检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法与流程

1.本技术涉及本发明属于化学药物分析检测领域，具体涉及检测吡仑帕奈原料药中五种基因毒性杂质的方法。


背景技术：

2.在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
3.吡仑帕奈(perampanel，商品名fycompa)是一种新型的抗癫痫药物，由日本卫材制药(eisai)公司研发，于2012年在欧盟和美国上市，2019年在中国获批。它的作用机制是通过非竞争性地拮抗突触后神经元的α-氨基-3羟基-5甲基-4异噁唑受体(ampar)，抑制过度兴奋的谷氨酸介导的神经递质释放，从而降低癫痫发作的发生。它主要用于治疗12岁及以上儿童癫痫部分性发作患者(伴或不伴继发性全面性癫痫发作)的辅助治疗，也可用于治疗原发性全面性强直阵挛发作。目前临床上可用的剂型为片剂和口崩片剂。
4.吡仑帕奈的化学名为[2-(6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]-5'-基)苄腈]四分之三水合物，其分子式为c
23h15
n3o
·
3/4h2o，分子量为362.90g/mol，cas号为380917-97-5。它的工艺路线是以邻溴苯乙酸和苯胺为起始原料，经缩合，氰化，环合生成吡仑帕奈。基因毒性杂质主要来源于原料合成过程中的起始物料、中间体、试剂及反应副产物，也可在药物贮存中降解产生。
[0005]
ich m7(r1)是国际药品注册技术要求协调会(ich)制定的一份指导原则，它针对药物中可能含有的dna反应性杂质，即能够与dna发生反应并引起突变的杂质，制定了评估和控制的标准和方法，旨在降低这些杂质对人体的致癌风险。该指导原则提供了一个致突变杂质的鉴别、分类、定性和控制的框架方案，涵盖了计算机模拟预测、实验室检测和风险评估等步骤。计算机模拟预测是利用已知的化学结构和生物活性之间的关系，对药物中可能存在的dna反应性杂质进行预测；实验室检测是利用细菌或哺乳动物细胞等体外模型，对药物中已知或预测的dna反应性杂质进行检测；风险评估是根据实验室检测的结果，对药物中dna反应性杂质的致癌风险进行评估。
[0006]
基因毒性杂质的限度控制通常采用毒理学关注阈值法(ttc法)，即根据毒理学数据确定一个安全的暴露水平，规定原料药及制剂中基因毒性杂质的ttc值不超过1.5μg/d。ttc值是指每天接触某种化合物不会引起任何可察觉风险的最大剂量。吡仑帕奈的最大日剂量为12mg，因此其基因毒性杂质的控制限度为0.0125％。
[0007]
由于基因毒性杂质限度较低，检测方法一般需要用液相色谱-质谱联用(lc-ms)或气相色谱-质谱联用(gc-ms)，lc-ms和gc-ms是将液相色谱或气相色谱与质谱仪结合在一起，可以同时进行分离、鉴定和定量分析，但这些仪器成本高昂，不是每个药企qc部门都能够使用。常规液相色谱方法是利用不同化合物在移动相和固定相之间的相互作用，实现分离和定量分析，与lc-ms或gc-ms相比，具有仪器成本低、操作简便、灵敏度高等优点。因此，开发常规液相色谱方法检测遗传毒性杂质更具有现实意义。


技术实现要素：

[0008]
本发明提供了一种同时检测吡仑帕奈中五种基因毒性杂质的检测方法，使其专属性、检测限、定量限、线性及范围、重复性、准确度、耐用性等方面完全符合标准且具有较高的精密度，可用于吡仑帕奈的质量控制和安全性评估。
[0009]
具体地，本发明提供了下述的技术方案。
[0010]
在本发明第一方面，提供了一种检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法，所述方法通过高效液相色谱法检测吡仑帕奈原料药中的五种基因毒性杂质，所述方法包括以磷酸溶液作为流动相a，以乙腈为流动相b，并采用乙腈-流动相a作为杂质对照品溶剂；
[0011]
所述五种基因毒性杂质的结构及名称如下表所示：
[0012][0013][0014]
在本发明的实施方式中，所述流动相a为0.08-0.12％的磷酸溶液，优选为0.1％的的磷酸溶液。
[0015]
在本发明的实施方式中，所述杂质对照品溶剂为体积比60：40的乙腈和流动相a的混合液。
[0016]
在本发明的实施方式中，所述方法包括：
[0017]
以乙腈溶解吡仑帕奈样品制备供试品溶液；
[0018]
杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d作为杂质对照品，以体积比为60:40的乙腈-流动相a的混合溶液溶解并稀释各杂质对照品制备杂质对照品溶液贮备液，并以乙腈稀释制备对照品溶液；
[0019]
分别将供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪进行检测并记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中五种基因毒性杂质的含量。
[0020]
在本发明的实施方式中，所述高效液相色谱仪的检测条件为：
[0021]
色谱柱：十八烷基硅烷色谱柱，capcell pak adme hr c18(150mm
×
4.6mm，3μm)
[0022]
流动相a：0.08-0.12％磷酸溶液，优选为0.1％磷酸溶液；
[0023]
流动相b：乙腈
[0024]
流速：0.75-0.85ml/min，优选为0.8ml/min；
[0025]
柱温：23-27℃，优选为25℃；
[0026]
检测波长：208-212nm，优选为210nm；
[0027]
进样量：10μl。
[0028]
在本发明的实施方式中，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序为：
[0029]
流动相a和流动相b的初始比例为80:20；
[0030]
第0～35min，降低流动相a的比例，同时提高流动相b的比例至两者比例为42:58；
[0031]
第35～45min，保持流动相a和流动相b的比例为42:58；
[0032]
第45～50min，提高流动相a的比例，同时降低流动相b的比例至回到初始比例80:20；
[0033]
第50～60min，保持流动相a和流动相b的比例为80:20。
[0034]
在本发明的实施方式中，杂质k的线性范围为0.2086μg/ml～2.0862μg/ml，杂质l的线性范围为0.3086μg/ml～2.0573μg/ml，杂质o的线性范围为0.2059μg/ml～2.0591μg/ml，杂质n的线性范围为0.2074μg/ml～2.0741μg/ml，杂质d的线性范围为0.2496μg/ml～1.9970μg/ml。
[0035]
在本发明的实施方式中，所述方法的检测限低至0.103μg/ml，定量限低至0.2059μg/ml。
[0036]
在本发明的实施方式中，计算杂质含量的公式为：
[0037]
供试品溶液中各基因毒性杂质的含量(％)＝f
平均
×ai
×vi
/mi×
100％
[0038]
其中：f＝ms×cs
/(vs×as
)；
[0039]
式中：f为响应因子；ms为对照品溶液中各基因毒性杂质的称样量；
[0040]cs
为各基因毒性杂质的含量，％；vs为对照品溶液中各基因毒性杂质的总稀释体积；as为对照品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；f
平均
为响应因子的平均值；ai为供试品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；mi为供试品的称样量；vi为供试品的稀释体积。
[0041]
在一些实施方式中，探索了不同流动相a、不同对照品溶剂、不同柱温、不同检测波长、不同洗脱方式，比如，在一些实施方式中，将流动相a更换为0.1％乙酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至4.0)或者0.01mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph值为3.0)；比如，在一些实施方式中，将对照品溶剂更换为50％乙腈；比如，在一些实施方式中，将供试品溶剂更换为n,
n-二甲基甲酰；比如，在一些实施方式中，将检测波长更换为220nm及以上；比如在一些实施方式中，改变梯度洗脱条件或者将梯度洗脱方式变更为等度洗脱(比如流动相a:b＝60:40)；比如，在一些实施方式中，将柱温更换为30℃及以上；在这些实施方式中，检测结果都有一些不理想的地方，比如会出现例如基线波动大，和/或各待测杂质之间分离度较低、甚至难以分离，和/或待测杂质与未知杂质难以分离或供试品难以溶解等等的情况。
[0042]
在本发明的一些较优的实施方式中，所述检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质d、k、l、n和o的方法包括：
[0043]
1、色谱条件：
[0044]
仪器：agilent 1260
[0045]
色谱柱：capcell pak adme hr c18(150mm
×
4.6mm，3μm)；
[0046]
流动相a：0.1％磷酸溶液；
[0047]
流动相b：乙腈；
[0048]
流速：0.8ml/min；
[0049]
柱温：25℃；
[0050]
检测波长：210nm；
[0051]
进样量：10μl；
[0052]
梯度洗脱，洗脱程序如表1中所示：
[0053]
表1：梯度洗脱程序
[0054]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020354258454258508020608020
[0055]
2、检测方法
[0056]
(1)配制供试品溶液：取吡仑帕奈样品80mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0057]
(2)配制对照品溶液：分别取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，用乙腈-流动相a(60：40)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；精密量取0.1ml对照品溶液贮备液，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
[0058]
(3)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d的含量，含量计算方法同上。
[0059]
在本发明的第二方面，提供了选自如下所示的五种物质在吡仑帕奈原料药或其制剂质量控制中的应用；
[0060][0061]
在本发明的实施方式中，所述五种物质为基因毒性杂质，在质量控制中作为杂质对照品使用。
[0062]
相较于现有技术，本发明的优势包括：
[0063]
本发明的方法使得本发明所述五种基因毒性杂质即杂质d：(2-(6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]-5'-基)溴苯、杂质k：(5'-(2-氰基苯基)-6'-氧代-1'-苯基-1',6'-二氢-[2,3'-联吡啶]1-氧化物)、杂质l：邻溴苯乙酸、杂质n：(2-(2-溴苯基)-n-苯基乙酰胺)和杂质o：2-(2-氰基苯基)-n-苯基乙酰胺)彼此之间以及与吡仑帕奈之间均能有效分离，分离度均在2.8以上，且峰型对称性较好，利于各基因毒性杂质的检出，具有较高的专属性。并且本发明所述方法线性好、检测限低至0.103μg/ml，定量限低至0.2059μg/ml，在检测限、定量限、线性与范围、重复性以及耐用性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。
附图说明
[0064]
构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。以下，结合附图来详细说明本技术的实施方案，其中：
[0065]
图1是对照品溶液色谱图。
[0066]
图2是加样供试品溶液色谱图。
[0067]
图3是加样供试品溶液色谱图。
[0068]
图4是加样供试品溶液色谱图。
[0069]
图5是空白溶剂色谱图。
[0070]
图6是供试品溶液色谱图。
[0071]
图7是加样供试品溶液色谱图，其中，1-杂质k；2-杂质l；3-杂质o；4-杂质n；5-杂质d。
[0072]
图8是杂质l的标准曲线图。
[0073]
图9是杂质n的标准曲线图。
[0074]
图10是杂质o的标准曲线图。
[0075]
图11是杂质k的标准曲线图。
[0076]
图12是杂质d的标准曲线图。
具体实施方式
[0077]
下面结合具体实施例，进一步阐述本技术。应理解，这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件或按照制造厂商所建议的条件。
[0078]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本技术所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本技术所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0079]
依照本发明所述检测方法，主要针对杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d的检测，用外标法进行计算。
[0080][0081]
本发明下述实施方式中采用的吡仑帕奈原料及待检测杂质的对照品来源见下表：
[0082][0083]
本发明所述检测方法在实施方式中采用的仪器与试剂信息见下表：
[0084][0085]
实施例1
[0086]
同时检测吡仑帕奈中五种基因毒性杂质(杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d)的检测方法。
[0087]
1、色谱条件：
[0088]
仪器：agilent 1260
[0089]
色谱柱：capcell pak adme hr c18(150mm
×
4.6mm，3μm)；
[0090]
流动相a：0.1％磷酸溶液；
[0091]
流动相b：乙腈；
[0092]
流速：0.8ml/min；
[0093]
柱温：25℃；
[0094]
检测波长：210nm；
[0095]
进样量：10μl。
[0096]
梯度洗脱，洗脱程序如表1中所示：
[0097]
表1：梯度洗脱程序
[0098]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020354258454258508020608020
[0099]
2、检测方法
[0100]
(1)配制供试品溶液：取吡仑帕奈样品80mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0101]
(2)配制对照品溶液：分别取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，用乙腈-流动相a(60：40)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；精密量取0.1ml对照品溶液贮备液，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0102]
(3)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d的含量。
[0103]
实施例2
[0104]
与实施例1相比，除色谱条件外，其他相同。
[0105]
色谱条件如下：
[0106]
色谱柱：inertisl ods-3v，250mm
×
4.6mm，5μm；c18-145-261；
[0107]
流动相a：0.1％乙酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至4.0)；
[0108]
流动相b：乙腈；
[0109]
检测波长：210nm/220nm/230nm；
[0110]
流速：1.0ml/min；
[0111]
柱温：25℃；
[0112]
浓度：10μg/ml；
[0113]
进样量：10μl；
[0114]
梯度洗脱条件：
[0115][0116]
检测结果见图1，检测结果显示，在此体系条件下各波长的基线波动均较大，影响检测结果。
[0117]
实施例3
[0118]
与实施例1相比，洗脱方式改为流动相a：b＝60：40，等度洗脱，柱温35℃，流速：1.0ml/min，并分别在检测波长：224nm/220nm/210nm/272nm/290nm下检测，其他同实施例1。
[0119]
加样供试品溶液配制方法：取本品约80mg，置10ml量瓶，精密加入杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d贮备液各0.1ml，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0120]
结果：该条件下无明显基线波动，各杂质在224nm吸收虽不如210nm，但该条件下210nm相较于224nm基线波动较大。224nm波长下混合溶液(对照品溶液)色谱图中各杂质互不干扰，但是加样供试品溶液色谱图(见图2)中杂质o的峰型不好，原因在于杂质o前有一未知杂质与杂志o的峰重合，该未知杂质无法与杂质o分离，影响检测结果。
[0121]
实施例4
[0122]
与实施例3相比，柱温修改为25℃，其他同实施例3。
[0123]
结果：此条件下杂质o与相邻未知杂质分离度符合要求，各杂质在210nm吸收较224nm高，基线波动差距不大，故将检测波长改为210nm，见图3。
[0124]
但是，在后续进行破坏实验时发现，光照破坏会产生一未知杂质，该未知杂质会严重干扰杂质k的检测，将流速改为0.8ml/min，其它检测条件不变，略有改善，但依然严重影响杂质k的检测，加样供试品溶液色谱图如图4所示。
[0125]
实施例5
[0126]
对实施例1所述检测方法进行方法学验证。
[0127]
1、方法学验证
[0128]
1.1专属性
[0129]
各杂质定位溶液：分别取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d对照品各约10mg，精密称定，置不同10ml量瓶中，用乙腈-流动相a(60：40)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液；分别精密量取0.1ml各杂质贮备液，置不同100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0130]
供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0131]
加样供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，精密加入杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d贮备液各0.1ml，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0132]
按照实施例1的色谱条件分别进样空白溶液即乙腈-流动相a(60：40，流动相a为0.1％磷酸溶液)、各杂质定位溶液、供试品溶液及加样供试品溶液，记录色谱图，见图5、图6和图7以及表2，结果表明各杂质间均能良好的分离，分离度均大于2.8。
[0133]
表2：专属性试验结果
[0134][0135][0136]
1.2检测限与定量限
[0137]
分别取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d对照品各适量，分别逐步稀释至低浓度，注入液相色谱仪，记录色谱图。以信噪比s/n≥3时的浓度，作为检测限浓度，以信噪比s/n≥10时的浓度，作为定量限浓度。结果见表3。
[0138]
表3：检测限和定量限结果
[0139][0140]
各杂质的检测限和定量限浓度均小于报告限浓度，均符合要求，证明本发明的灵敏度良好。
[0141]
1.3线性与范围
[0142]
线性贮备液：精密量取杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d贮备液各1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0143]
将定量限浓度作为线性1溶液。
[0144]
精密量取线性贮备液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，分别置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为线性2(50％)、线性3(100％)、线性4(150％)、线性5(200％)溶液。
[0145]
按照实施例1的色谱条件，以浓度(c)为横坐标(x轴)，以峰面积(a)为纵坐标(y轴)，进行线性回归分析，各杂质在定量限～200％限度浓度范围内线性均良好，y轴截距很小，系统误差很小。检测结果见说明书图9、图9、图10、图11、图12和表4。
[0146]
表4：线性试验结果
[0147]
名称二次方程r100％响应值的25％浓度范围杂质ky＝58.0677x+0.00180.999614.990.2086μg/ml～2.0862μg/ml杂质ly＝32.6806x-0.31831.00008.320.3086μg/ml～2.0573μg/ml杂质oy＝63.0058x-0.05690.999616.060.2059μg/ml～2.0591μg/ml杂质ny＝55.1904x-0.04110.999614.170.2074μg/ml～2.0741μg/ml杂质dy＝48.4201x+0.07240.999712.120.2496μg/ml～1.9970μg/ml
[0148]
1.4准确度
[0149]
按照实施例1所述方法平行配制2份对照品溶液。
[0150]
50％水平供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，精密加入50μl各杂质贮备液，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0151]
100％水平供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，精密加入100μl各杂质贮备液，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0152]
150％水平供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，精密加入150μl各杂质贮备液，加乙腈并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0153]
供试品溶液：取本品约80mg，置10ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。按照实施例1的色谱条件，按外标法计算回收率，检测结果见表5。
[0154]
表5：回收率试验结果
[0155][0156]
[0157][0158]
由上表可知，各杂质在三个浓度水平样品回收率平均值均在80.0％～120.0％范围内，且9份样品回收率结果rsd％均小于10，证实了该方法具有良好的准确度。
[0159]
1.5重复性
[0160]
按照实施例1所述方法平行配制2份对照品溶液；
[0161]
按照实施例1所述方法平行配制6份供试品溶液；
[0162]
按照实施例1色谱条件进行检测，按外标法计算各杂质含量。结果见表6。
[0163]
表6：重复性试验结果
[0164][0165]
959.38430.95061.05756.23051.456 1259.17030.70460.72656.13451.674 2458.81330.96260.79555.84251.760rsd(％)1.01.20.50.40.3
[0179]
试验结果表明24h内对照品溶液和加样供试品溶液中杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d的峰面积与含量均没有显著变化，证明溶液在24h内稳定。
[0180]
1.8耐用性
[0181]
考察改变检测波长、柱温、流速、磷酸浓度以及更换不同色谱柱等条件下，加样供试品溶液中各基因毒性杂质的含量变化情况以及各杂质之间的分离度情况。详细结果见表10。
[0182]
表10：耐用性试验结果
[0183]
[0184][0185]
试验结果表明在上述检测条件下，杂质l、杂质n、杂质o、杂质k与杂质d之间的分离度均大于1.5；各杂质含量变化rsd％在10以内，说明方法耐用性良好。
[0186]
方法学验证结果表明：本发明测定吡仑帕奈中五种基因毒性杂质的含量，专属性强，准确度、精密度高，耐用性好，适用于吡仑帕奈中五种基因毒性杂质的准确控制。
[0187]
实施例6
[0188]
样品测定
[0189]
分别称取3批(220916、220919、220920)吡仑帕奈原料药，按照实施例1所述方法进行测定，并记录色谱图，按外标法计算五种基因毒性杂质的含量。
[0190]
结果显示，3批吡仑帕奈原料药中，杂质l、杂质n、杂质o、杂质k与杂质d均未检出。
[0191]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述方法包括通过高效液相色谱法检测吡仑帕奈原料药中的五种基因毒性杂质，所述五种基因毒性杂质的结构分别如下所示：杂质d：杂质k：杂质l：杂质n：杂质o：其中，所述方法中以磷酸溶液作为流动相a，以乙腈为流动相b，以乙腈-流动相a作为杂质对照品的溶剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相a为0.08-0.12％的磷酸溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相a为0.1％的磷酸溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂质对照品的溶剂，其乙腈和流动相a的体积比为60:40。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，包括：取吡仑帕奈样品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，制备供试品溶液；杂质l、杂质n、杂质o、杂质k、杂质d作为杂质对照品，精密称定，置于同一量瓶中，以乙腈-流动相a的混合溶液溶解并稀释至刻度制备杂质对照品溶液贮备液；精密量取对照品溶液储备液至量瓶中并以乙腈稀释至刻度制备对照品溶液；精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪进行检测并记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中五种基因毒性杂质的含量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的检测条件为：色谱柱：c18色谱柱流动相a：0.08-0.12％磷酸溶液流动相b：乙腈流速：0.75-0.85ml/min柱温：23-27℃检测波长：208-212nm进样量：10μl。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序为：
流动相a和流动相b的初始比例为80:20；第0～35min，降低流动相a的比例，同时提高流动相b的比例至两者比例为42:58；第35～45min，保持流动相a和流动相b的比例为42:58；第45～50min，提高流动相a的比例，同时降低流动相b的比例至回到初始比例80:20；第50～60min，保持流动相a和流动相b的比例为80:20。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，杂质k的线性范围为0.2086μg/ml～2.0862μg/ml，杂质l的线性范围为0.3086μg/ml～2.0573μg/ml，杂质o的线性范围为0.2059μg/ml～2.0591μg/ml，杂质n的线性范围为0.2074μg/ml～2.0741μg/ml，杂质d的线性范围为0.2496μg/ml～1.9970μg/ml。9.选自下述五种物质中的一种或多种在吡仑帕奈原料药或其制剂质量控制中的应用；10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述五种物质为基因毒性杂质，在质量控制中作为杂质对照品使用。

技术总结
本申请提供一种检测吡仑帕奈原料药中基因毒性杂质的方法。所述方法通过高效液相色谱法检测吡仑帕奈原料药中的五种基因毒性杂质，所述方法包括以磷酸溶液作为流动相A，以乙腈为流动相B，并采用乙腈-流动相A作为杂质对照品溶剂，所述五种基因杂质的结构如下所示：本发明所述方法使得各基因毒性杂质之间以及与吡仑帕奈之间均能有效分离，且峰型对称性较好，利于各基因毒性杂质的检出，具有较高的专属性，本发明在检测限、定量限、线性与范围、重复性以及耐用性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。具有较高的精密度。具有较高的精密度。


技术研发人员：毕红娜 杨杰 解春文 于晓燕 王鹏 胡醒
受保护的技术使用者：北京达因高科儿童药物研究院有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/9