草果多糖及其制备工艺和在制备抗补体药物中的用途

1.本发明属于多糖药物技术领域，具体涉及三种具有抗补体活性的草果多糖及其制备工艺和在制备抗补体药物中的用途。


背景技术：

2.现有技术公开了补体系统是机体天然免疫防御的重要组成部分，在不同的调节蛋白参与中确保准确清除外来病原入侵的同时，为了防止对宿主组织的损伤，补体受到细胞表面调节器的严格控制，从而维持体内平衡。然而，补体系统的失调会导致过度炎症和多种疾病，如补体介导的免疫复合疾病、神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病等，近期多个临床研究表明补体系统的过度激活在新冠感染的发病机制和疾病严重程度中也起着关键作用。目前临床上广泛使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶吟等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药物并非专一的补体抑制剂，长期应用存在降低机体防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散、产生多种并发症和副作用等缺陷，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。
3.中药材中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，我国中药资源丰富，有许多中药对免疫系统有明显的调节作用，是寻找抗补体类药物前体的宝贵资源。多糖作为中药的主要活性成分，其安全低毒、生物相容性好，在疾病预防和临床新药研发方面有着广阔的应用前景，且中药多糖类抗补体活性物质通常具有多靶点、多途径和作用长效等优势，因此从中药材多糖中寻找新型补体抑制剂具有重要意义。特别药食同源类中药材中的多糖成分安全可靠、无毒并具有独特的免疫调节机制和潜在的抗补体活性。
4.草果是姜科豆蔻属多年生草本植物草果(amomum tsao-ko crevost et lemarie)的干燥成熟果实，别名草果仁、草果子，分布在亚洲的热带和亚热带地区，主产于我国广西和云南等地。其性温，味辛，归肺和胃经，具有燥湿温中、截疟除痰的功效，可用于治疗寒湿内阻、脘腹胀痛、痞满呕吐、疟疾寒热和瘟疫发热。草果因辛辣香味，除腥气，增进食欲等特点，作为食品调味中的“五香之一”，已被国家卫健委列入“药食同源”清单。此外，据国家卫健委和国家中医药管理局公开发布的新型冠状病毒感染诊疗方案显示，草果在轻型、普通型、重型新冠感染患者的中医治疗中均起到了重要作用，其用于治疗新冠感染的依据为明代著名瘟疫派医家吴又可撰写的《瘟疫论》，该书记载的中药方剂“达原饮”中草果作为臣药发挥着宣透伏邪的效果。但迄今尚未见有对草果中具有抗补体活性的均一多糖提取、纯化和分离工艺的报道。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的目的在于提供三种具有抗补体活性的草果多糖及其制备工艺和在制备抗补体药物中的应用。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.本发明提供一种草果多糖的制备工艺，主要包括以下步骤：
8.(1)取干燥草果，粉碎，以液料比20:1～40:1ml/g加水提取，提取温度为80～90℃，提取时间为80～120min，提取1-3次，过滤取滤液，浓缩，加95％乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，蒸干，研磨成粉，得草果粗多糖；
9.(2)取步骤(1)所得草果粗多糖，加蒸馏水溶解，上样至s-8型号的大孔吸附树脂层析柱中，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩，透析，干燥，研磨成粉，得纯化后草果多糖；
10.(3)取步骤(2)得到的纯化后草果多糖，加去离子水溶解，上样至deae-52纤维素层析柱中，依次使用0、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/l的nacl溶液梯度洗脱，根据苯酚-硫酸法显色反应合并相同多糖组分，分别收集0、0.3mol/l和0.4mol/lnacl溶液下洗脱得到的次级多糖组分，浓缩、透析、冷冻干燥，分别得到草果多糖atp-1、草果多糖atp-4和草果多糖atp-5；
11.(4)使用去离子水分别复溶步骤(3)得到草果多糖atp-1、草果多糖atp-4和草果多糖atp-5，分别上样至sephadex g-100层析柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，以0.5ml/min流速洗脱500～600min，根据苯酚-硫酸法显色反应合并相同多糖组分，浓缩、透析、冷冻干燥得草果多糖atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1。
12.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中浓缩至原体积的1/10～1/3，沉淀多糖具体过程为加95％乙醇至提取液乙醇终浓度为75～85％，静置24～48h。
13.基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中草果粗多糖的提取率为11.02
±
0.49％，多糖含量为26.73
±
1.52％。
14.基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中上样浓度为1～3mg/ml，上样体积为0.3～0.5bv；洗脱流速为1～3bv/h，洗脱体积为1～3bv。
15.基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中脱蛋白率、脱色率和多糖回收率分别为69.4
±
0.92％，78.21
±
1.12％和81.6
±
1.71％，纯化效果综合评分为73.45
±
0.32％，纯化后草果多糖的产率为26.31
±
0.41％。
16.基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中上样浓度为50～100mg/ml，上样体积为0.2～0.4bv，洗脱流速为1ml/min，每个梯度洗脱125～150min。
17.本发明另一方面提供上述制备工艺制得的草果多糖，所述的草果多糖包括草果多糖atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1。
18.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-1-1是中性多糖，分子量约为9.15
×
102kda；总糖含量为91.44
±
1.13％；不含糖醛酸，单糖组成显示其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:0.7:5.6:3.4:0.9。
19.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-4-1是酸性多糖，分子量约为2.46
×
104kda；总糖含量为94.54
±
1.87％，糖醛酸含量为39.59
±
0.22％，单糖组成显示其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:4.8:2.4:20.7:2.0:10.6:5.3:5.3。
20.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-5-1是酸性多糖，分子量约为2.69
×
105kda；总糖含量为95.81
±
1.33％；糖醛酸含量为33.23
±
0.19％，单糖组成显示其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:6.6:2.7:22.0:3.3:12.8:9.2:8.4。
21.本发明提供上述草果多糖在制备抗补体药物的应用。
22.基于上述技术方案，进一步地，所述的草果多糖atp-1-1、草果多糖atp-4-1和草果多糖atp-5-1对补体经典和旁路途径激活所致的细胞溶血均有明显的抑制，即有显著的抗补体作用。
23.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-1-1的抗补体活性为ch
50
＝6.28
±
0.23μg/ml，ap
50
＝45.33
±
0.16μg/ml，可与靶点c2、c4和factor b相互作用抑制补体激活；
24.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-4-1的抗补体活性为ch
50
＝7.39
±
0.36μg/ml，ap
50
＝8.62
±
0.46μg/ml，可与靶点c2、c4和factor b相互作用抑制补体激活。
25.基于上述技术方案，进一步地，草果多糖atp-5-1的抗补体活性为ch
50
＝4.47
±
0.44μg/ml，ap
50
＝9.41
±
0.83μg/ml，可与靶点c2、c4和factor b相互作用抑制补体激活。
26.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
27.本发明对草果进行提取、纯化、分离获得三个草果多糖atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1，经体外实验证实该三个草果多糖组分具有显著的补体抑制活性，并均可作用于c2、c4和factor b靶点，可作为抗补体药物进行开发研制，为补体相关的疾病的治疗提供物质基础。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
29.图1是草果多糖提取工艺优化单因素实验结果，其中，a：固液比，b：提取温度，c：提取时间。
30.图2是草果多糖纯化工艺优化单因素实验结果，其中，a：洗脱体积，b：流速，c：样品浓度，d：样品体积。
31.图3是草果多糖在deae-52色谱柱的分离洗脱曲线。
32.图4是atp-1(a)、atp-4(b)和atp-5(c)的sephadex g-100分离洗脱曲线图。
33.图5是atp-1-1(a)、atp-4-1(b)和atp-5-1(c)凝胶渗透色谱图。
34.图6是标准单糖(a)、atp-1-1(b)、atp-4-1(c)和atp-5-1(d)单糖组成液相色谱图。
35.图7是atp-1-1(a)、atp-4-1(b)和atp-5-1(c)在经典途径下作用靶点。
36.图8是atp-1-1(a)、atp-4-1(b)和atp-5-1(c)在旁路途径下作用靶点。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
38.实施例所用草果(amomum tsao-ko crevost et lemarie)购于安徽亳州中药材批发市场。
39.实施例1草果多糖的提取及其工艺优化
40.取干燥草果，粉碎过10目筛，热水回流提取2次，抽滤得草果多糖提取液。将水提取液浓缩至原体积的1/5，加95％乙醇至提取液乙醇终浓度为85％，静置24h后，离心，收集沉淀，水浴蒸干，研磨成粉，得草果粗多糖，苯酚硫酸法测多糖浓度，并计算多糖提取率。分别考察液料比(10:1～50:1ml/g)、提取温度(50～95℃)和提取时间(30～210min)对草果提取
率的影响。草果多糖提取单因素实验结果如图1所示，单因素实验下草果多糖的最佳提取条件为：液料比30:1ml/g，提取温度85℃和提取时间90min。
41.根据单因素实验结果，以单因素实验中的最优条件为0水平，最优条件前后两个条件分别为-1和1水平。利用design-expert.v8.0.6.1软件，采用响应面中box-behnken(bbd)设计17组响应面优化实验，以液料比x1、提取时间x2和提取温度x3为自变量，多糖提取率为响应值y，17组运行实验方案及实验结果见表1。
42.表1草果多糖提取响应面设计17组运行实验方案及结果
[0043][0044][0045]
根据17组响应面实验数据进行多元回归分析，得优化模型的二阶多项式方程为：y＝10.22+0.39
×
x1+0.055
×
x2+0.11
×
x3+0.040
×
x1×
x
2-0.12
×
x1×
x
3-0.060
×
x2×
x
3-2.28
×
x
12
[0046]-0.77
×
x
22-0.90
×
x
32
。
[0047]
草果多糖提取工艺优化的响应面二次模型的方差分析结果如表2所示，模型(model)的f值为382.38，p值《0.0001，表明该模型在提取率方面具有高度显著的响应。失拟项(lack of fit)的f值为0.30，p值为0.8233》0.05，表明拟合不足与纯误差无关，充分证明了模型的可靠性。此外，回归模型中的确定系数(r2)为0.9980，调整的确定系数(adj-r2)为0.9954，变异系数(c.v.％)为1.14，这表明草果多糖提取率的实验值和预测值高度相关。线性项系数(x1)和二次项系数(x
12
、x
22
和x
32
)对草果多糖的提取率有极其显著的影响(p＜0.0001)，线性项系数(x3)和交互项系数(x1x3)有着显著的影响(p＜0.05)，而其它系数(x2、x1x2和x2x3)的影响不显著(p＞0.05)。
[0048]
表2草果多糖提取工艺优化的响应面二次模型方差分析
[0049][0050][0051]
注：*表示p＜0.05，影响显著；**表示p＜0.01，影响非常显著；***表示p＜0.001，影响极其显著。
[0052]
通过使用design-expert software求解回归方程，获得所选各变量的最佳值。草果多糖的理论最佳提取工艺为液料比30.85:1ml/g、提取温度85.18℃和提取时间91.62min，预测提取率为10.23％。考虑实际工业化提取情况，最佳提取工艺参数为液料比30:1ml/g、提取温度85℃和提取时间100min，测得实际草果提取率为11.02
±
0.49％(n＝3)，与预测提取率无显著差异(p＞0.05)，表明该草果多糖最佳提取工艺稳定且可靠。
[0053]
实施例2草果多糖的纯化及其工艺优化
[0054]
(1)最佳纯化树脂的初筛
[0055]
采用静态吸附法从五种不同类型的大孔吸附树脂(s-8、ab-8、nka-ii、d101和x-5)中选择草果多糖最佳纯化树脂。取2mg/ml草果粗多糖溶液20ml，加到3g树脂中，在35℃恒温摇床中在下振荡30min，过滤，收集吸附溶液。再次向树脂中加入蒸馏水以进行解吸并振荡30min，收集解吸溶液。粗多糖溶液、吸附溶液和解吸溶液中的多糖浓度分别通过苯酚-硫酸法测定，计算吸附容量(ac，mg/g)、吸附速率(ae，％)和解吸速率(de，％)。测定结果如表3所示，s-8树脂对草果多糖的ac和ae均显著高于其它树脂(p《0.05)。s-8对草果多糖的de仅低于nka-ii。因此，s-8是纯化草果多糖的最佳大孔吸附树脂。
[0056]
表3草果多糖在不同型号的树脂中的吸附容量、吸附率和解吸率
[0057]
树脂ac(mg/g)ae(％)de(％)s-82.14
±
0.1342.18
±
2.1235.74
±
1.12
ab-81.68
±
0.1530.89
±
1.8725.52
±
1.45nka-ii0.83
±
0.1115.28
±
1.2448.33
±
1.34d1011.64
±
0.1230.30
±
1.5027.57
±
1.82x-51.95
±
0.1235.90
±
1.2327.70
±
1.64
[0058]
(2)纯化指标权重值的确定
[0059]
采用层次分析法计算各纯化指标的权重值，以纯化效果的综合评分为决策目标，多糖回收率(pr)、脱蛋白率(dp)和脱色率(dc)为决策标准，建立层次结构。基于九级评估规则构造成对矩阵构n(如下式1)，pr、dp和dc的优先级权重分别设置为w1、w2和w3，根据以下比较矩阵计算，求得决策标准pr、dp和dc的优先级权重值。
[0060][0061]
矩阵n的最大特征值为3.0059，一致性比cr＝0.0086《0.1，这表明一致性测试通过。将计算的初始权重系数归一化，得到w1,w2和w3的值分别为0.59、0.28和0.13。最后，可基于pr、dp和dc的权重计算草果多糖纯化效果的综合评分(如下式2)。
[0062]
综合评分(％)＝0.59
×
pr(％)+0.28
×
dp(％)+0.13
×
dc(％)(式2)
[0063]
(2)单因素及响应面实验优化纯化工艺参数
[0064]
采用动态吸附法纯化草果多糖。将粗多糖采用湿法上样逐渐滴入预处理好的大孔吸附树脂层析柱中(2.6cm
×
20cm)，用蒸馏水洗脱，收集洗脱溶液，水浴蒸干，研磨，得纯化后多糖，备用。分别采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法对纯化前后的多糖和蛋白质含量进行测定，并计算pr和dp色素的测定通过420nm处的吸光度值计算求得dc。分别考察洗脱体积(1～5bv)、洗脱流速(1～5bv/h)、上样浓度(1～5mg/ml)和体积(0.2～0.6bv)对草果粗多糖纯化的影响。单因素实验结果如图2所示，单因素实验下草果多糖的最佳树脂动态吸附纯化条件为：洗脱体积2bv，洗脱流速2bv/h，上样浓度2mg/ml和上样体积0.4bv。
[0065]
在单因素实验的基础上，采用响应面box-behnken(bbd)法设计29组响应面优纯化实验，以洗脱体积a、洗脱流速b、上样浓度c和上样体积d为自变量，纯化效果的综合评分y0为响应值，29组运行实验方案及实验结果见表4所示。
[0066]
表4草果多糖纯化响应面设计29组运行实验方案及结果
[0067]
[0068][0069]
根据29组响应面实验数据进行多元回归分析，得多项式回归方程为：y0＝+74.71+0.31
×
a+0.46
×
b-0.18
×
c+0.29
×
d-0.61
×a×
b+0.005
×a×
c-1.23
×a×
d+0.67
×b×c[0070]-0.13
×b×
d-1.63
×c×
d-4.98
×a2-3.67
×b2-5.11
×c2-9.57
×
d2[0071]
草果多糖的多元回归模型的方差分析和统计显著性结果如表5所示。回归模型的“model”的p值均《0.0001，这证明该模型具有显著意义。失拟项的p值为0.7480》0.05，表明误差可忽略。同时，r2、adj r2、pred r2和c.v.％值的p值分别为0.9961、0.9921、0.9838和0.70，pred r2和adj r2之间的差异为0.0083《0.1，揭示了草果多糖的预测纯化效果与实际纯化效果之间的良好相关性。相互作用系数(ad)和二次系数(a2、b2、c2和d2)对草果纯化的影响极其显著(p《0.0001)，线性系数(b)影响非常显著(p《0.01)，a、d、ab和bc变量的影响显著(p《0.05)，而c、ac和bd变量的影响不显著(p》0.05)。
[0072]
表5草果多糖纯化优化的响应面二次模型方差分析
1、atp-4-1和atp-5-1的分子量。将2.0mg/ml草果多糖溶液，过0.45μm微孔滤膜，注入shodex sugar ks-804糖柱(8.0mm
×
300mm)中。色谱条件为：进样量20μl，超纯水为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为50℃，示差折光检测器温度为35℃。在n2000 gpc色谱工作站上记录数据处理。根据不同分子量的右旋糖酐标准品绘制的三阶校准曲线为log mw＝35.47-26.01x+7.642x
2-0.78x3，将多糖在hpgpc色谱图上的保留时间代入校准曲线计算求得分子量。
[0081]
atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1的凝胶色谱图如附图5。进一步，计算求得atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1的分子量分别为9.15
×
102kda、2.46
×
104kda和2.69
×
105kda。
[0082]
(2)总糖和糖醛酸含量测定
[0083]
苯酚硫酸法测定总糖含量：atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1的总糖含量分别为91.44
±
1.13％、94.54
±
1.87％和95.81
±
1.33％。
[0084]
间羟联苯法测定检测糖醛酸含量：atp-1-1中未检测到糖醛酸，atp-4-1和atp-5-1的糖醛酸糖分别为39.59
±
0.22％和33.23
±
0.19％。
[0085]
(3)单糖组分测定
[0086]
采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)柱前衍生化法测定单糖组分。精密称取2mg草果多糖与1ml 2mol/l三氟乙酸(tfa)混合，密封反应水解2h。水解产物依次加200μl 0.5mol/l pmp甲醇溶液和0.3mol/l naoh溶液，70℃水浴1h，加200μl 0.3mol/l hcl，氯仿萃取三次，收集水层。以甘露糖(man)、氨基葡萄糖(glcn)、核糖(rib)、鼠李糖(rha)、葡萄糖醛酸(glca)、半乳糖醛酸(gala)、葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)，木糖(xyl)，阿拉伯糖(ara)和岩藻糖(fuc)为标准对照，衍生化步骤同上。将预处理好样品和标准品，过0.45μm微孔滤膜，进样。色谱条件：supersil ods2色谱柱(5μm，4.6mm
×
250mm)，柱温35℃，检测器波长245nm，流速0.8ml/min，进样量20μl，流动相为乙腈：0.2mol/ml磷酸盐缓冲溶液(ph 6.8)＝83:17(v/v)。
[0087]
测定结果显示如图6所示，atp-1-1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖五种单糖组成，摩尔比为1.0:0.7:5.6:3.4:0.9；atp-4-1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖八种单糖组成，摩尔比为1.0:4.8:2.4:20.7:2.0:10.6:5.3:5.3；atp-5-1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖八种单糖组成，摩尔比为1.0:6.6:2.7:22.0:3.3:12.8:9.2:8.4。
[0088]
实施例5经典途径补体抑制试验
[0089]
取6％绵羊红细胞用gvb-ca
2+
/mg
2+
(北京酷来搏技术有限公司，货号：dzsl0356-500ml)缓冲液定容至2
×
109cells/ml，与溶血素(南京森贝伽生物科技有限公司，货号：sbj-rxs10)1:1比例混匀，37℃水浴30min后离心去除未结合溶血素，得敏化绵羊红细胞(eas)备用。正常健康成年人血清(nhsp)作为本次经典途径的补体来源。精密称取草果多糖，以gvb-ca
2+
/mg
2+
缓冲液配制成不同浓度梯度，加入1:80稀释的nhsp，在37℃水浴预孵育30min后加入敏化羊红细胞，37℃水浴30min，离心，取上清液，置于96孔板，通过酶标仪在540nm下测定吸光度值，实验同时分别设置空白组、全溶血组、nhsp组、阴性药对照组(葡萄糖)及阳性药对照组(肝素)。计算草果多糖不同浓度梯度下的溶血抑制率，并用graphpad prism 6.0计算各组分的50％抑制溶血所需多糖的浓度(ch
50
值)。
[0090]
各分组中的各成分以及加入量为如下：
[0091]
空白组：40μl eas+260μl gvb-ca
2+
/mg
2+
；
[0092]
全溶血组：40μl eas+260μl ddw；
[0093]
nhsp组：150μl nhsp+40μl eas+110μl gvb-ca
2+
/mg
2+
；
[0094]
阴性对照组：30μl 1mmol/l的葡萄糖+150μl nhsp+40μl eas+80μlgvb-ca
2+
/mg
2+
；
[0095]
阳性对照组：12μl不同浓度的肝素+150μl nhsp+40μl eas+98μl gvb-ca
2+
/mg
2+
；
[0096]
给药组：6μl不同浓度的样品+150μl nhsp+104μl gvb-ca
2+
/mg
2+
+40μl eas。
[0097]
结果显示，atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1的ch
50
值分别为6.28
±
0.23μg/ml、7.39
±
0.36μg/ml和4.47
±
0.44μg/ml，三个草果多糖对补体经典途径激活都有显著的抑制活性(如表6所示)。
[0098]
实施例6旁路途径补体抑制试验
[0099]
正常健康人血清通过gvb-mg
2+
/egta缓冲液冰上孵育15min作为本次旁路途径的补体来源。取gvb-ca
2+
/mg
2+
缓冲液与新鲜兔血混匀，放入低温高速离心机离心5min，弃上清液，用阿氏液配制成2％兔红细胞(erab)。取2％兔红细胞用gvb-mg
2+
/egta缓冲液定容至5
×
108cells/ml后，加入nhsp和稀释后不同浓度的草果多糖，预孵育15min，加入兔红细胞(erab)在37℃水浴孵育30min，冰上冷却，终止反应，离心。分别取每管上清液于96孔板中稀释，在412nm下测定吸光度值，实验同时分别设置空白组、全溶血组、nhsp组、阴性药对照组(葡萄糖)及阳性药对照组(肝素)。计算草果多糖不同浓度梯度下的溶血抑制率。并计算各多糖组分的50％抑制溶血所需多糖的浓度(ap
50
值)。
[0100]
各分组中的各成分以及加入量为如下：
[0101]
空白组：25μl erab+75μl gvb-mg
2+
/egta；
[0102]
全溶血组：25μl erab+75μl ddw；
[0103]
nhsp组：10μl nhsp+25μl erab+65μl gvb-mg
2+
/egta；
[0104]
阴性对照组：1μl 1mmol/l的葡萄糖+10μl nhsp+25μl erab+64μlgvb-mg
2+
/egta；
[0105]
阳性对照组：11μl不同浓度的肝素+54μl nhsp+25μl erab+54μl gvb-mg
2+
/egta；
[0106]
给药组：1μl不同浓度的样品+10μl nhsp+25μl erab+64μl gvb-mg
2+
/egta。
[0107]
结果显示，atp-1-1、atp-4-1和atp-5-1的ap
50
值分别为45.33
±
0.16μg/ml、8.62
±
0.46μg/ml和9.41
±
0.83μg/ml，三个草果多糖对补体旁路途径激活都有显著的抑制活性(如表6所示)。
[0108]
表6草果多糖对补体激活的抑制作用
[0109]
草果多糖ch
50
(μg/ml)ap
50
(μg/ml)atp-1-16.28
±
0.2345.33
±
0.16atp-4-17.39
±
0.368.62
±
0.46atp-5-14.47
±
0.449.41
±
0.83肝素107.60
±
1.34122.80
±
2.34
[0110]
备注：所有数据表达为平均值
±
sd(n＝3)；ch
50
和ap
50
分别代表通过经典途径和旁路途径的50％溶血抑制浓度；肝素为阳性对照。
[0111]
实施例7补体系统作用靶点测定
[0112]
经典途径：选取经典途径下抑制溶血率接近100％时，所需草果多糖的最低浓度作为抗补体作用靶点的临界浓度，依次加入缺失血清(c2,c3,c4,c5,c9)和致敏羊红细胞(2.0
×
109cells/ml)，混合，37℃水浴孵育30min，4℃下离心机2000
×
g离心5min。每组分别设置
样品组、缺失血清组和阳性对照组。分别取每管上清液0.2ml于96孔板，在540nm处测定吸光度值。
[0113]
旁路途径：选取旁路途径下抑制溶血接近100％所需草果多糖的最低浓度作为抗补体作用靶点的临界浓度，依次加入缺失血清(c3,c5,c9,factor b,factor d,factor p)和兔红细胞(5.0
×
108cells/ml)孵育30min，冰上孵育5min终止反应，在4℃下1000
×
g离心3min。分别设置样品组、缺失血清组和阳性对照组。取30μl上清液转移至96孔板中，每孔再加入270μl gvb-mg
2+
/egta缓冲液进行稀释，412nm处测定吸光度值。
[0114]
实验同时设置缺失血清组、靶点检测组和全溶血组，减去相关对照组吸光度值后计算溶血率。以不同作用靶点为横坐标，相应的溶血率为纵坐标绘制柱形图。通过比较缺失血清组和待测样品处理过的靶点检测组溶血率的变化，即可判断样品对于补体成分c2、c3、c4、c5、c9、factor b、factor d、factor p有无拮抗作用。若其靶点检测组相比于缺失血清组的溶血能力不能恢复，则被认为样品作用于该缺失组分；若靶点检测组的溶血能力恢复，则表明样品不作用于该补体缺失组分。
[0115]
实验结果如附图7和8所示，没有一种补体耗竭血清能够独立地裂解红细胞，其溶血百分比不超过20％。在用atp-1-1治疗后，c2、c4和factor b的补体缺失血清没有恢复溶血性，而c3、c5、c9、factor d和factor p缺失血清显著恢复了溶血活性，表明atp-1-1通过作用于c2、c4和factor b靶点而阻断补体系统的激活级联，但不作用于靶向c3、c5和c9靶点。同理，atp-4和atp-5均也可作用于c2、c4和factor b靶点。
[0116]
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种草果多糖的制备工艺，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)取干燥草果，粉碎，以液料比20:1～40:1ml/g加水提取，提取温度为80～90℃，提取时间为80～120min，过滤取滤液，浓缩，加95％乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，得草果粗多糖；(2)取步骤(1)所得草果粗多糖，加蒸馏水溶解，上样至s-8型号的大孔吸附树脂层析柱中，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，干燥，得纯化后草果多糖；(3)取步骤(2)得到的纯化后草果多糖，加去离子水溶解，上样至deae-52纤维素层析柱中，依次使用0、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/l的nacl溶液梯度洗脱，根据苯酚-硫酸法显色反应合并相同多糖组分，分别收集0、0.3mol/l和0.4mol/lnacl溶液下洗脱得到的次级多糖组分，冷冻干燥，分别得到草果多糖atp-1、草果多糖atp-4和草果多糖atp-5；(4)使用去离子水分别复溶步骤(3)得到草果多糖atp-1、草果多糖atp-4和草果多糖atp-5，分别上样至sephadex g-100层析柱，以蒸馏水为洗脱溶剂进行恒定洗脱，根据苯酚-硫酸法显色反应合并相同多糖组分，冷冻干燥得草果多糖atp-1-1、草果多糖atp-4-1和草果多糖atp-5-1。2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(1)中浓缩至原体积的1/10～1/3，沉淀多糖具体过程为加95％乙醇至提取液乙醇终浓度为75～85％，静置24～48h。3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中上样浓度为1～3mg/ml，上样体积为0.3～0.5bv；洗脱流速为1～3bv/h，洗脱体积为1～3bv。4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中上样浓度为50～100mg/ml，上样体积为0.2～0.4bv；洗脱流速为1ml/min，每个梯度洗脱125～150min。5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中洗脱流速为0.5ml/min，洗脱时间为500～600min。6.权利要求1-5任一项所述的制备工艺制得的草果多糖，其特征在于，所述的草果多糖包括草果多糖atp-1-1、草果多糖atp-4-1和草果多糖atp-5-1。7.权利要求6所述的的草果多糖，其特征在于，草果多糖atp-1-1是中性多糖，分子量约为9.15
×
102kda；总糖含量为91.44
±
1.13％；由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:0.7:5.6:3.4:0.9。8.权利要求6所述的的草果多糖，其特征在于，草果多糖atp-4-1是酸性多糖，分子量约为2.46
×
104kda；总糖含量为94.54
±
1.87％，糖醛酸含量为39.59
±
0.22％，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:4.8:2.4:20.7:2.0:10.6:5.3:5.3。9.权利要求6所述的的草果多糖，其特征在于，草果多糖atp-5-1是酸性多糖，分子量约为2.69
×
105kda；总糖含量为95.81
±
1.33％；糖醛酸含量为33.23
±
0.19％，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1.0:6.6:2.7:22.0:3.3:12.8:9.2:8.4。10.权利要求6-9任一项所述的草果多糖在制备抗补体药物中的应用。

技术总结
本发明公开了草果多糖及其制备工艺和在制备抗补体药物中的用途，属于多糖药物技术领域，本发明从药食同源类药材草果中分离得到三个具有抗补体活性的草果多糖组分ATP-1-1、ATP-4-1和ATP-5-1，经实验证实所述的草果多糖对补体激活均有显著的抑制作用，并均可同时作用于C2、C4和Factor B靶点，可进一步作为活性成分，制备新型抗补体药物。制备新型抗补体药物。制备新型抗补体药物。


技术研发人员：李镐 周微 胡政宇 孙金凤 金龙 段元祺
受保护的技术使用者：延边大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/9