品100μl，轻轻晃动混匀，空白孔除外。封板膜封板，37℃孵育90min。(4)甩干酶标板内液体，每个孔中加入生物素化抗体工作液100μl，混匀，封板膜封板，37℃孵育1h。(5)甩尽酶标板内液体，每孔加洗涤液350μl，浸泡2min，甩掉洗涤液，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。(6)每孔加酶结合物工作液100μl，封板膜封板，37℃孵育30min。(7)甩干酶标板内液体，洗板5次，方法同步骤(5)。(8)每孔加90μl底物溶液，封板膜封板，37℃避光孵育10-15min。(9)每孔加终止液50μl，终止反应。随后立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度值。(10)以空白孔调零，根据标准曲线及样品稀释倍数计算样品待测指标浓度。实验结果参见图3。
[0039]
4.硝酸还原酶法检测血清no的含量
[0040]
将各组分离的血清于-80℃取出，按照南京建成生物工程研究所no试剂盒说明书中的要求溶解和配制相应试剂，按下列表格中的顺序依次加入相应试剂。
[0041] 空白管标准管测定管双蒸水(ml)0.1
ꢀꢀ
100μm标准品应用液(ml) 0.1 样本(ml)
ꢀꢀ
0.1混合试剂(ml)0.40.40.4
[0042]
混匀，37℃水浴60min
[0043]
试剂三(ml)0.20.20.2试剂四(ml)0.10.10.1
[0044]
充分旋涡混匀30s，室温静置40min，3500rpm，离心10min，取上清显色。
[0045]
上清(ml)0.50.50.5显色试剂(ml)0.60.60.6
[0046]
计算公式：
[0047][0048]
实验结果参见图4。
[0049]
5.三叉神经节nf-κb/nlrp3通路相关蛋白检测
[0050]
颈静脉取血后，大鼠断头处死，取出各组大鼠三叉神经节迅速置于冻存管中，于液氮中速冻，再移入-80℃冰箱保存。采用western blot检测p-nf-κb、nlrp3、caspase-1、cox-2等蛋白表达。实验结果参见图5。
[0051]
以上实验结果表明，蔓荆子水提物可改善硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠行为学变化，提高镇痛因子β-ep血浆含量；降低炎性介质no、cgrp、p-nf-κb、caspase-1、nlrp3、il-1β、cox-2及pge2蛋白表达，从而改善血管舒张功能，减轻炎症反应，缓解偏头痛程度，其机制可能与抑制nf-κb/nlrp3信号通路相关蛋白表达有关。
[0052]
6.建立tnf-α损伤bend.3细胞模型
[0053]
将复苏后的bend.3细胞接种于25cm2培养瓶中，使用含有20％胎牛血清，1％双抗的dmem培养基，于37℃孵箱内培养，每两天更换培养液1次，镜下观察待细胞长满瓶底时，进行传代和种板。0.25％胰蛋白酶(含0.02％edta)消化5min，1000rpm，离心3min。弃上清液，加入含10％胎牛血清的dmem培养基，重悬后调整细胞密度为1
×
105个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，观察细胞贴壁80％左右时开始实验。
[0054]
建立tnf-α损伤bend.3细胞模型：将bend.3细胞以1
×
105个/ml的密度，每孔100μl接种于96孔板，随机分为tnf-α组、蔓荆子水提物药物组，另设control组，每组设6个平行孔，细胞长满培养板底部80％左右时，每孔置换为100μl无血清dmem培养基同步化24h，具体分组如下：
[0055]
control组：置换为dmem培养基继续培养24h。
[0056]
tnf-α组：置换为含tnf-α(100ng/ml)的dmem培养基继续培养24h。
[0057]
dex组：置换为含tnf-α(100ng/ml)的及0.01μm地塞米松的dmem培养基继续培养24h。
[0058]
蔓荆子水提物组：置换为含有tnf-α(100ng/ml)及不同浓度蔓荆子水提物(0.01-1mg/ml)的dmem培养基继续培养24h。
[0059]
elisa法检测il-6、svcam-1、sicam-1和p-iκbα的释放和表达，免疫荧光法检测nf-κb核转位。实验结果参见图6、7。
[0060]
实验结果表明，蔓荆子水提物可显著抑制tnf-α炎性损伤bend.3细胞p-iκbα蛋白的表达及nf-κb p65核转位，降低il-6、svcam-1、sicam-1等下游炎性介质的释放，表明蔓荆子水提物可通过抑制nf-κb通路，对tnf-α介导bend.3细胞的炎性损伤发挥保护作用。
[0061]
7.建立uplc/q-tof-ms联合体外细胞转染检测筛选蔓荆子水提物的抗炎活性成分
[0062]
(1)液相条件：采用色谱柱waters acquity beh c18(2.1
×
100mm，1.7nm)；流速0.4ml/min；pda检测190-400run扫描，进样量：1μl；柱温30℃；动相a为0.1％甲酸水溶液，b
为乙腈；液相条件(见表1)。
[0063]
表1.液相条件
[0064][0065]
(2)质谱条件：离子源为电喷雾离子源(esi-ms)，数据采集工作站为masslynx4.1。正离子模式离子源温度100℃；毛细管电压3.0kv；样品cone电压30v；雾化气为高纯氮气，雾化气流速600l/h，温度350℃；扫描范围50-1200da，扫描频率0.1s，扫描间隔延时0.02s：校正液采用亮氨酸脑啡肽(lea，[m+h]
+
＝555.2931)。
[0066]
负离子模式：离子源温度100℃；毛细管电压2.5kv；样品cone电压45v；雾化气为高纯氮气，雾化气流速600l/h，温度350℃；扫描范围50-1200da，扫描频率0.1s，扫描间隔延时0.02s：校正液采用亮氨酸脑啡肽(lea，[m-h]-＝553.2775)
[0067]
(3)uplc分段样品制备
[0068]
蔓荆子水提物溶液经uplc分离后，流出液用分流器按1：9体积比进行分流，10％直接进入质谱用于物质结构信息分析；其余90％收集于深孔板(规格：2.2ml)中用于体外细胞转染抗炎活性检测，流出液每隔0.5min收集为一段，收集后置于真空-干燥箱中，40℃挥干流动相，残留物直接加入细胞培养基(100μl/孔)，振荡10min复溶，加入细胞检测每段组分对tnf-α刺激的影响。
[0069]
(4)细胞培养和转染
[0070]
hek 293t细胞培养在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中，在37℃，5％co2条件下培养。细胞接种于96孔培养板上，接种密度为3
×
104个/孔。待细胞生长密度达到70％-80％时，使用pei转染试剂同时转染nf-κb荧光素酶报告质粒pgl4.32和海肾荧光素酶报告质粒prl-tk，培养24h。
[0071]
(5)双荧光素酶报告法检测nf-κb抑制
[0072]
培养24h后，设置不同分组，具体如下：control组：置换为dmem培养基，继续培养6h。tnf-α组：置换为含tnf-α的dmem培养基，继续培养6h。dex组：置换为含tnf-α的及0.01μm地塞米松的dmem培养基，继续培养6h。蔓荆子水提物组：置换为含有tnf-α及不同浓度蔓荆子水提物(0.01-1mg/ml)的dmem培养基，继续培养6h。弃上清液，d-hank’s漂洗1次，将细胞裂解后用dual-luciferase检测系统检测。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值。
[0073]
表1蔓荆子水提物q/tof-ms化合物解析信息
[0074][0075][0076]
鉴定出6个化合物，结构式如下：
[0077][0078]
实验结果表明，运用uplc/q-tof-ms联合体外细胞转染检测的筛选方法，从蔓荆子水提物中共筛选鉴定出6个具有显著抗炎活性的成分，分别为原儿茶酸、牡荆素、咖啡酸、山奈酚-3-o-葡萄糖苷、紫花牡荆素和牡荆内酯。
[0079]
本具体实施方式的实施例均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种蔓荆子水提物在制备改善血管舒张功能药物中的应用。2.一种蔓荆子水提物在制备保护神经药物中的应用。3.一种蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用。4.根据权利要求1-3任一所述应用，其特征在于：所述蔓荆子水提物包括原儿茶酸、牡荆素、咖啡酸、山奈酚-3-o-葡萄糖苷、紫花牡荆素和牡荆内酯。5.根据权利要求1-3任一所述应用，其特征在于：所述蔓荆子水提物的提取方法如下：将蔓荆子粉碎，过20目筛，称取适量蔓荆子，加入4-6倍量去离子水，加热至沸腾后煎煮1-1.5h，趁热过滤，滤渣再加入4-6倍量去离子水采用相同方法煎煮提取，合并两次提取液，于50℃减压浓缩，得蔓荆子水提取浸膏。

技术总结
本申请公开了一种蔓荆子水提物在制备治疗偏头痛药物中的应用。本发明的蔓荆子水提物可显著减少醋酸致痛实验小鼠扭体次数，提高小鼠痛阈值；可改善血管舒张功能，减轻炎症反应，缓解偏头痛程度；可通过抑制NF-κB通路，对TNF-α介导bEnd.3细胞的炎性损伤发挥保护作用；可以通过抑制炎症反应，发挥神经保护作用。本发明的蔓荆子水提物可用于治疗偏头痛，丰富了治疗偏头痛的中医药种类，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：李霖 张晗 房士明 柴丽娟 王凯 吴美蓉 韦明艳 孙星怡 韩睿 陈雨钊
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/9/9