肝癌药四碳链环己亚胺甲基尿石素A及其制备方法和应用

肝癌药四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于药物化学领域，具体涉及一种肝癌药四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其制备方法和应用。


背景技术：

2.自然界中诸如覆盆子、草莓、石榴等果实中富含鞣花鞣质，食用后经人体代谢产生具有广谱抗癌活性的尿石素类成分。如今尿石素类物质已经能被人工合成，降低了获取尿石素的成本，也为尿石素抗癌活性的研究奠定了基础。但是，尿石素因其特有的刚性骨架结构导致水溶性较差，理化性能不是很好，生物利用度低，成药性差，对癌细胞的增殖虽然有一定的抑制作用，且效果不尽如人意。


技术实现要素：

3.针对现有尿石素类物质生物利用度低、成药性差、对癌细胞的增殖抑制效果不佳的问题，本发明向尿素素类化合物中引入活性柔性结构，改变其理化性质，增强溶解性，从而提高其生物利用度及药理活性，获得了一种对人肝癌hepg2细胞增殖有良好抑制效果的化合物—四碳链环己亚胺甲基尿石素a。
4.第一方面，本发明提供四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐，四碳链环己亚胺甲基尿石素a具有式(i)所示的化学结构式：
[0005][0006]
式(i)中的环己亚胺基团可提升四碳链环己亚胺甲基尿石素a的水溶性和生物利用度，使得四碳链环己亚胺甲基尿石素a对人肝癌hepg2细胞的增殖抑制作用显著优于治疗肝癌一线药物索拉非尼和母体化合物甲基尿石素a。
[0007]
在上述技术方案的基础上，药学上可接受的盐为盐酸盐，四碳链环己亚胺甲基尿石素a的药学上可接受的盐具有式(ⅱ)所示的化学结构式：
[0008][0009]
盐酸盐进一步增加四碳链环己亚胺甲基尿石素a在水中的溶解度，提升药物的生物利用度。
[0010]
第二方面，本发明提供一种制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，包括以下步骤：
[0011]
使间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸在碱性条件下反应，获得甲基尿石素a；
[0012]
使甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷发生烷基化反应，得到溴丁烷化甲基尿石素a；
[0013]
使溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺进行氨基化反应，得到四碳链环己亚胺甲基尿石素a。
[0014]
甲基尿石素a母环为刚性结构，结构中只有一个酚羟基可作为反应位点对其进行修饰或改造，而环己亚胺不能与其直接发生反应；本发明利用1,4-二溴丁烷与甲基尿石素a母环上的酚羟基反应、然后与环己亚胺反应，从而将甲基尿石素a母环和环己亚胺拼合起来，1,4-二溴丁烷形成的柔性碳链同时缓解了甲基尿石素a母环刚性结构导致的水溶性较差。
[0015]
作为上述技术方案的优选，间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸的摩尔比为2：1；甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷的摩尔比为1：2；溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺的摩尔比为1：1.1～1.2。
[0016]
作为上述技术方案的优选，使间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸在碱性条件下反应的反应条件为：反应溶剂为氢氧化钠水溶液，反应温度为70～80℃。
[0017]
作为上述技术方案的优选，使甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷发生烷基化反应的反应条件为：反应溶剂为含碳酸钾的丙酮，反应温度为60～65℃。
[0018]
作为上述技术方案的优选，使溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺进行氨基化反应的反应条件为：反应溶剂为含碳酸钾的乙腈，催化剂为碘化钾，反应温度为80～85℃。
[0019]
第三方面，本发明提供一种药用组合物，包含上述四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐。
[0020]
第四方面，本发明提供四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐作为活性成分在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
[0021]
作为上述技术方案的优选，肿瘤为肝癌。
[0022]
本发明提供的四碳链环己亚胺甲基尿石素a对人肝癌hepg2细胞的增殖有着很强的抑制作用，且显著优于治疗肝癌一线药物索拉非尼和母体化合物甲基尿石素a；四碳链环己亚胺甲基尿石素a通过诱导hepg2细胞凋亡、阻滞hepg2细胞周期于g2/m期来抑制细胞增殖，从而发挥抗肝癌作用，因此有望进一步开发成为治疗肝癌的有效药物。
附图说明
[0023]
图1为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其盐酸盐合成线路图。
[0024]
图2为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a核磁共振氢谱图。
[0025]
图3为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a核磁共振碳谱图。
[0026]
图4为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a核磁共振质谱图。
[0027]
图5为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a和索拉非尼作用hepg2细胞48h后的抑制率及ic
50
。
[0028]
图6为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a作用hepg2细胞48h后的平板克隆形成实验结果图。
[0029]
图7为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a作用hepg2细胞48h后的hoechst33258染色结果图。
[0030]
图8为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a作用hepg2细胞48h后的流式细胞术检测凋亡结果图。
[0031]
图9为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a作用hepg2细胞48h后的流式细胞术检测周期结果图。
[0032]
图10为本发明四碳链环己亚胺甲基尿石素a作用hepg2细胞48h后的细胞周期分布比例图。
具体实施方式
[0033]
下面的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0034]
如图1所示，本发明提供的四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其盐酸盐的制备方法，具体如下：用间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸为原料合成甲基尿石素a，再以甲基尿石素a为母体，1,4-二溴丁烷为柔性碳链，通过烷基化反应得到溴丁烷化甲基尿石素a，再以环己亚胺为末端，通过氨基化反应得到四碳链环己亚胺甲基尿石素a，所得产物再与氯化氢-乙酸乙酯饱和溶液成盐，得到四碳链环己亚胺甲基尿石素a盐酸盐。该制备工艺较为简单，易于工业化生产。
[0035]
如无特殊说明，下述实施例中所使用的试验方法均为常规方法。
[0036]
如无特殊说明，下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
[0037]
实施例1四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其盐酸盐的合成方法
[0038]
(1)甲基尿石素a(化合物1)合成
[0039]
取2-溴-5-甲氧基苯甲酸40g、氢氧化钠15g溶于180ml蒸馏水中，搅拌至溶液澄清后，加入40g间苯二酚，于油浴70℃条件下搅拌反应90min，反应体系由无色透明变为深棕色。酯化反应完成后，再用恒压滴液漏斗向反应体系中逐滴加入72ml 5％cuso4，油浴80℃条件下回流反应2h，析出大量粉红色固体。反应完后，冷却至室温，分多次将反应产物加入1000ml烧杯中，加入900ml蒸馏水搅拌均匀，抽滤，反复清洗至滤液无色澄清，收集固体，放入真空干燥箱，再放入p2o5作为干燥剂，于55℃干燥过夜。干燥完成后用异丙醇重结晶，收集固体，于真空干燥箱中55℃真空干燥过夜，得黄色固体粉末12.8g。
[0040]
将步骤(1)所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱分析，结果如下：
[0041]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.22(s,1h),8.18(d,j＝9.0hz,1h),8.06(d,j＝8.7hz,1h),7.58(d,j＝2.8hz,1h),7.47(dd,j＝8.9,2.8hz,1h),6.81(dd,j＝8.7,2.4hz,1h),6.73(d,j＝2.4hz,1h),3.88(s,3h)。
[0042]
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ160.97,159.40,158.91,151.60,128.96,124.57,124.37,123.98,120.45,113.53,111.19,109.94,103.28,55.99。
[0043]
(2)溴丁烷化甲基尿石素a(化合物2)的合成
[0044]
取20g甲基尿石素a、35.71g 1,4-二溴丁烷、22.81g无水碳酸钾和240ml丙酮投入反应，反应体系开始为深黄色混悬液，然后逐渐变为淡黄色，24h后反应结束，待反应体系冷却至室温后，用旋转蒸发仪旋蒸除去丙酮，再加入适量二氯甲烷和硅胶，充分搅拌后炒样，随后用柱层析纯化分离，柱层析分离先用石油醚洗脱除去1,4-二溴丁烷等杂质，再依次用比例为石油醚：乙酸乙酯＝20:1、17:1、15:1、13:1的洗脱液进行梯度洗脱，并用tlc监测化合物的分离情况，将仅含有目标产物的洗脱液用旋转蒸发仪旋干，收集固体，最终得到5.48g白色固体粉末。
[0045]
将步骤(2)所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱分析，结果如下：
[0046]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(d,j＝9.0hz,1h),8.18
–
8.11(m,1h),7.59(d,j＝2.8hz,1h),7.49(dd,j＝8.9,2.9hz,1h),6.96(d,j＝7.9hz,2h),4.09(t,j＝6.3hz,2h),3.89(s,3h),3.63(t,j＝6.6hz,2h),2.04
–
1.91(m,2h),1.94
–
1.78(m,2h)。
[0047]
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ160.87,160.08,159.23,151.52,128.57,124.51,124.36,124.33,120.78,113.05,111.29,111.20,102.27,67.65,56.06,35.30,29.48,27.70。
[0048]
(3)四碳链环己亚胺甲基尿石素a(化合物3)的合成
[0049]
取200mg溴丁烷化甲基尿石素a、58mg环己亚胺、147mg无水碳酸钾、30ml乙腈以及少量碘化钾投入反应，反应体系刚开始为无色透明，最终变为深黄色，24h后反应结束，待反应体系冷却至室温后，用旋转蒸发仪旋蒸除去丙酮，再加入适量二氯甲烷和硅胶，充分搅拌后炒样，再进行柱层析分离化合物，先依次用体积比为石油醚：乙酸乙酯＝4:1、1:1的洗脱液梯度洗脱除去未反应完全的溴丙烷化甲基尿石素a，待流出的洗脱液用tlc检测无荧光点后，再用比例为乙酸乙酯：甲醇＝50:1的洗脱液进行洗脱，并用碘缸显色原理和tlc监测化合物分离情况，收集只含有目标产物的洗脱液并用旋转蒸发仪旋干，所得固体再用适量二氯甲烷充分溶解后过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，收集固体，最终得到105mg黄色固体粉末，该化合物分子式为c
24h29
no4。
[0050]
将步骤(3)所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱分析，结果如下：
[0051]1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.27(d，j＝9.0hz，1h)，8.22-8.14(m，1h)，7.61(d，j＝2.8hz，1h)，7.51(dd，j＝8.9，2.9hz，1h)，6.98(d，j＝8.1hz，2h)，4.09(t，j＝6.3hz，2h)，3.90(s，3h)，2.76(d，j＝35.0hz，6h)，1.86-1.50(m，12h)。
[0052]
13
c nmr(101mhz，dmso-d6)δ160.88，160.16，159.23，151.53，128.59，124.52，124.38，124.33，120.77，113.06，111.30，111.14，102.24，68.28，57.22，56.07，54.94，26.80，26.63，23.25。
[0053]
综上，经步骤(1)(2)(3)成功合成四碳链环己亚胺甲基尿石素a，合成路径为：
[0054][0055](i)①
naoh，70℃，1.5h
②
cu
2+
，80℃，2h(ii)1，4-二溴丁烷，k2co3，丙酮，62℃，24h(iii)k2co3，ki(催化量)，乙腈，82℃，24h
[0056]
(4)四碳链环己亚胺甲基尿石素a盐酸盐(化合物4)的合成
[0057]
将四碳链环己亚胺甲基尿石素a溶解在乙酸乙酯中制成饱和溶液，再缓慢加入过量氯化氢-乙酸乙酯溶液形成絮状沉淀，抽滤得到结晶固体，烘干后得到四碳链环己亚胺甲基尿石素a盐酸盐，该化合物分子式为c
24h30
no4cl。
[0058]
由步骤(4)成功制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a盐酸盐，制备路径为：
[0059][0060]
实施例2四碳链环己亚胺甲基尿石素a(下文用ud表示)的抗肝癌应用
[0061]
(1)细胞株
[0062]
人肝癌hepg2细胞，购自中国科学院上海细胞库。
[0063]
(2)ud抑制hepg2细胞增殖活性
[0064]
取处于对数生长期的hepg2细胞，调整细胞密度至8
×
104个/ml，接种到96孔板中，每孔100μl细胞悬液，共种9组，每组6个复孔，接种完成后放入细胞培养箱中培养，24h后取出给药，加入不同浓度(浓度为0、5、10、20、40、80、100、200、400μm)的ud、甲基尿石素a(mua，化合物1)和阳性药索拉非尼药液，继续培养，48h后取出加入含10％cck-8试剂的dmem基础培养液，放入37℃恒温电热培养箱中避光孵育，30min后用酶标仪在450nm处测定吸光度od值，并计算其抑制率和ic
50
。
[0065]
结果如5所示，在药液浓度仅为5μm时，ud对hepg2细胞的抑制率高达53.43％左右，而治疗肝癌药物索拉非尼抑制率仅为18.42％，母体化合物mua的抑制率仅为13.72％，同时索拉非尼的ic
50
值为7.76
±
0.12μm，mua的ic
50
值为11.36
±
0.92μm，ud的ic
50
值仅为4.66
±
0.12μm，这表明ud抑制hepg2细胞增殖活性显著优于阳性药索拉非尼和母体化合物mua。
[0066]
(3)平板克隆形成实验
[0067]
取处于对数生长期的hepg2细胞，调整细胞密度为1
×
104个/ml，吸取500μl接种到6孔板中，放入细胞培养箱中培养，再加入1.5ml培养基，24h后取出给药，加入不同浓度(浓度为0、2、4、10μm)的ud药液，继续培养，48h后取出换液，继续培养，每隔两天换液，6天后取
出6孔板固定细胞，然后用结晶紫染色液染色，最后用相机拍照并记录。
[0068]
结果如图6所示，ud随着浓度升高，对hepg2细胞抑制作用逐渐增强，克隆形成的细胞集落数和每个集落的细胞数越来越少，展现出很强的剂量依赖性。
[0069]
(4)hoechst33258染色
[0070]
取处于对数生长期的hepg2细胞，调整细胞密度为1.8
×
106个/ml，吸取100μl接种到6孔板中，再加入1.9ml培养基，放入细胞培养箱中培养，24h后取出给药，加入不同浓度(浓度为0、2、4、10μm)的ud药液，继续培养，48h后用hoechst33258染色液染色，立即用倒置显微镜进行荧光拍照并记录。
[0071]
结果如图7所示，从图中可看出对照组正常活细胞经染色处理后，整个细胞为蓝色，细胞形态呈圆形或椭圆形，细胞形态结构正常，给药组出现细胞凋亡，凋亡细胞的细胞核被染为亮蓝色，浓集于细胞中间或边部，有的也呈现为碎片状分布于细胞内部，随着药物浓度的增加，细胞核呈现为亮蓝色的细胞越多，凋亡细胞的所占比例也越大。
[0072]
(5)流式细胞术检测ud对hepg2细胞凋亡的影响
[0073]
取处于对数生长期的hepg2细胞，调整细胞密度为2.5
×
106个/ml，吸取100μl接种到6孔板中，再加入1.9ml培养基，放入细胞培养箱中培养，24h后取出给药，加入不同浓度(浓度为0、4、10、20μm)的ud药液，继续培养，48h后取出6孔板，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书前处理后，加入annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)染色液染色，然后1h内在流式细胞仪上完成检测。
[0074]
结果如表1、图8所示，与control组(ud浓度为0)相比，ud诱导的hepg2细胞凋亡率从7.5％增加到了13.83％、30.34％、61％，即ud显著诱导hepg2细胞发生凋亡。
[0075]
表1
[0076][0077]
(6)流式细胞术检测ud对hepg2细胞周期的影响
[0078]
取处于对数生长期的hepg2细胞，调整细胞密度为2.5
×
106个/ml，吸取100μl接种到6孔板中，再加入1.9ml培养基，放入细胞培养箱中培养，24h后取出给药，加入不同浓度(浓度为0、4、10、20μm)的ud药液，继续培养，48h后取出6孔板，按照细胞周期检测试剂盒说明书前处理后，加入pi/rnasea染色液染色，然后在流式细胞仪上完成检测。
[0079]
结果如表1、图9、图10所示，与control组相比，hepg2细胞在g2/m期的比例逐渐增多，分别从12.73％增加到16.36％、20.77％、32.4％，s期细胞逐渐减少，分别从34.45％减
少到30.61％、27.26％、18.16％，而g1/g0期细胞变化不明显，因此四碳链环己亚胺甲基尿石素a呈剂量依赖性诱导hepg2细胞在g2/m期停滞，从而抑制hepg2细胞增殖。
[0080]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐，其特征在于，四碳链环己亚胺甲基尿石素a具有式(i)所示的化学结构式：2.根据权利要求1所述的四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述药学上可接受的盐为盐酸盐，四碳链环己亚胺甲基尿石素a的药学上可接受的盐具有式(ⅱ)所示的化学结构式：3.一种制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，其特征在于，包括以下步骤：使间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸在碱性条件下反应，获得甲基尿石素a；使甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷发生烷基化反应，得到溴丁烷化甲基尿石素a；使溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺进行氨基化反应，得到四碳链环己亚胺甲基尿石素a。4.根据权利要求3所述的制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，其特征在于：间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸的摩尔比为2：1；甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷的摩尔比为1：2；溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺的摩尔比为1：1.1～1.2。5.根据权利要求3所述的制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，其特征在于：使间苯二酚和2-溴-5甲氧基苯甲酸在碱性条件下反应，反应条件为：反应溶剂为氢氧化钠水溶液，反应温度为70～80℃。6.根据权利要求3所述的制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，其特征在于：使甲基尿石素a与1,4-二溴丁烷发生烷基化反应的反应条件为：反应溶剂为含碳酸钾的丙酮，反应温度为60～65℃。7.根据权利要求3所述的制备四碳链环己亚胺甲基尿石素a的方法，其特征在于：使溴丁烷化甲基尿石素a与环己亚胺进行氨基化反应的反应条件为：反应溶剂为含碳酸钾的乙腈，催化剂为碘化钾，反应温度为80～85℃。8.一种药用组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐。9.权利要求1或2所述的四碳链环己亚胺甲基尿石素a及其药学上可接受的盐作为活性
成分在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。

技术总结
本发明公开了肝癌药四碳链环己亚胺甲基尿石素A及其制备方法和应用，四碳链环己亚胺甲基尿石素A对人肝癌HepG2细胞的增殖有着很强的抑制作用，且显著优于治疗肝癌一线药物索拉非尼和母体化合物甲基尿石素A，有望进一步开发成为治疗肝癌的有效药物。开发成为治疗肝癌的有效药物。开发成为治疗肝癌的有效药物。


技术研发人员：周本宏 田弥 赵丽蓉 兰昱
受保护的技术使用者：武汉大学人民医院（湖北省人民医院）
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/9