高效液相色谱测定胶原膜材料中6S-5-甲基四氢叶酸钙的方法与流程

高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法
技术领域
1.本发明涉及胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的系统检测领域，具体为高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法。


背景技术：

2.(6s)-5-甲基四氢叶酸钙(c)晶型((6s)-5-mthf-ca)，即天然化叶酸，是在原活性叶酸的基础上，对生产工艺进行升级：去除对胚胎发育有害的重金属催化剂、甲醛及苯磺酸等加工助剂，并严格控制jk12a存在安全隐患的杂质。产品不仅具备天然叶酸的结构，而且具备天然叶酸的安全性，同时(6s)-5-甲基四氢叶酸钙(c)晶型具备优良的稳定性。胶原作为一种生物活性物质，通过流延成型工艺或静电纺丝等技术可装载叶酸，制备得含(6s)-5-mthf-ca的胶原复合膜材料，拓展(6s)-5-mthf-ca在功能性食品及生物材料等领域的应用。
3.高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography/hplc)又称“高压液相色谱”，目前是(6s)-5-甲基四氢叶酸钙(c)晶型测定的团体标准方法。但是对于复合(6s)-5-mthf-ca的胶原膜材料，在测定过程中如何去除胶原蛋白的干扰在国内未见相关论述。
4.前期工作显示(6s)-5-mthf-ca可与胶原混和制备得复合(6s)-5-mthf-ca的胶原膜材料，目前(6s)-5-mthf-ca和胶原的结合是属于新型的胶原复合膜材料，因此对胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的系统检测方法还没有建立，为此本发明提供高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，以解决上述背景技术提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，具体步骤如下：
7.具体步骤如下：
8.s1：标准品溶液的配置：称取0.1g的dl-5甲基四氢叶酸钙标准品(dl-5-mthf-ca)加适量超纯水超声溶解后稀释制得200μg/ml浓度的标准品储备溶液；
9.s2：准确移取标准品储备溶液0.05ml-2.00ml于50ml棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准品溶液浓度分别为0.2-8.0μg/ml；
10.s3：采用hplc法对不同浓度标准品溶液进行分析测定；
11.s4：根据标准溶液浓度和对应的峰面积确定方程式y＝kx+c，得到标准曲线和方程；
12.s5：称取0.06-2mg复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料溶于1ml超纯水，按(6s)-5-mthf-ca质量1:1-1:3加入保护剂，充分溶解；
13.s6：于温度80-85℃水浴热处理25-35min，冷却至24-26℃；
14.s7：按胶原膜溶液∶萃取剂＝9:1，加入萃取剂混匀；
15.s8：置于离心机中6000-8000rpm/min离心8-12min去除胶原蛋白；
16.s9：取上清液；
17.s10：经0.22μm过滤头过滤；
18.s11：用hplc法测定(6s)-5-mthf-ca峰面积；
19.s12：代入峰面积与浓度的标准曲线中，计算(6s)-5-mthf-ca的回收率。
20.作为本发明的一种优选技术方案，所述s1的dl-5甲基四氢叶酸钙标准品在称取的时候精确至0.0001g。
21.作为本发明的一种优选技术方案，所述s5的保护剂包括但不限于l-抗坏血酸、抗坏血酸钠、l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、3-巯基-3-甲基丁醇等还原性物质。
22.作为本发明的一种优选技术方案，所述s7中的萃取剂内的正丁醇∶氯仿＝1:4。
23.作为本发明的一种优选技术方案，所述s11的hplc法中的色谱条件：色谱柱：c18柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm；以35％甲醇溶液为流动相，流速为1.1ml/min；检测波长为280nm；进样量：10μl；柱温：32℃，记录时间为33min。
24.梯度程序如下：
[0025][0026]
本发明的有益效果是：本发明首次利用高效液相色谱测定胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca含量，弥补了对胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的系统检测方法的空白，对(6s)-5-mthf-ca的推广及应用有重要作用，同时也创新了通过复合方法去除胶原复合膜材料中胶原蛋白以提高(6s)-5-mthf-ca的回收率的方法。
[0027]
1：对胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的系统检测方法的建立。
[0028]
2：样品前处理过程中对(6s)-5-mthf-ca的保护方法。在样品前处理过程中加入还原性物质包括但不限于如l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、3-巯基-3-甲基丁醇等。大量实验证明在样品处理过程中添加还原性物质可阻断(6s)-5-甲基-四氢叶酸的降解、提高稳定性，从而提高(6s)-5-mthf-ca的回收率。
[0029]
3：样品前处理中胶原蛋白的去除方法。通过加热并加入少量萃取剂，进行高效回收(6s)-5-mthf-ca的复合方法，可将胶原蛋白有效去除，以便于hplc对胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的测定，提高(6s)-5-mthf-ca回收率。
附图说明
[0030]
图1为本发明的方法流程图；
[0031]
图2为本发明实施例1的胶原膜材料hplc图谱；
[0032]
图3为本发明实施例1的复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料hplc图谱；
[0033]
图4为本发明实施例2的胶原膜材料hplc图谱；
[0034]
图5为本发明实施例2的复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料hplc图谱；
[0035]
图6为本发明实施例3的胶原膜材料hplc图谱；
[0036]
图7为本发明实施例3的复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料hplc图谱。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0038]
实施例1：
[0039]
s1、dl-5甲基四氢叶酸钙标准处理液(dl-a)：称取0.1g(精确至0.0001g)dl-5甲基四氢叶酸钙标准品(dl-5-mthf-ca)加适量超纯水超声溶解后置于100ml棕色容量瓶中，并稀释至刻度，制得1000μg/ml浓度的标准品溶液，置于4℃冰箱保存；
[0040]
s2、20％dl-5甲基四氢叶酸钙标准处理液(dl-20)：准确移取10mldl-a于50ml棕色定容瓶中﹐用超纯水稀释定容至刻度，浓度为200μg/ml；
[0041]
s3、准确移取dl-200.05ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml于50ml棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准品溶液浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、6.0、8.0μg/ml；
[0042]
s4、hplc法对不同浓度标准品溶液进行分析测定；
[0043]
s5、根据标准溶液浓度和对应的峰面积确定方程式y＝21759x+7386.3，相关系数r2＝0.9997；
[0044]
s6、称取2mg复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料溶于1ml超纯水，按(6s)-5-mthf-ca质量1：2加入保护剂，充分溶解。保护剂包括l-抗坏血酸、抗坏血酸钠、l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、3-巯基-3-甲基丁醇等；
[0045]
s7、于温度83.7
±
0.2℃水浴热处理30min，冷却至24℃；
[0046]
s8、按胶原膜溶液∶萃取剂(9:1)加入萃取剂(正丁醇∶氯仿＝1:4)，混匀；
[0047]
s9、置于离心机中6000rpm/min离心10min去除胶原蛋白；
[0048]
s10、取上清液；
[0049]
s11、经0.22μm过滤头过滤；
[0050]
s12、用hplc法测定(6s)-5-mthf-ca峰面积；
[0051]
s13、代入峰面积与浓度的标准曲线中，计算(6s)-5-mthf-ca的回收率为85.57％。
[0052]
实施例2：
[0053]
s1、称取0.1g(精确至0.0001g)dl-5甲基四氢叶酸钙标准品(dl-5-mthf-ca)加适量超纯水超声溶解后置于500ml棕色容量瓶中，并稀释至刻度，制得200μg/ml浓度的标准品储备溶液；
[0054]
s2、准确移取标准品储备溶液0.05ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.00ml、
1.50ml、2.00ml于50ml棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准品溶液浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、6.0、8.0μg/ml；
[0055]
s3、hplc法对不同浓度标准品溶液进行分析测定；
[0056]
s4、根据标准溶液浓度和对应的峰面积确定方程式y＝21759x+7386.3，相关系数r2＝0.9997；
[0057]
s5、称取0.06mg的复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料溶于1ml超纯水，按(6s)-5-mthf-ca质量1:1加入保护剂，充分溶解。保护剂包括但不限于l-抗坏血酸、抗坏血酸钠、l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、3-巯基-3-甲基丁醇等还原性物质；
[0058]
s6、于温度85℃水浴热处理30min，冷却至25℃；
[0059]
s7、按胶原膜溶液∶萃取剂(9:1)加入萃取剂(正丁醇∶氯仿＝1:4)，混匀；
[0060]
s8、置于离心机中6000rpm/min离心8min去除胶原蛋白；
[0061]
s9、取上清液；
[0062]
s10、0.22μm过滤头进行过滤；
[0063]
s11、用hplc法测定(6s)-5-mthf-ca峰面积；
[0064]
s12、代入峰面积与浓度的标准曲线中，计算(6s)-5-mthf-ca的回收率为86.78％。
[0065]
实施例3：
[0066]
s1、dl-5甲基四氢叶酸钙标准处理液(dl-a)：称取0.1g(精确至0.0001g)dl-5甲基四氢叶酸钙标准品(dl-5-mthf-ca)加适量超纯水超声溶解后置于100ml棕色容量瓶中，并稀释至刻度，制得1000μg/ml浓度的标准品溶液，置于4℃冰箱保存；
[0067]
s2、20％dl-5甲基四氢叶酸钙标准处理液(dl-20)：准确移取10mldl-a于50ml棕色定容瓶中﹐用超纯水稀释定容至刻度，浓度为200μg/ml；
[0068]
s3、准确移取dl-200.05ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml于50ml棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准品溶液浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、6.0、8.0μg/ml；
[0069]
s4、hplc法对不同浓度标准品溶液进行分析测定；
[0070]
s5、根据标准溶液浓度和对应的峰面积确定方程式y＝21759x+7386.3，相关系数r2＝0.9997；
[0071]
s6、称取1.8mg的复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料溶于1ml超纯水，按(6s)-5-mthf-ca质量1:3加入保护剂，充分溶解。保护剂包括l-抗坏血酸、抗坏血酸钠、l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、3-巯基-3-甲基丁醇等还原性物质；
[0072]
s7、于温度86℃水浴热处理30min，冷却至26℃；
[0073]
s8、按胶原膜溶液∶萃取剂(9:1)加入萃取剂(正丁醇∶氯仿＝1:4)，混匀；
[0074]
s9、置于离心机中6000rpm/min离心10min去除胶原蛋白；
[0075]
s10、取上清液；
[0076]
s11、0.22μm过滤头进行过滤；
[0077]
s12、用hplc法测定(6s)-5-mthf-ca峰面积；
[0078]
s13、代入峰面积与浓度的标准曲线中，计算(6s)-5-mthf-ca的回收率为84.78％。
[0079]
通过实施例1的图2和图3，实施例2的图4和图5，实施例3的图6和图7可知：经过验
证，通过加热并加入少量萃取剂，进行高效回收(6s)-5-mthf-ca的复合方法，可将胶原蛋白有效去除，以便于hplc对胶原复合膜材料中(6s)-5-mthf-ca的测定，提高(6s)-5-mthf-ca回收率。
[0080]
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，其特征在于：具体步骤如下：s1：标准品溶液的配置：称取0.1g的dl-5甲基四氢叶酸钙标准品(dl-5-mthf-ca)加适量超纯水超声溶解后稀释制得200μg/ml浓度的标准品储备溶液；s2：准确移取标准品储备溶液0.05ml-2.00ml于50ml棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准品溶液浓度分别为0.2-8.0μg/ml；s3：采用hplc法对不同浓度标准品溶液进行分析测定；s4：根据标准溶液浓度和对应的峰面积确定方程式y＝kx+c，得到标准曲线和方程；s5：称取0.06-2mg复合0.4％(6s)-5-mthf-ca胶原膜材料溶于1ml超纯水，按(6s)-5-mthf-ca质量1:1-1:3加入保护剂，充分溶解；s6：于温度80-85℃水浴热处理25-35min，冷却至24-26℃；s7：按胶原膜溶液∶萃取剂＝9:1，加入萃取剂混匀；s8：置于离心机中6000-8000rpm/min离心8-12min去除胶原蛋白；s9：取上清液；s10：经0.22μm过滤头过滤；s11：用hplc法测定(6s)-5-mthf-ca峰面积；s12：代入峰面积与浓度的标准曲线中，计算(6s)-5-mthf-ca的回收率。2.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，其特征在于：所述s1中的dl-5甲基四氢叶酸钙标准品在称取的时候精确至0.0001g。3.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，其特征在于：所述s5中的保护剂包括但不限于l-抗坏血酸、抗坏血酸钠、l/d半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇和3-巯基-3-甲基丁醇还原性物质。4.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，其特征在于：所述s7中的萃取剂内的正丁醇∶氯仿＝1:4。5.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定胶原膜材料中6s-5-甲基四氢叶酸钙的方法，其特征在于：所述s11中的hplc法中的色谱条件：色谱柱：c18柱，250mm
×
4.6mm，粒径5μm；以35％甲醇溶液为流动相，流速为1.1ml/min；检测波长为280nm；进样量：10μl；柱温：32℃，记录时间为33min。

技术总结
本发明公开了高效液相色谱测定胶原膜材料中6S-5-甲基四氢叶酸钙的方法，本发明首次利用高效液相色谱测定胶原复合膜材料中(6S)-5-MTHF-Ca含量，弥补了对胶原复合膜材料中(6S)-5-MTHF-Ca的系统检测方法的空白，对(6S)-5-MTHF-Ca的推广及应用有重要作用，同时也创新了通过复合方法去除胶原复合膜材料中胶原蛋白以提高(6S)-5-MTHF-Ca的回收率的方法。大量实验证明在样品处理过程中添加还原性物质可阻断(6S)-5-甲基-四氢叶酸的降解、提高稳定性，从而提高(6S)-5-MTHF-Ca的回收率；通过加热并加入少量萃取剂，进行高效回收(6S)-5-MTHF-Ca的复合方法，可将胶原蛋白有效去除，以便于HPLC对胶原复合膜材料中(6S)-5-MTHF-Ca的测定，提高(6S)-5-MTHF-Ca回收率。Ca回收率。Ca回收率。


技术研发人员：段蕊 王柯 许天月 魏家乐 刘誉 张俊杰
受保护的技术使用者：江苏省海洋资源开发研究院（连云港）
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/9