一株欧美葡萄孢及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株欧美葡萄孢及其应用。


背景技术：

2.杂草防治是农田生态系统中面临的重要问题，是农田生产过程中重要的环节之一。杂草的成长严重影响到农田作物和果蔬的生长发育，不仅与农作物争抢土壤中的营养物质(养分和水分)，还争夺空间资源和光照；同时也是田间病虫害传播和寄居的主要介质，杂草增加了农田管理的劳动成本；除此之外，杂草的群落演替加速且对环境的适应性极强，是影响作物产量和品质的主要生物因素。
3.目前，常用的除草方式为人工除草和化学防除两种。人工除草可以除去不同种属的杂草，也可以提高土壤透气性，但工作周期长，除草效率低，除草范围窄，对大面积作物田应用效率低；而化学除草剂的应用省时省力，提高了除草效率，且除草效果明显。上世纪初期日本研究学者发现使用2，4-d丁酯(2，4-butyl)、2-甲-4-氯(mcpa)和五氯酚钠分别对阔叶杂草和禾本科杂草均有防除效果，由此也开启了化学防除杂草的新篇章。至此，世界上约有600种化学除草剂可用于防除各种类型杂草，例如用草甘膦、双甘巴等药物来控制杂草的萌发和生长，但也改变了农田杂草的治理方式。化学除草剂的长期使用增加了杂草的抗药性和土壤农药残留量，杀死了大量有益昆虫，对生态环境造成严重危害，对人畜均造成不可逆转影响，因此，亟需寻求新的环保除草方法。近年来，随着生物源除草剂的高速开发研究，生物源除草剂加入综合杂草管理策略，防止抗药性杂草的持续发展。生物制剂是一种天然来源于生物体或其天然代谢物的产品，用于控制杂草而不使环境退化，而目前由于微生物源除草剂新型、绿色、高效、无污染等特点成为了当前杂草防除的研究热点。开发新的生防菌和微生物源除草剂，以代替传统人工除草、机械除草和化学除草，是非常必要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株欧美葡萄孢及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该欧美葡萄孢具有除草活性，对阔叶杂草反枝苋、密花香薷、冬葵和藜均有致病效果；对藜和反枝苋致病率达到100％，对密花香薷致病率达到75％，对冬葵致病率达到40％，且该菌株对作物蚕豆、豌豆、油菜、青稞和小麦均安全。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一株欧美葡萄孢(botrytis euroamericana)，所述欧美葡萄孢于2021年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23894。
7.本发明还提供上述的欧美葡萄孢或其发酵产物在制备微生物源除草剂中的应用。
8.本发明还提供一种微生物源除草剂，包括上述的欧美葡萄孢或其发酵产物。
9.本发明还提供上述的欧美葡萄孢或其发酵产物在杂草防治中的应用。
10.进一步地，所述杂草包括阔叶杂草。
11.进一步地，所述阔叶杂草包括反枝苋、密花香薷、冬葵或藜。
12.本发明还提供一种防治杂草的方法，其特征在于，包括对农田施用上述的欧美葡萄孢或微生物源除草剂，以防治杂草的步骤。
13.本发明还提供上述的欧美葡萄孢或其发酵产物在制备邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
14.本发明还提供一种邻苯二甲酸二丁酯的制备方法，包括对上述的欧美葡萄孢进行发酵培养，得到发酵液，再对所述发酵液进行萃取和纯化，得到所述邻苯二甲酸二丁酯的步骤。
15.进一步地，所述萃取采用的溶剂为乙酸乙酯。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.本发明从自然感病的巴天酸模叶片中分离得到一株具有除草活性的菌株hz-011，通过形态学、分子生物学和发育树构建，将菌株hz-011鉴定为欧美葡萄孢(botrytis euroamericana)。本发明研究发现菌株hz-011对阔叶杂草反枝苋、密花香薷、冬葵和藜均有致病效果；对藜和反枝苋致病率达到100％，对密花香薷致病率达到75％，对冬葵致病率达到40％，且该菌株对作物蚕豆、豌豆、油菜、青稞和小麦均安全。进一步研究发现，从菌株hz-011的发酵液中可以提取得到单体化合物邻苯二甲酸二丁酯，该单体化合物的除草活性在一定程度上解释了欧美葡萄孢具有除草活性的由来。本发明为开发微生物源除草剂提供了理论依据。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为菌株hz-011微观形态学；其中，a：hz-011正面；d：hz-011背面；b、c、e和f为不同视野下的显微镜镜检结果(包括hz-011的菌丝、分生孢子梗和分生孢子)；b和e中标尺均为2μm，c和f中标尺均为10μm；
20.图2为基于hy-011菌株its、g3pdh、hsp60和rpb2基因序列构建的系统发育树；
21.图3为菌株hz-011对盆栽杂草的致病性检测结果；其中，a:对反枝苋的致病力；b:对密花香薷的致病力；c:对冬葵的致病力；d:对藜的致病力；a-d中，第一行均为对照组，第二行均为实验组；
22.图4为杂草发病程度调查结果；
23.图5为菌株hz-011对作物的安全性检测结果；其中，a:蚕豆；b豌豆:；c:油菜；d:青稞；e:小麦；a-e中，第一行均为对照组，第二行均为实验组；
24.图6为4种萃取剂处理离体藜叶片的致病效果；其中，a和e表示二氯甲烷有机相和水相；b和f表示石油醚有机相和水相；c和g表示乙酸乙酯有机相和水相；d和h表示正丁醇有机相和水相；
25.图7为薄层层析馏分条带；其中，1-10分别为馏分b、e、f、g、h、l、m、n、o和p；
26.图8为具有除草活性馏分对藜叶片的致病效果；其中，a:馏分b；b:馏分e；c:馏分f；
d:馏分g；e:馏分h；a-e中，第一行均为对照组，第二行均为实验组；
27.图9为复合组分b3和复合组分e1对藜叶片的致病效果；其中，a:复合组分b3；b:复合组分e1；
28.图10为复合组分b3的hplc色谱图；
29.图11为复合组分e1的hplc色谱图；
30.图12为组分3对藜叶片的致病效果；第一行均为对照组，第二行均为实验组；
31.图13为单体化合物对藜叶片的致病效果；第一行均为对照组，第二行均为实验组。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.实施例1
38.1.菌株分离
39.本发明从自然感病的巴天酸模叶片中分离得到一株具有除草活性的菌株，命名为hz-011。
40.2.形态学和分子生物学鉴定
41.2.1方法
42.2.1.1形态学鉴定
43.将平板培养的菌株置于光学显微镜下观察，明确菌丝类型和孢子形态。对25℃条件下培养的菌株定期观察其菌落生长速度、菌落形态及色泽变化。结合《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。
44.2.1.2分子水平鉴定
45.按照dna提取试剂盒说明书中的操作步骤提取基因组dna，对its,g3pdh,hsp60和pb2基因进行pcr扩增，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，将pcr扩增产物送往上海生工生
物工程技术服务有限公司测序。利用获得的5.8s rdna序列在genbank的核酸序列库中进行同源性序列blast比对分析，选取不同相似度的序列，利用mega6.0软件进行系统发育分析，并采取邻位相接法(neighbor-joining,nj)构建系统发育树，确定hz-011菌株的分类地位。
46.2.2结果
47.2.2.1形态学鉴定：
48.在自然感病的巴天酸模叶片上分离得到的真菌hz-011由图1所示，在pda培养基上生长，菌落表面起初为白色，气生菌丝不发达，生长5d后，中心位置逐渐变深黄色；背面起初为白色，3d后渐变为橙黄色，生长10d后伴随着颗粒状物质的生长。分生孢子梗散生且无色，细胞顶端膨大成球形，上面着生许多小梗，分生孢子单孢呈卵圆形或者椭圆形，着生小埂上聚集成葡萄穗状。
49.2.2.2分子生物学鉴定：
50.对菌株hz-011的dna进行pcr扩增，经测序后选取了511bp(its)，906bp(g3pdh),1030bp(hsp60)和1159bp(rpb2)进行比对。选择与菌株hz-011its基因序列相似度》95％的前12个真菌用mega 6.0软件进行its系统进化发育树分析，本试验采取了邻位连接法构建系统进化树，见图2，结果显示菌株hz-011与botrytis euroamericana(100％)建立在同一个进化分支上，证明了菌株hz-011属于欧美葡萄孢菌(botrytis euroamericana)。
51.3.保藏
52.菌株hz-011已于2021年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23894。
53.实施例2
54.菌株hz-011对阔叶杂草反枝苋、密花香薷、冬葵和藜均有致病效果。对藜和反枝苋致病率达到100％；对密花香薷致病率达到75％；对冬葵致病率为40％，该菌株对作物蚕豆、豌豆、油菜、青稞和小麦均安全。
55.1.方法
56.(1)杂草的致病性
57.移栽田间5-6叶期、正常生长的反枝苋、密花香薷、冬葵和藜于花盆(φ＝15cm)中，室温(26
±
1℃)培养1周。菌株培养于pda平板上，培养7d后使用打孔器(φ＝8mm)获取菌饼，以菌量1块/50ml接种于pdb三角瓶中，在26℃181r
·
min-1
条件下培养7d。培养完成的发酵液使用灭菌的纱布过滤，并将孢子稀释为1.0
×
105cfu/ml的浓度。将孢子液倒入用75％酒精消毒的500ml喷壶，并加入1ml吐温20，喷雾接种到移栽的健康杂草植株上，接种量为30ml/盆。以无菌pdb培养液处理的杂草作为空白对照。每处理设置3次重复。接种后的杂草植株置于25℃条件的光照培养箱中光暗交替培养，使用jbx-3.5离心式工业加湿器保持相对湿度。
58.发病程度调查观察：7d后调查杂草发病程度并统计病级分布，按以下公式计算发病率和病情指数。发病程度分级如下，0级：叶片无任何病斑；1级：叶片上有病斑零星分布；2级：1/3～2/3叶片烂死；3级：2/3以上的叶片烂死；4级：叶片全部烂死。
59.[0060][0061]
(2)作物的安全性
[0062]
供试作物种植：将小麦、油菜、蚕豆、豌豆和青稞分别撒播于花盆(φ＝15cm)中，温室内培养。
[0063]
发酵液制备和接种：方法同杂草致病性过程中的步骤。发病程度调查：发病状况：ns表现无症状(无病斑，植株正常成长)；ls表现有轻微反应(叶片分布零星斑点，叶片轻微失绿，成长略受抑制)；ms表现中等感病(1/5～1/4的叶面积出现病斑，成长受抑制)；ss表现严重感病(1/4以上叶片面积出现病斑，成长受到严重抑制)。
[0064]
2.结果
[0065]
(1)杂草的致病性
[0066]
杂草接种菌株hz-011后，如图3和4显示，1d后，藜叶片出现病斑，叶缘卷曲，病情指数为6.25％；反枝苋叶片萎蔫，叶缘干枯，病情指数为3.12％；冬葵叶片从根部往上的叶片逐渐开始发黄，病情指数为1.31％；密花香薷有零星小病斑，无明显萎蔫现象，病情指数为0％。4d后，藜有1/2的叶片萎蔫并且枯死，发病率达到51％；反枝苋接近2/3的叶片失绿并且呈褐色，部分叶片枯死，病情指数为31.25％；冬葵25％的叶片变黄色，病情指数为13.1％；密花香薷35％的叶片叶缘干枯，叶片产生褐色斑点，病情指数为17.50％。7d后，藜和反枝苋叶片全部死亡，病情指数为100％；冬葵只有40％的发病率，且症状为整片叶的一半发黄，病情指数为29.6％；密花香薷有75％的叶片枯死，病情指数为56.25％。
[0067]
(2)作物的安全性
[0068]
对作物接种菌株hz-011后，青稞，小麦，油菜，蚕豆和豌豆均无致病现象，如图5所示，作物长势和叶片颜色与对照相比，没有受到任何影响，表现没有反应(ns)，说明菌株hz-011对作物没有致病性，相对安全。
[0069]
实施例3
[0070]
1.供试菌株及靶标杂草
[0071]
供试菌株：菌株hz-011
[0072]
供试靶标：藜(chenopodium album l.)
[0073]
2.方法
[0074]
2.1菌株hz-011的发酵培养及发酵滤液的制备
[0075]
将试管保存的菌株hz-011于pda平板上活化，并在27℃条件下培养8d。并使用打孔器取菌饼(φ＝8mm)，以接种量50ml/块接种于灭好菌的pdb三角瓶，在27℃和180r/min条件下，摇床震荡培养7d。将发酵结束的发酵液于离心机中低温离心20min，去除菌丝体并收集上清液，以备使用。
[0076]
2.2菌株hz-011粗提物萃取剂的筛选
[0077]
选用不同极性大小的有机溶剂作萃取剂，如正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚，分别与菌株hz-011发酵滤液等体积萃取3次，静置6h后收集有机相。在45℃条件下，减压浓缩获取有机相粗品，以备试验。选用藜叶片作靶标，将其铺在9cm培养皿内的滤纸上，用甲醇溶解有机相粗品，并将溶解的粗品滴于叶片上，以纯甲醇作对照，每个处理重复三次。置于室温下培养，通过观察叶片卷曲、失绿、产生病斑等病害症状确定侵染程度。侵染程度分
级：-代表没有症状，+轻微症状，病斑面积占整个叶面积的15％左右；++代表中度症状，病斑面积占整个叶面积的16％～59％；+++代表重度症状，病斑面积占整个叶面积的60％～80％。
[0078]
2.3菌株hz-011粗提物的制备
[0079]
利用筛选到的萃取剂与菌株hz-011发酵滤液等体积萃取。使用2.2中的方法大量制备粗提物，用甲醇溶解粗提物，离心去除不溶物，再减压浓缩获得粗品。
[0080]
2.4硅胶柱层析
[0081]
(1)装柱(湿法装柱)
[0082]
首先将200-300目硅胶粉倒入烧杯中，加入适量极性低的石油醚，边搅拌边加硅胶，当呈现为无气泡透明的糊状为止。把搅拌好的硅胶液加入到玻璃柱(柱高120cm，直径5cm)中，并用塑料物体轻轻敲击柱体赶走生成的气泡，当硅胶液距离柱口15cm时停止装柱。静置24h后，用纯石油醚冲柱，流速为1滴/s，硅胶在柱内会缓缓下落，直到柱内硅胶静止不动时，表示玻璃柱内硅胶已紧实，停止冲柱。
[0083]
(2)上样
[0084]
将活性物质粗品用甲醇溶解，并加入硅胶粉使样品与硅胶粉充分混匀(甲醇：硅胶粉＝2:1)，再减压浓缩使样品吸附在硅胶粉上。将结块的样品研磨后加入玻璃柱中(上样高度5cm)，缓缓加入，使样品面保持平面且不能裸露于空气中。防止洗脱时，活性物质下降速度不一致。
[0085]
(3)洗脱
[0086]
打开下端活塞，保持洗脱剂流速1滴/s。洗脱梯度顺序为：石油醚：氯仿：乙酸乙酯(10:3:2)、氯仿：乙酸乙酯(8:7)、丙酮：乙酸乙酯(1:1)、二氯甲烷：甲醇(10:1)、二氯甲烷：甲醇(5:1)和二氯甲烷：甲醇(1:1)6种混合溶液洗脱，每瓶收集160ml。
[0087]
2.5薄层层析(tlc)
[0088]
(1)点样：将制备型hsgf254硅胶板(200
×
200mm，厚度0.4-0.5mm)用玻璃刀切割成2.5cm
×
5cm的小板，在距硅胶板底端1cm处画一条直线作为基线，在距离顶端0.5cm处画条直线作为顶线。使用玻璃点样毛细管(0.5
×
100mm)在基线上点样，重复多次，当在紫外灯下斑点显色为止。
[0089]
(2)展开：展开步骤需要在密闭的层析缸中进行，根据硅胶板的大小，选择不同的层析缸。选用洗脱混合溶液的比例作展开剂，根据显色情况轻微调节比例。展开剂比例依次为：石油醚：氯仿：乙酸乙酯(10:3:2)、氯仿：乙酸乙酯(8:7)、丙酮：乙酸乙酯(1:1)、二氯甲烷：甲醇(10:1)、二氯甲烷：甲醇(5:1)和二氯甲烷：甲醇(1:1)。需要注意的是，加入展开剂的量不能超过基线，也不能超过顶线。
[0090]
(3)紫外显色：展开剂使样品条带展开后，在紫外分析仪下选用254nm的波长显色，不同的条带代表不同的物质，并将条带相同的样品合并在一起。将合并的样品再次点样，展开和显色，将不同的条带用铅笔圈起来，作为一个馏分。
[0091]
(4)定量分析：将硅胶板上的条带连同硅胶粉一起刮下来，用少量的甲醇浸泡溶解，以备深测。
[0092]
2.6除草活性成份生物活性测定
[0093]
测定方法：采取新鲜无病害藜植株的叶片，用无菌水清洗干净，将其自然晾干。再
将叶片摆置于灭菌处理的培养皿(φ＝9cm)中，培养皿内铺有滤纸，用无菌水将其浸湿。每个馏分用甲醇溶解并稀释为100μg/ml，每片叶片滴加20μl做处理，以甲醇作对照，每个处理重复3次。置于25℃光照培养箱中光照培养，致病程度评价同方法2.2。
[0094]
2.7高效液相色谱分析(hplc)
[0095]
首先，选用c18反向分析柱(4.6mm
×
250mm)探索分离条件，以流速1ml
·
min-1
，检测波长220nm，流动相初始比例为甲醇:水＝95:5作为探索条件，甲醇和水作为流动相，然后以5％为梯度依次降低甲醇比例提高水的比例，直到探索出峰型最佳的流动相比例为止。最后选择最佳流动相比例作为制备条件对粗提物进行分离制备。再选用c18反向制备柱(30mm
×
250mm)，以分析探索的最佳条件为基础，继续探索分离制备的最佳条件，对分析得到的色谱峰进行收集，以备活性组分深测。
[0096]
2.8hz-011纯品结构鉴定
[0097]
核磁共振分析：单体化合物用合适的氘代溶剂进行溶解，转移至核磁管中进行核磁共振检测。获得1h-nmr、
13
c-nmr核磁共振谱，通过
13
c核和氢核的化学位移值，查询微谱数据，经过比对初步判断化合物的结构。
[0098]
质谱分析化合物的分子量：用色谱甲醇溶解待测样品，注入到质谱仪中，选用电喷雾电离子源(esi)进行质谱的检测，计算化合物的分子量。
[0099]
核磁(nmr)分析条件：布鲁克advance iii 400mhz，溶剂使用氘代甲醇，氢谱共振频率400mhz，分辨率0.244532hz，碳谱共振频率100mhz，碳谱分辨率0.733596hz。
[0100]
利用化合物氢谱、碳谱、质谱等谱图的解析，结合文献调研，确定化合物的结构。利用chemdraw 12.0进行结构绘制。
[0101]
2.9单体化合物活性验证
[0102]
参照2.6的方法，对分离获得的单体化合物除草活性进行再次验证。每处理3次重复。
[0103]
3.结果
[0104]
3.1菌株hz-011粗提物萃取剂的筛选
[0105]
如图6和表1所示，用甲醇溶解二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的有机相和水相来处理离体叶片藜，结果显示，二氯甲烷有机相对藜叶片没有致病症状，而水相对藜叶片产生小病斑，说明用二氯甲烷做萃取剂，活性物质在水相中；石油醚有机相对藜叶片有轻微的发黄现象，而石油醚的水相使叶片产生小病斑，说明活性物质在水相中；乙酸乙酯的有机相使藜叶片产生大病斑，而乙酸乙酯水相对藜叶片不产生致病症状，说明活性物质在有机相中；正丁醇的有机相和水相对藜叶片都没有致病效果，说明正丁醇不能萃取出菌株hz-011的除草活性物质。因此，对藜叶片致病效果顺序乙酸乙酯相》石油醚相》二氯甲烷相》正丁醇相，所以选择乙酸乙酯为最佳萃取剂。
[0106]
表14种极性有机溶剂粗提物对藜离体叶片的致病性
[0107][0108]
注:-代表没有症状；+轻微症状，病斑面积占整个叶面积的15％左右；++代表中度症状，病斑面积占整个叶面积的16％～59％；+++代表重度症状，病斑面积占整个叶面积的
60％～80％。
[0109]
3.2菌株hz-011粗提物的制备
[0110]
将纯化好的菌株hz-011以菌饼的形式接入无菌pdb溶液中发酵，在25℃，160r/min的条件下，摇床震荡培养5d。再将发酵液经过离心收集上清液，与乙酸乙酯等体积萃取3次，将有机相减压浓缩获得除草活性粗品66.29g。
[0111]
3.3硅胶柱层析
[0112]
如表2所示，选用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷和甲醇6种不同极性的有机溶剂，将其互相混合配制成不同极性大小的洗脱剂，对除草活性粗提物使用硅胶柱层析分离，获得了6个不同的样品。
[0113]
表2柱层析色谱洗脱剂比例体系配比选择
[0114][0115]
3.4薄层层析(tlc)
[0116]
对6个不同的样品通过薄层层析展开，如图7所示，获得了b、e、f、g、h、l、m、n、o和p10个不同的馏分，对紫外灯显色的物质经过rf值(rf＝0.2-0.8)计算分析如表3所示，有26个复合组分满足定性分析，分别是b1、b2、b3、e1、e2、e3、l1、l2、h1、h2、h3、o、n1、n2、n3、g1、g2、g3、g4、g5、m1、m2、f1、f2、f3和p。
[0117]
表3各组分的薄层层析分析
[0118][0119]
3.5除草活性成份生物活性测定
[0120]
对10种馏分活性测定，结果显示，如图8所示，馏分b使藜叶片失绿，产生黄色病斑，表现出重度症状；馏分e使藜叶片发黄，部分叶片产生黄褐色病斑，表现出重度症状；馏分f使藜叶片主脉附近产生褐色病斑，且部分叶片萎蔫，表现出重度症状；馏分g使部分藜叶片失绿、发黄并产生黄色病斑，表现出中度症状；馏分h使叶片产生病斑，部分叶片呈萎蔫状，表现为中度症状；而其他馏分l、m、n、o、p对藜叶片均不致病。
[0121]
对馏分b、e和g中的11个组分进行活性测定，结果显示，复合组分b3和e1表现出致病效果，如图9所示，复合组分b3使藜叶片产生黄色病斑，组分接触到的部位全部死亡，表现出重度症状；复合组分e1使藜叶片产生黄褐色病斑，叶片有轻微失绿的现象，表现出轻微症状；其他9个复合组分b1、b2、e2、e3、g1、g2、g3、g4、g5均为表现出致病效果，而馏分g中的活性物质可能是未被展开剂展开，有待继续探索。
[0122]
3.6高效液相色谱分析(hplc)
[0123]
使用高效液相色谱(p230p大连依利特分析仪器有限公司)，用c18反向分析柱(4.6mm
×
250mm)，甲醇-水体系做流动相，样品浓度20μg/ml，流速1ml
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min-1
，进样量10μl，检测波长220nm，在这些条件下对复合组分b3进行探索，结果如图10所示，在流动相甲醇：水＝80:20的条件下，获得19的大小不同的峰，第13个峰信号值最高，为2644.624mau，峰面积最大，为75651.626mau.s，将此峰命名为“组分1”，以备活性测定。
[0124]
用高效液相色谱对复合组分e1进行分析，当流动相甲醇：水＝30:70时，结果如图11所示，获得12个峰，第3个峰峰面积最大，为8733.237mau.s，峰高385.507mau，将其命名为“组分2”；第9个峰，峰型对称，峰面积1683.267mau.s，峰高56，544，将其命名为“组分3”。
[0125]
对组分1，2，3进行活性测定，结果如图12所示，组分3使部分叶片失绿发黄，少部分
叶片产生病斑，且有萎蔫症状；组分1和组分2对藜叶片没有致病效果。
[0126]
3.7单体化合物结构鉴定
[0127]
质谱显示分子离子峰[m+h]+279.1550，[m+na]+301.1356推断分子式为c
16h22
o4。1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ：7.48(2h，dd，j＝8hz，4hz)，7.25(2h，d，j＝8hz，4hz)，4.07(4h，t，j＝7hz)，1.45(4h，m)，1.22(4h，m)，0.71(6h，t，j＝2hz)。
13
c-nmr(400mhz，cdcl3)δ：166.78，131.91，130.31，128.21，64.69，30.04，18.61，13.05。通过对1h-nmr、
13
c-mnr、esims、eims等波谱数据的分析对比，确定化合物名称为邻苯二甲酸二丁酯，结构式如下：
[0128][0129]
3.8单体物质活性验证
[0130]
通过单体化合物对藜萌发作用测定，结果表明该化合物对藜离体叶片的致病性。接种后叶片出现黄化、萎蔫现象(图13)。
[0131]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一株欧美葡萄孢(botrytiseuroamericana)，其特征在于，所述欧美葡萄孢于2021年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.23894。2.一株如权利要求1所述的欧美葡萄孢或其发酵产物在制备微生物源除草剂中的应用。3.一种微生物源除草剂，其特征在于，包括权利要求1所述的欧美葡萄孢或其发酵产物。4.一株如权利要求1所述的欧美葡萄孢或其发酵产物在杂草防治中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述杂草包括阔叶杂草。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阔叶杂草包括反枝苋、密花香薷、冬葵或藜。7.一种防治杂草的方法，其特征在于，包括对农田施用权利要求1所述的欧美葡萄孢或权利要求3所述的微生物源除草剂，以防治杂草的步骤。8.一株如权利要求1所述的欧美葡萄孢或其发酵产物在制备邻苯二甲酸二丁酯中的应用。9.一种邻苯二甲酸二丁酯的制备方法，其特征在于，包括对权利要求1所述的欧美葡萄孢进行发酵培养，得到发酵液，再对所述发酵液进行萃取和纯化，得到所述邻苯二甲酸二丁酯的步骤。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述萃取采用的溶剂为乙酸乙酯。

技术总结
本发明公开了一株欧美葡萄孢及其应用，涉及生物技术领域。所述欧美葡萄孢于2021年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.23894。本发明从自然感病的巴天酸模叶片中分离得到一株具有除草活性的欧美葡萄孢(Botrytiseuroamericana)。本发明研究发现该欧美葡萄孢对阔叶杂草反枝苋、密花香薷、冬葵和藜均有致病效果；对藜和反枝苋致病率达到100％，对密花香薷致病率达到75％，对冬葵致病率达到40％，且该菌株对作物蚕豆、豌豆、油菜、青稞和小麦均安全。青稞和小麦均安全。青稞和小麦均安全。


技术研发人员：朱海霞 马永强 程亮
受保护的技术使用者：青海省农林科学院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/9