一种突变型TaqDNA聚合酶及其应用的制作方法

一种突变型taq dna聚合酶及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种突变型taq dna聚合酶及其应用。


背景技术：

2.土壤是微生物栖息的主要场所，微生物在土壤中的分布及生命活动与土地肥力、植物营养、植物病害等情况密切相关，因此利用微生物形态、培养特性、生理生化特性和遗传特性对土壤微生物进行研究和分类鉴定是对土壤环境研究的重要方法。但是由于各种条件的限制85％～99％的土壤微生物很难被分离鉴定，使得土壤微生物研究受到一定制约。利用传统方法进行微生物学的分离纯化检测方法会极大的低估样品中微生物的多样性，也会忽略一些含量极低的微生物种类。因此，基于pcr技术的分子生物学方法应用与土壤生物的研究弥补了传统微生物学研究的不足。
3.土壤理化性质极为复杂，粗提取的土壤dna中含有腐植酸、酚类化合物和重金属离子等抑制性污染物。其中，腐植酸和腐植酸类似物的抑制作用又最为明显，它们通过干扰裂解、降解核酸或非特异性吸附和抑制酶活性的方式干扰正常的pcr扩增体系。在土壤dna的提取过程中，腐植酸会与dna紧密结合，很难分离，并且，极低浓度的腐植酸(0.08μg/ml)足以抑制dna聚合酶的活性。因此减少腐植酸的抑制作用，成为了研究土壤微生物多样性研究的关键。目前有很多对于土壤中和水环境的活性污泥细菌种类的研究，需要通过荧光定量pcr的技术方法进行准确的定性和定量。荧光定量pcr准确性的前提是活性污泥中的微生物尽可能地被抽提完全、模板质量好、纯度较高，以及其中存在的抑制物被尽可能地去除干净。
4.为了实现土壤中样品dna的扩增，通常需要技术手段来除去样品中的腐植酸残留，腐殖酸的去除工艺较为繁琐，目前去除腐殖酸的有效方法主要为膜技术、离子交换、催化氧化法等，这些方法的缺点在于需要引入其他步骤，并且在去除过程中可能引入其他污染。所以在研发土壤直扩产品时，一般通过稀释的方法可以降低腐植酸浓度，同时dna浓度也会收到稀释而影响实验结果。其他去除腐植酸的提取方法则十分复杂且效果得不到保证。为了简化实验过程，通过对dna聚合酶的改造可以使酶本身耐受较高浓度腐植酸的抑制作用，从而降低对dna样品的制备要求，也在可以将改造后的酶应用于宏基因组直扩实验中，简化实验步骤，提高实验效率。
5.taq dna聚合酶是从火山温泉中分离得到的一种水生栖热菌(thermus aquaticus)中发现的，因此具有极高的热稳定性，能够承受pcr过程中的热变性步骤，成为了第一代热稳定性dna聚合酶。由于其稳定性、易表达纯化、强大的扩增效率等特征，taq dna聚合酶被广泛应用于荧光定量pcr中。但野生型taq dna聚合酶对于腐植酸的耐受力较弱，在较低浓度的腐植酸存在的情况下聚合酶活性被显著抑制，最终影响实验结果。
6.因此，为了实现dna样本在复杂环境中的扩增，需要对野生型taq dna聚合酶进行一系列改造，使其在环境耐受程度、稳定性、催化活力等方面的性能进一步提高。
dna聚合酶(thermus aquaticus)。通过兼并引物的设计，将705位的丙氨酸随机突变为任意氨基酸。通过蛋白表达与筛选，筛选出两种突变体蛋白，均可以耐受pcr体系中的高浓度腐植酸，分别为a705e与a705k，其氨基酸序列分别如seq id no.3和seq id no.5所示，基因序列分别如seq id no.4和seq id no.6所示。
27.本发明的有益效果如下：
28.本发明突变型taq dna聚合酶通过在野生型taq dna聚合酶上对a705位点进行了氨基酸替换改变了聚合酶的构象，在同等条件下的扩增效率、扩增长度等指标均有所提升，同时提高了taq dna聚合酶对于腐植酸及腐植酸类似物的耐受能力，可以耐受较高浓度的腐植酸，将腐植酸的耐受能力由5ng/μl提升至25ng/μl以上且依然保有较高的酶活，对于土壤微生物提取物的扩增能力有了极大的提升，在土壤微生物多样性的检测、环境致病微生物的监测等领域有重大价值。另外，本发明突变型taq dna聚合酶可以实现复杂样本中的dna扩增实验，也可以直接应用于dna直扩实验中。
附图说明
29.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
30.图1为野生型taq dna聚合酶(wt)与突变体taq酶在腐殖酸的胁迫下进行的压力筛选的结果图，其中：泳道m：plus ii dna marker(transgen biotech)；泳道1：正常体系中wt的pcr产物；泳道2：体系中含有10ng/ul腐植酸的wt的pcr产物；泳道3：体系中含有30ng/ul腐植酸的wt的pcr产物；泳道4：体系中含有40ng/ul腐植酸的wt的pcr产物；泳道5：体系中含有50ng/ul腐植酸的wt的pcr产物；泳道6：正常体系中突变体taq酶的pcr产物；泳道7：体系中含有10ng/ul的腐植酸的突变体taq酶的pcr产物；泳道8：体系中含有30ng/ul的腐植酸的突变体taq酶的pcr产物；泳道9：体系中含有40ng/ul的腐植酸的突变体taq酶的pcr产物；泳道10：体系中含有50ng/ul的腐植酸的突变体taq酶的pcr产物。
31.图2为野生型taq dna聚合酶(wt)与突变型taq dna聚合酶a705e和a705k进行纯化后的page胶图。
32.图3为纯化后的野生型taq dna聚合酶(wt)与突变型taq dna聚合酶a705e和a705k在不同浓度的腐殖酸存在下，以hela细胞基因组dna为模板，对850kp长的基因进行扩增的琼脂糖电泳胶图。
具体实施方式
33.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
34.下述实施例中所用到的引物如表1所示：
35.表1引物序列
[0036][0037]
备注：n＝a、t、c或g。
[0038]
实施例1耐受腐殖酸的突变型taq dna聚合酶的获得
[0039]
通过检索ncbi和蛋白质数据库pdb，得到突变型taq dna聚合酶的蛋白质序列(seq id no.1所示，其基因序列包含seq id no.2所示的核苷酸序列)与结构，通过对序列与结构的分析与比对，选择705位点的丙氨酸(ala,a)进行饱和突变改造，形成包含有多种突变体质粒的文库，通过添加筛选压力对文库进行筛选，最终筛选出耐受腐植酸的突变型taq dna聚合酶。
[0040]
具体步骤如下：
[0041]
一、突变体文库的建立
[0042]
根据seq id no.2所示的序列设计引物，需在引物上添加限制性酶切位点ecor i/sal i。具体步骤为：以seq id no.2所示的序列为模板利用引物taq-1和taq-832进行pcr扩增，得到pcr产物。将pcr产物进行胶回收后用ecor i/sal i(购自transgen biotech)双酶切消化后，与线性化载体(pet-21a，ecor i/sal i双酶切消化)连接，转化至trans1-t1感受态(购自transgen biotech)中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行质粒提取，送测序正确后确定为pet-21a-taq克隆质粒。
[0043]
使用pet-21a-taq(包含seq id no.2所示的taq dna聚合酶的基因序列)克隆质粒作为模板，使用fastpfu pcrsupermix(transgen biotech)酶进行突变体文库的pcr扩增，获得pcr产物。其中，pcr扩增体系如表2所示，扩增循环步骤为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃2min，共30个循环，72℃10min，结束。
[0044]
表2突变体文库的pcr扩增体系(50μl体系)
[0045][0046]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶鉴定并胶回收。取2μl pcr产物加入50μl克隆感受态细胞中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天早上收集平板上的菌落，进行
质粒提取，即为构建完成的突变体文库质粒。
[0047]
二、突变体taq酶的表达
[0048]
将突变文库质粒转化至trans5α化学感受态细胞(购自transgen biotech)中，冰上孵育半小时后42℃热激30s，加入soc孵育1小时后涂平板，37℃过夜孵育。第二天分别收集单克隆至10ml lb(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l,nacl 10g/l)中，37℃220rpm悬浮培养至od600为0.6～0.8，加入iptg诱导5小时，3000rpm收集菌体。
[0049]
将菌体用500μl的10
×
taq pcr缓冲液悬起，超声破碎后收集上清液，即为突变体taq酶的粗提液。
[0050]
三、突变体taq酶的筛选
[0051]
将腐植酸梯度稀释至100ng/μl～500ng/μl，根据需要加入pcr扩增体系中作为筛选压力进行pcr扩增，获得pcr产物，对突变体taq酶进行筛选。以野生型taq dna聚合酶在相应pcr扩增体系获得的pcr产物为对照。
[0052]
检测所需的模板为pet-21a-taq(包含seq id no.2所示的taq dna聚合酶的基因序列)克隆质粒，pcr扩增体系如表3所示，扩增循环步骤为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃2min，共30个循环，72℃10min，结束。
[0053]
表3腐植酸筛选的pcr扩增体系(25μl体系)
[0054][0055]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶鉴定，结果如图1所示，结果显示突变型的taq dna聚合酶对腐殖酸的耐受明显高于野生型(wt)taq dna聚合酶对腐殖酸的耐受。将胶回收目标条带的克隆送测序，测序结果显示，经过腐殖酸的压力筛选，在705位置处，丙氨酸(wt，野生型)数量为19次，谷氨酸(a705e)出现37次，赖氨酸出现27(a705k))次，天冬氨酸出现13次，说明a705e与a705k可进行进一步的验证实验。而不经腐殖酸压力筛选的对照组，丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸等各出现2-3次，其重复的次数远小于经过腐殖酸压力筛选的个数。
[0056]
三、突变体酶对腐殖酸的耐受测试
[0057]
1、突变型taq dna聚合酶a705e和a705k的表达和纯化
[0058]
将编码taq dna聚合酶突变体a705e与a705k的基因分别进行双酶切(ecor i/sal i)后与线性化载体(pet-21a，ecor i/sal i双酶切消化)连接，转化至trans1-t1感受态(购自transgen biotech)中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行质粒提取，送测序正确后确定为突变体克隆质粒pet-21a-taqa705e
和pet-21a-taqa705k。将突变体克隆质粒转化至bl21(de3)感受态细胞(购自transgen biotech)后，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行扩大培养。将单菌落接种于10ml lb培养基中，37℃220rpm培养至od600为1左右，接种到1l的lb培养基中，37℃220rpm培养至od600为0.6左右，加入终浓度为0.5mm的iptg。37℃诱导5h，离心收集菌体。菌体破碎后离心收集上清液，即为taq dna聚合酶突变体的粗提液，将粗提液进行亲和层析，收集得到纯化后的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶检测，结果如图2所示，分别得到野生型taq dna聚合酶、突变型taq dna聚合酶a705e和a705k。
[0059]
2、突变体酶对腐殖酸的耐受能力的检测
[0060]
使用不同浓度腐殖酸添加到人基因组dna(hela细胞基因组dna)中，分别利用野生型taq dna聚合酶、突变型taq dna聚合酶a705e和a705k以hela细胞基因组为模板进行pcr扩增，得到pcr产物。其中，pcr扩增体系如表4所示，扩增循环步骤为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃2min，共30个循环，72℃10min，结束。野生型taq dna聚合酶在不含腐殖酸的条件下以hela细胞基因组dna为模板进行pcr扩增得到的pcr产物为阳性对照。
[0061]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶鉴定，结果如图3所示，突变型taq dna聚合酶a705e的抗腐殖酸抑制效果最好；突变型taq dna聚合酶a705k次之，野生型taq dna聚合酶最差。
[0062]
表4taq dna聚合酶对腐殖酸的耐受测试的pcr扩增体系
[0063][0064]
对这两种突变型taq dna聚合酶a705e和a705k进行了其他抑制物如血液、edta、蛋白酶等的扩增测试，没有发现耐受性的增强，说明突变型taq dna聚合酶a705e和a705k特异性的抗腐殖酸抑制。
[0065]
综上所述，最终得到能耐受腐殖酸的突变型taq dna聚合酶a705e和a705k，其中，所述a705e的氨基酸序列如seq id no.3所示，基因序列如seq id no.4所示；a705k的氨基酸序列如seq id no.5所示，基因序列如seq id no.6所示，可以用于包含腐殖酸或其类似物的样品的pcr领域。
[0066]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

技术特征：
1.一种突变型taq dna聚合酶，其特征在于，所述突变型taq dna聚合酶在seq id no.1所示的序列中，具有下述一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：a705e或a705k。2.根据权利要求1所述的突变型taq dna聚合酶，其特征在于，所述突变型taq dna聚合酶为如下任一所示的蛋白质：a1)由seq id no.3或seq id no.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)在seq id no.3或seq id no.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述突变型taq dna聚合酶活性的由a1)衍生的蛋白质；a3)与seq id no.3或seq id no.5所示的氨基酸序列具有80％及以上同一性的具有所述突变型taq dna聚合酶活性的蛋白质。3.编码权利要求1或2所述的突变型taq dna聚合酶的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述突变型taq dna聚合酶的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.6所示。5.包含权利要求3或4所述的核苷酸序列的重组载体。6.包含权利要求3或4所述的核苷酸序列的重组细胞。7.权利要求1或2所述的突变型taq dna聚合酶，权利要求3或4所述的核苷酸序列，权利要求5所述的重组载体，或，权利要求6所述的重组细胞在生物技术领域中的应用。8.权利要求1或2所述的突变型taq dna聚合酶，权利要求3或4所述的核苷酸序列，权利要求5所述的重组载体，或，权利要求6所述的重组细胞在pcr领域中的应用。9.权利要求1或2所述的突变型taq dna聚合酶，权利要求3或4所述的核苷酸序列，权利要求5所述的重组载体，或，权利要求6所述的重组细胞在包含腐植酸和/或腐植酸类似物的样品的pcr领域中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述样品中腐植酸的终浓度为不超过25ng/μl；优选的，为不超过20ng/μl。

技术总结
本发明公开一种突变型Taq DNA聚合酶及其应用。本发明首先公开了突变型Taq DNA聚合酶，其在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述一个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：A705E或A705K。本发明进一步公开了上述聚合酶在包含腐植酸和/或腐植酸类似物的样品的PCR领域中的应用。本发明聚合酶因构象改变可以耐受较高浓度的腐植酸，对于土壤微生物提取物的扩增能力有了极大的提升，在土壤微生物多样性的检测、环境致病微生物的监测等领域有重大价值。有重大价值。有重大价值。


技术研发人员：齐欣 宋新文 耿亮 辛文
受保护的技术使用者：北京全式金生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/9