一种微生物制剂在黄芪种植中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种微生物制剂在黄芪种植中的应用。


背景技术：

2.黄芪是豆科植物蒙古黄芪astragalus membranaceus ( fisch. ) bge. var. mongholicus ( bge. ) hsiao或膜荚黄芪astragalus membranaceus ( fisch. ) bge.的干燥根。在黄芪大规模种植过程中，大量施用化肥、农药，造成许多生物种群数量急剧减少甚至灭绝，严重破坏了生态平衡，导致土壤酸化板结和透气性下降，土壤理化性状的恶化，从而导致黄芪品质的下降。
3.2020 版 《中华人民共和国药典》规定黄芪药材以黄芪甲苷与毛蕊异黄酮苷为指标成分，黄芪甲苷的含量不得少于0.04%（0.4mg/g），毛蕊异黄酮苷的含量不得少于0.02%（0.2 mg/g）。黄芪中除了毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷之外，还含有芒柄花苷、毛蕊异黄酮、 芒柄花素、黄芪皂苷，其中芒柄花苷，黄芪皂苷在黄芪的疗效中发挥着不可或缺的作用。
4.芒柄花苷可显著抑制人乳腺癌细胞增殖，使细胞周期阻滞于g0/g1期，抑制dna复制活性，芒柄花苷还可以改善小鼠脓毒症引起的认知功能障碍，其机制可能与芒柄花苷抑制海马组织的炎症反应和氧化应激反应有关，芒柄花苷对2型糖尿病肾病大鼠肾损伤也具有明显的改善作用。张淑娟等采用网络药理学和指纹图谱方法，筛选出 3 种成分作为黄芪药材潜在质量标志物，依次为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷（基于网络药理学及指纹图谱的黄芪质量标志物预测，中国中药杂志，2691-2698页，第46卷第11期，2021年）。因此，不仅需要提高黄芪中毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷的含量，更有必要提高芒柄花苷的含量。
5.辛中尧等研究表明，枯草芽孢杆菌能产生生长激素类物质，提高黄芪的品质（枯草芽孢杆菌b1b2菌株对当归、黄芪的防病促进生长效果，植物保护，第142-144页，第34卷第6期，2008年）。但是，并未明确指出提高了黄芪何种品质，或者说何种质量指标。
6.cn112438171a公开了一种枯草芽孢杆菌可以有效提高黄芪内有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量，可以将毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量提高35.14%~63.51%，黄芪甲苷的含量提高26.39%~45.83%。但是，并未提及是否能够提高芒柄花苷和黄芪皂苷的含量。


技术实现要素：

7.本发明提供一种微生物制剂在黄芪种植中的应用，特别是在黄芪种植中提高黄芪中有效成分的含量方面的应用。
8.微生物制剂中的菌种选自枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
9.枯草芽孢杆菌菌株来自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号为accc no.10242，苏云金芽孢杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号为accc no.01599，地衣芽孢杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号为accc no.02975， 巨大芽孢杆
菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号为accc no.04314。
10.分别将枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种至lb培养基中，30~32℃培养24~48h，分别可得枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌培养液。将培养液按一定比例配比使用，枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌培养液重量比为（0.5-5）：（0.5-5）：（0.5-5）：（0.5-5），优选为1:1:1:1。
11.微生物制剂中还包括虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥，菌种培养液与虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥的重量比为（0.1~1）:（0.1~10）：（0.01~1）：（0.01~9）：（1~50）：（1~20）：（1~10）。
12.虾蟹壳来源于江河湖海任意的富含几丁质的水生动物外壳，其干燥品经粉碎后过20目~100目筛的细颗粒粉末。优选为虾壳粉、蟹壳粉或虾蟹粉。
13.胶原蛋白选择猪皮胶原蛋白、鱼皮胶原蛋白或牛皮胶原蛋白中的一种或以上。
14.复合氨基酸由海带发酵液、一水硫酸锌和四水合七钼酸铵组成，其中每80~120ml海带发酵液中添加一水硫酸锌20~40g，四水合七钼酸铵1~3g。
15.碳水化合物选自葡萄糖，果糖和蔗糖中的一种或以上。
16.复合肥中的氮、磷、钾的重量比为（10~20）：（10~20）：（10~20），优选为15:15:（15~20）。
17.微生物制剂的制备方法包括：
18.（1） 将菌种培养液、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠加入水中，混合，发酵温度25~35℃，发酵时间3~5天，鼓泡通气，获得发酵液；
19.（2） 将氨基酸、碳水化合物、复合肥加入到步骤（1）的发酵液中，发酵温度25~35℃，发酵时间3~5天，鼓泡通气，获得微生物制剂。
20.步骤（2）所得微生物制剂中活菌数不低于1
×
109~2
×
10
10
个/ml，优选为活菌数不低于1
×
10
10
个/ml。
21.微生物制剂的施用方法：将微生物制剂用水稀释1~10倍，加入微生物制剂体积0.5~1.5%（v/v）无患子提取液，根灌黄芪。使用剂量为100l~1000l/亩。
22.无患子提取液制备方法：将无患子种皮烘干粉碎，加水提取，60℃提取2小时，提取3次，过滤，将滤液浓缩至与无患子重量比为4:1，即得。
23.采用该微生物制剂种植的黄芪，芒柄花苷的含量提高了100%以上，毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷及黄芪皂苷i的含量提高了50%以上。
附图说明
24.图1为毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷对照品溶液hplc图（峰1毛蕊异黄酮苷，峰2芒柄花苷），该对照品溶液采用试验例4（1）项下对照品溶液制备方法配置而成。
25.图2为供试品溶液hplc图（峰1毛蕊异黄酮苷，峰2芒柄花苷），该供试品溶液采用试验例4（1）项下供试品溶液制备方法配置而成。
26.图3为黄芪甲苷和黄芪皂苷i对照品溶液hplc图（峰3黄芪甲苷，峰4黄芪皂苷i），该对照品溶液采用试验例4（2）项下对照品溶液制备方法配置而成。
27.图4为供试品溶液hplc图（峰3黄芪甲苷，峰4黄芪皂苷i），该供试品溶液采用试验
例4（2）项下供试品溶液制备方法配置而成。
实施方式
28.实施例1
29.枯草芽孢杆菌培养液0.5kg，蟹粉0.5kg，猪皮胶原蛋白1kg，氯化钠0.1kg，氨基酸10kg，果糖5kg，复合肥5kg（氮磷钾比例15:15:15）。
30.氨基酸为每120ml海带发酵液中添加一水硫酸锌40g，四水合七钼酸铵3g。
31.微生物制剂的制备方法：
32.（1）水250l，加入枯草芽孢杆菌培养液，蟹粉，胶原蛋白，氯化钠，鼓泡通气进行培养，培养温度控制在28℃，培养时间4天，获得发酵液；
33.（2）在步骤（1）发酵液中加入氨基酸，果糖，复合肥，继续鼓泡通气进行培养，培养温度32℃，培养时间3天，即得微生物制剂，备用。
34.实施例2
35.枯草芽孢杆菌培养液0.5kg、苏云金芽孢杆菌培养液0.5kg、地衣芽孢杆菌培养液0.5kg和巨大芽孢杆菌培养液0.5kg，蟹粉0.5kg，猪皮胶原蛋白1kg，氯化钠0.1kg，氨基酸10kg，果糖5kg，复合肥5kg（氮磷钾比例15:15:15）。
36.氨基酸为每120ml海带发酵液中添加一水硫酸锌40g，四水合七钼酸铵3g。
37.微生物制剂的制备方法：
38.（1）水1000l，加入枯草芽孢杆菌培养液，苏云金芽孢杆菌培养液、地衣芽孢杆菌培养液和巨大芽孢杆菌培养液，蟹粉，胶原蛋白，氯化钠，鼓泡通气进行培养，培养温度控制在28℃，培养时间4天，获得发酵液；
39.（2）在步骤（1）发酵液中加入氨基酸，果糖，复合肥，继续鼓泡通气进行培养，培养温度32℃，培养时间3天，即得微生物制剂，备用。
40.实施例3
41.枯草芽孢杆菌培养液0.3kg、苏云金芽孢杆菌培养液0.2kg、地衣芽孢杆菌培养液0.7kg和巨大芽孢杆菌培养液0.3kg，蟹粉1kg，猪皮胶原蛋白0.05kg，氯化钠0.05kg，氨基酸7kg，葡萄糖10kg，复合肥5kg（氮磷钾比例15:15:20）。
42.氨基酸为每100ml海带发酵液中添加一水硫酸锌20g，四水合七钼酸铵1g。
43.微生物制剂的制备方法：
44.（1）水1000l，加入枯草芽孢杆菌培养液，苏云金芽孢杆菌培养液、地衣芽孢杆菌培养液和巨大芽孢杆菌培养液，蟹粉，胶原蛋白，氯化钠，鼓泡通气进行培养，培养温度控制在32
±
2℃，培养时间4天，获得发酵液；
45.（2）上述发酵液中加入氨基酸，果糖，复合肥，继续鼓泡通气进行培养，培养温度28
±
2℃，培养时间3天，即得微生物制剂，备用。
46.实施例4
47.枯草芽孢杆菌培养液0.25kg、苏云金芽孢杆菌培养液0.5kg、地衣芽孢杆菌培养液0.25kg和巨大芽孢杆菌培养液0.5kg，蟹粉0.5kg，猪皮胶原蛋白0.5kg，氯化钠0.5kg，氨基酸1kg，蔗糖5kg，复合肥10kg（氮磷钾比例15:15:20）。
48.氨基酸为每100ml海带发酵液中添加一水硫酸锌20g，四水合七钼酸铵1g。
49.微生物制剂的制备方法：
50.（1）水1000l，加入枯草芽孢杆菌培养液，苏云金芽孢杆菌培养液、地衣芽孢杆菌培养液和巨大芽孢杆菌培养液，蟹粉，胶原蛋白，氯化钠，鼓泡通气进行培养，培养温度控制在32
±
2℃，培养时间4天，获得发酵液；
51.（2）上述发酵液中加入氨基酸，果糖，复合肥，继续鼓泡通气进行培养，培养温度28
±
2℃，培养时间3天，即得微生物制剂，备用。
52.试验例1菌种密度检测
53.对实施例1-4所得的微生物制剂进行菌种密度检测，结果如表1所示：
54.表1各实施例菌种密度
55.菌种密度（cfu/ml）实施例12.1
×
10
11
实施例21.9
×
10
11
实施例32.6
×
10
11
实施例48.7
×
10
10
56.由表1可知，实施例1-4所得微生物制剂具有非常高的菌体密度，均高于1
×
10
10
cfu/ml。
57.试验例2微生物制剂稀配
58.将所得微生物制剂用水稀释后加入无患子提取液，混合制得微生物制剂稀配液。稀配比例如表2所示：
59.表2微生物制剂液稀配比例
60.组别微生物制剂水无患子提取液实施例11l9l10ml实施例21l9l10ml实施例31l9l10ml实施例41l9l10ml
61.无患子提取液制备方法：将无患子种皮烘干粉碎，加水提取，60℃提取2小时，提取3次，过滤，将滤液浓缩至与无患子重量比为4:1，即得。
62.试验例3微生物制剂稀配液施用
63.选取大小相近的黄芪种苗，同一重茬地块随机选取9m*9m的样方，常规翻耕，施底肥后，根灌不同的微生物制剂稀配液，然后按照行距40cm摆放种苗，每组各种100棵黄芪苗，根据所需补水的情况每7~30天施用实施例1-4所得的微生物制剂稀配液，每株50ml左右。另设等量清水处理作为参照组，观察2年。
64.试验例4黄芪中有效成分含量测定
65.对试验例3所得黄芪进行毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪皂苷i和黄芪甲苷的含量测定。
66.（1）hplc-uv法测定毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷含量
67.c18色谱柱（250mm*4.6mm，5μm），流动相a：甲醇，流动相b：0.1%磷酸水溶液，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长：254nm。流动相洗脱比例如表3所示：
68.表3流动相洗脱比例
69.时间流动相a比例0~35min25%~60%35~45min60%
70.对照品溶液制备：
71.称取毛蕊异黄酮苷对照品和芒柄花苷对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成一定浓度的溶液，备用。
72.供试品溶液制备：
73.精密称取黄芪粉末4.0g，置于圆底烧瓶中，加入50ml甲醇，精密称重。加热回流3小时，放置室温，补足损失的液体质量，过滤，将溶液浓缩至干，用甲醇转移至5ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤即得。
74.（2）hplc-elsd法测定黄芪甲苷和黄芪皂苷i的含量
75.c18色谱柱（150mm*4.6mm，5μm），流动相a：乙腈，流动相b：水，流速为1.0ml/min，柱温30℃。elsd检测条件：漂移管温度90℃，空气流速2.8l/min。流动相洗脱比例如表4所示：
76.表4 流动相洗脱比例
77.时间流动相a比例0~8min30%~40%8~12min40%~45%12~14min45%14~16min45%~65%16~18min65%18~20min65%~30%
78.对照品溶液制备：
79.称取黄芪甲苷对照品和黄芪皂苷i对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成一定浓度的溶液，备用。
80.供试品溶液制备：
81.取黄芪粉末3g，置索氏提取器中加适量甲醇冷浸12h，加甲醇至150ml于80℃水浴加热回流6h，过滤，滤液减压浓缩至干，残渣加70%甲醇溶液至10ml量瓶中，并稀释至刻度，即得。
82.（3）含量测定结果
83.不同实施例所获得的样品的含量测定结果见表5：
84.表5毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪皂苷i和黄芪甲苷的含量测定结果（mg/g）
85.组别毛蕊异黄酮苷芒柄花苷黄芪皂苷i黄芪甲苷清水组0.310.190.760.78实施例1组0.490.291.041.11实施例2组0.480.421.191.25实施例3组0.490.391.211.18实施例4组0.470.381.151.21
86.（4）数据分析
87.与清水组相比，有效成分提升百分率如表6所示：
88.表6 与清水组相比，有效成分提升百分率
89.组别毛蕊异黄酮苷芒柄花苷黄芪皂苷i黄芪甲苷实施例1组58.1%52.6%36.8%42.3%实施例2组54.8%121.1%56.5%60.3%实施例3组58.1%105.3%59.2%51.2%实施例4组51.6%100.0%51.3%55.1%
90.由表6可知，相对于清水组，实施例1-4组均能明显提高黄芪中有效成分毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪皂苷i和黄芪甲苷的含量。
91.现有技术中提到枯草芽孢杆菌能够提高黄芪中毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷的含量，相对于实施例1组（单用枯草芽孢杆菌），实施例2-4组（合用枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌）在毛蕊异黄酮苷含量的提升幅度与实施例1组相当，对黄芪甲苷含量的提升幅度明显高于实施例1组。
92.本发明意外的发现，实施例2-4组对芒柄花苷和黄芪皂苷i含量的提升显著高于实施例1组。特别是对芒柄花苷含量的提升幅度是实施例1组的1.90~2.30倍，对黄芪皂苷i含量的提升幅度是实施例1组的1.39~1.54倍。
93.上述内容详细描述了本发明的优选实施方式。但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型。这些简单变型均属于本发明的保护范围。
94.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
95.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种微生物制剂在黄芪种植中的应用，其特征在于，所述微生物制剂中的菌种由枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌组成。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂在黄芪种植中提高黄芪中有效成分含量方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的有效成分为毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷i。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，分别将枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种至lb培养基中，30~32℃培养24~48h，获得枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌培养液；将培养液按一定比例配比使用，枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌培养液重量比为（0.5-5）：（0.5-5）：（0.5-5）：（0.5-5）。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌培养液重量比为1:1:1:1。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂中还包括虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述培养液与虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠、复合氨基酸、碳水化合物、复合肥的重量比为（0.1~1）:（0.1~10）：（0.01~1）：（0.01~9）：（1~50）：（1~20）：（1~10）。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂采用如下步骤制备：（1）将菌种培养液、虾蟹壳、胶原蛋白、氯化钠加入水中，混合，发酵温度25~35℃，发酵时间3~5天，鼓泡通气，获得发酵液；（2）将氨基酸、碳水化合物、复合肥加入到步骤（1）的发酵液中，发酵温度25~35℃，发酵时间3~5天，鼓泡通气，即得。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂采用如下方法施用：将所述微生物制剂用水稀释1~10倍，加入微生物制剂体积0.5~1.5%（v/v）无患子提取液，根灌黄芪。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的无患子提取液采用如下方法制备：将无患子种皮烘干粉碎，加水提取，60℃提取2小时，提取3次，过滤，将滤液浓缩至与无患子重量比为4:1，即得。

技术总结
本发明提供一种微生物制剂在黄芪种植中的应用，特别是在黄芪种植中提高黄芪中有效成分的含量方面的应用。微生物制剂中的菌种选自枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。采用该微生物制剂种植的黄芪，芒柄花苷的含量提高了100%以上，毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和黄芪皂苷I的含量提高了50%以上。上。上。


技术研发人员：靳颖华
受保护的技术使用者：内蒙古多肽科技有限责任公司
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/9