一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途

一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及一种抗菌肽，具体涉及一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5及其制备方法和用途。


背景技术：

2.抗菌肽(amps)是一类小分子多肽(含10～60个氨基酸)，其富含正电荷和疏水性氨基酸，一般只具有二级结构。抗菌肽几乎以各种形式存在于所有的生物体中，是组成生物先天免疫的重要部分，因此又被称为抗微生物肽或宿主防御肽。
3.抗菌肽具有广谱的抗菌活性，主要体现在抗细菌、抗真菌和抗病毒等微生物；抗菌肽还有抗炎、免疫调节活性以及对癌细胞的毒性等生物学活性。抗菌肽由于其独特的破膜杀菌机制，使其不易产生耐药性，加之其无免疫原性和对真核细胞较低的毒性，使得抗菌肽有望成为抗生素的替代品，以解决耐药性等问题。
4.目前获取抗菌肽的方法有生物提取、化学合成和异源表达，然而，抗菌肽的天然提取产量低，采用化学合成成本昂贵，通过基因工程技术大量表达是开发、生产抗菌肽的有效方法，且近些年分子生物学和dna重组技术的发展也为抗菌肽的基因工程化提供了良好的技术支持。
5.相对于原核表达系统来说，作为真核表达系统的毕赤酵母表达系统具有更多优势：毕赤酵母发酵营养要求低、成本低、能够高密度发酵且产量高，生产工艺简化，可以确保重组的抗菌肽活性较接近于天然状态，大大提高了抗菌肽的产量和商业的规模化生产，为寻找和开发抗生素的有效替代品提供了新的研究策略。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5及其制备方法和用途，该重组表达的抗菌肽spcru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。
7.为了达到上述目的，本发明提供了一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5，该抗菌肽spcru5的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明的另一目的是提供所述的抗菌肽spcru5的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明的另一目的是提供用于扩增所述的编码基因的引物对，该引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
10.本发明的另一目的是提供含有所述的编码基因的重组载体。
11.优选地，载体选用ppic9k。
12.本发明的另一目的是提供含有所述的重组载体的重组菌。
13.优选地，菌选用毕赤酵母。
14.本发明的另一目的是提供所述的抗菌肽spcru5的制备方法，该方法包含：
15.(1)以比目鱼肠道基因组dna为模板，采用如权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得抗菌肽spcru5的编码基因；
16.(2)表达载体ppic9k用限制性核酸内切酶ecorⅰ和notⅰ进行双酶切，再用c112重组连接酶连接后转化至感受态细胞中，测序验证正确后，得到重组表达质粒ppic9k-spcru5；
17.(3)将测序正确的重组表达质粒ppic9k-spcru5用限制性核酸内切酶sal i进行线性化处理，电转化至毕赤酵母x33中用g418抗生素进行筛选，获得毕赤酵母表达抗菌肽spcru5重组菌株；
18.(4)通过甲醇诱导表达，获得高表达稳定性的抗菌肽spcru5。
19.本发明的另一目的是提供所述的抗菌肽spcru5在抑菌方面的用途，该抗菌肽spcru5对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和白色念珠菌中任意一种或两种以上的菌均具有抑制作用。
20.本发明的另一目的是提供所述的抗菌肽spcru5在作为制备抗细菌感染治疗药物或畜牧业生产中的抑菌添加剂方面的用途。具体地，该抗菌肽spcru5对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和白色念珠菌中任意一种或两种以上的菌均具有抑制作用。
21.本发明的来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5及其制备方法和用途，具有以下优点：
22.本发明通过宏基因组学技术获得一株比目鱼肠道的基因组，并通过保守序列分析得到抗菌肽spcru5及其核苷酸序列，通过基因工程技术首次实现该抗菌肽spcru5在毕赤酵母x33中的表达，重组表达的抗菌肽spcru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。
23.本发明的抗菌肽spcru5对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌均有不同的抑菌活性，其中对产气荚膜梭菌的抑菌圈均达到20mm以上。
附图说明
24.图1为本发明抗菌肽spcru5编码基因的pcr扩增验证电泳图；
25.图2为本发明表达载体ppic9k双酶切电泳图；
26.图3为本发明重组载体ppic9k-spcru5阳性克隆验证电泳图；
27.图4为本发明重组表达抗菌肽spcru5对大肠杆菌k88抑菌圈图；
28.图5为本发明重组表达抗菌肽spcru5对金黄色葡萄球菌抑菌圈图；
29.图6为本发明重组表达抗菌肽spcru5对铜绿假单胞菌抑菌圈图；
30.图7为本发明重组表达抗菌肽spcru5对产气荚膜梭菌抑菌圈图；
31.图8为本发明重组表达抗菌肽spcru5对白色念珠菌抑菌圈图；
32.图9为本发明抗生素卡那霉素不同浓度对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌抑菌圈图；
33.图10为本发明抗生素氨苄青霉素不同浓度对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌抑菌圈图。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实验例1来源于比目鱼肠道宏基因组的抗菌肽spcru5基因的获得
36.1、比目鱼肠道微生物宏基因组dna的提取
37.抗菌肽spcru5编码基因来源于本实验室保存的比目鱼肠道微生物宏基因组，利用sds-溶菌酶法提取其宏基因组dna，其宏基因组dna的提取步骤具体如下：
38.(1)取比目鱼适量的小肠和胃内容物样品置于1.5ml离心管中，加入1ml无菌水吹打均匀，12000rpm离心5min，弃上清液；
39.(2)加入300μl裂解液(购买自：赛默飞世尔科技公司，ripa裂解和提取缓冲液，货号：89900)、0.5m edta 50ml、5mnacl 5ml、20％sds(十二烷基硫酸钠)25ml加入20ml无菌水，重悬；
40.(3)加入33μl溶菌酶(赛默飞世尔科技公司，溶菌酶溶液(50mg/ml)，货号：90082)(10mg/ml)37℃保温2h；
41.(4)加入110μl 10％sds母液，65℃孵育10min；
42.(5)加入异戊醇：等体积的tris-饱和酚：氯仿(体积比为1：25：24)的混合液，轻轻混匀，静置10min，12000rpm离心8min(抽提一次取上清液)；
43.(6)加入2.5倍体积无水乙醇沉淀溶液，静置10min，12000rpm离心8min，弃上清液；
44.(7)用70％乙醇冲洗两次(第一次离心洗涤)，自然风干，加入100μl te缓冲液(包含10mm tris-hcl、1mm edta，ph＝8.0)，所得的宏基因组dna于-20℃保存备用。
45.2、设计抗菌肽spcru5的编码基因的扩增引物
46.设计抗菌肽spcru5的编码基因扩增引物spcru5f和spcru5r，通过pcr扩增获得抗菌肽spcru5的编码基因序列，扩增引物spcru5f和spcru5r如下所示：
47.上游引物spcru5 f(seq id no.3)：
48.gctgaagcttacgtagaattccagttcggtggttccgattg；
49.下游引物spcru5 r(seq id no.4)：
50.aaggcgaattaattcgcggccgcgcgaccaaacacaccaccg。
51.扩增模板为比目鱼肠道微生物宏基因组dna，其pcr扩增反应体系为：rtaq酶0.5μl、10x buffer 2.5μl、dntp 2μl、dna模板1μl、spcru5f 0.5μl、spcru5r 0.5μl和ddh2o 18μl，总体积为25μl。
52.扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec(2～4，设置30个循环)；72℃，10min；4℃，30min。
53.获得的pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳验证，获得377bp的条带(含44bp的同源臂，参见图1)，pcr产物经胶回收后获得本发明的来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5的编码基因，见序列seq id no.1。
54.实验例2抗菌肽spcru5重组质粒的构建
55.质粒ppic9k用限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ进行双酶切，再用c112重组连接酶(购买
自诺唯赞生物科技股份有限公司)将质粒ppic9k酶切后的纯化产物与目的基因的纯化产物连接，再用热击法转化至e.coli dh5α感受态细胞中，具体实验步骤如下：
56.(1)重组连接
57.重组连接体系包含：经过上述双酶切后的质粒ppic9k 1μl、目的基因2μl、重组酶exnaseⅱ(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)1μl、ce buffer 2μl和ddh2o，总体积为10μl。
58.(2)转化
59.从超低温冰箱拿出e.coli dh5α感受态细胞放在冰上，把10μl上述重组连接产物加入到100μl e.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激60sec立即拿出，冰浴5min；加入500μl无抗生素的lb液体培养基，于37℃，180r/min孵育1h；孵育结束，7000r/min，离心3min，获得悬浮液；取100μl该悬浮液涂布在有氨苄青霉素钠盐(浓度100mg/ml)的lb平板上，37℃过夜培养。
60.(3)筛选与鉴定
61.在超净工作台挑取5～10个重组子单菌落于500μl氨苄青霉素钠盐(浓度100mg/ml)的lb培养基中，37℃，180r/min培养3～4h至菌液浑浊，进行菌落pcr扩增(采用ppic9k的上下游引物：5aox、3aox进行扩增)，pcr产物用1％的琼脂糖进行核酸电泳验证条带大小是否正确，挑选正确的编号进行测序，测序正确后获得重组质粒ppic9k-spcru5。
62.(4)保种
63.将含有正确重组表达质粒ppic9k-spcru5的重组e.coli dh5α/ppic9k-spcru5加30％的甘油保存于-80℃。
64.实验例3毕赤酵母表达抗菌肽spcru5重组菌的构建
65.毕赤酵母表达抗菌肽spcru5重组菌的构建过程，具体如下：
66.(1)提取重组表达质粒ppic9k-spcru5，并用限制性核酸内切酶进行线性化处理。重组表达质粒用限制性核酸内切酶salι进行单酶切，酶切体系为：重组表达质粒ppic9k-spcru5120μl、10x h buffer 15μl、salι7μl和ddh2o8μl，总体积为150μl。体系配好后在37℃水浴锅反应3.5h，加入300μl冰冻无水乙醇和40μl醋酸钠溶液，-20℃静置24h沉降质粒；
67.(2)13000r/min冷冻离心15min，弃上清，再加500μl冰冻无水乙醇洗脱，13000r/min冷冻离心15min，弃上清挥发无水乙醇，获得线性化载体，加入20μl预热的ddh2o溶解质粒备用；
68.(3)取100μl x33感受态细胞加入步骤(2)中制备好的线性化载体中混匀放在冰上备用，得到混合菌液；
69.(4)将120μl上述混合菌液加到电转杯中，在1500v、时间4.5ms条件下电转；
70.(5)在经步骤(4)的混合液中加入400μl含1mol/l山梨醇的yepd液体培养基，静置5min复苏；
71.(6)把经步骤(5)复苏的溶液涂布在含1mol/l山梨醇的yepd培养基，30℃培养48h；
72.(7)加入1ml含yepd液体培养基刮取平板上的菌株，并稀释涂在含g418(遗传霉素，浓度0.8mg/ml)的yepd平板上筛选阳性转化子，30℃培养2～4d；
73.(8)随机挑取单菌落至yepd平板上，30℃继续培养3～4d；
74.(9)采用水煮法提取平板上的酵母基因组，用抗菌肽spcru5基因的上下游引物进
行pcr验证，将确定获得正确的毕赤酵母重组菌株x33/ppic9k-spcru5的平板放于4℃冰箱保存。
75.实验例4重组抗菌肽spcru5在毕赤酵母中的诱导表达
76.重组抗菌肽spcru5在毕赤酵母中的诱导表达过程，具体如下：
77.(1)将保存的重组菌株x33/ppic9k-spcru5用牙签挑取到有2ml bmgy培养基，在30℃、180r/min培养48h；
78.(2)4000r/min离心10min，用2ml bmmy培养基悬浮，在30℃、180r/min培养48h；
79.(3)8000r/min离心10min，收集上清液，用于测定抑菌活性，该重组抗菌肽spcru5的氨基酸序列如seq id no.2所示。
80.实验例5重组抗菌肽spcru5抑菌活性的测定
81.重组抗菌肽spcru5抑菌活性的测定，具体如下：
82.(1)将测试菌株大肠杆菌k88(采用液体培养基lb)、金黄色葡萄球菌(采用液体培养基lb)、铜绿假单胞菌(采用液体培养基lb)、产气荚膜梭菌(采用液体培养基rcm)、白色念珠菌(采用液体培养基pdb)接种于相应的液体培养基进行活化；
83.(2)用0.9％的生理盐水稀释测试菌株，使得菌液浓度接近0.5麦氏比浊管的浓度(1
×
108cfu/ml)；
84.(3)在培养皿中放置孔直径为7.8mm的牛津杯，倒入含有2％琼脂的固体培养基；
85.(4)凝固后，将步骤(2)稀释的菌液按照1％的接种量加入含有1.5％琼脂的固体培养基中，混合均匀后倒入步骤(3)中的培养皿中，待凝固后然后取出牛津杯；
86.(5)将上述实验例4诱导表达收集得到的上清液吸取200μl加入孔中，37℃正置过夜培养，第二天观察其抑菌圈大小；并选用实验室常用抗生素(卡那霉素、氨苄青霉素)作为阳性对照。
87.采用的卡那霉素(50mg/ml)的配制：溶解500mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。以十倍稀释法、二倍稀释法依次稀释至终浓度为：50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，吸取200μl加入孔中，37℃正置过夜培养，第二天观察其抑菌圈大小。
88.采用的氨苄青霉素(100mg/ml)的配制：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。以十倍稀释法、二倍稀释法依次稀释至终浓度为：50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，吸取200μl加入孔中，37℃正置过夜培养，第二天观察其抑菌圈大小。
89.重组抗菌肽spcru5抑菌活性的测定结果，具体如下：
90.用微生物菌落分析仪测量抑菌圈的大小，结果显示均有较好的抗菌活性。抗菌肽spcru5-18对大肠杆菌k88平均抑菌圈为15.60mm，对金黄色葡萄球菌平均抑菌圈为15.86mm，对铜绿假单胞菌平均抑菌圈为16.50mm，对产气荚膜梭菌平均抑菌圈为23.24mm，对白色念珠菌平均抑菌圈为15.20mm。卡那霉素的终浓度为50μg/ml时抗大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽spcru5，终浓度为25μg/ml时抑菌效果不如抗菌肽spcru5，而当其终浓度为12.5μg/ml时，抑菌活性大大降低，抑菌效果要比抗菌肽spcru5差得多，甚至没有抑菌活性。氨苄青霉素只有在终浓度为50μg/ml时对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌表现出抑菌活性，与抗菌肽spcru5抑菌效果相当，当其终浓度为25μg/ml时就已经完全失去了抑菌活性。
91.随着抗生素的残留及耐药菌株的出现，抗菌肽的广谱活性、独特的破膜杀菌机制
以及不易产生耐药性，使得抗菌肽作为一种医用抗感染治疗药物及畜牧业生产中的添加剂具有广阔的应用前景。
92.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽spcru5，其特征在于，该抗菌肽spcru5的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.如权利要求1所述的抗菌肽spcru5的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.用于扩增如权利要求2所述的编码基因的引物对，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。4.含有如权利要求2所述的编码基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，载体选用ppic9k。6.含有如权利要求4或5所述的重组载体的重组菌。7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，菌选用毕赤酵母。8.如权利要求1所述的抗菌肽spcru5的制备方法，其特征在于，该方法包含：(1)以比目鱼肠道基因组dna为模板，采用如权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获得抗菌肽spcru5的编码基因；(2)表达载体ppic9k用限制性核酸内切酶ecorⅰ和notⅰ进行双酶切，再用c112重组连接酶连接后转化至感受态细胞中，测序验证正确后，得到重组表达质粒ppic9k-spcru5；(3)将测序正确的重组表达质粒ppic9k-spcru5用限制性核酸内切酶sali进行线性化处理，电转化至毕赤酵母x33中用g418抗生素进行筛选，获得毕赤酵母表达抗菌肽spcru5重组菌株；(4)通过甲醇诱导表达，获得高表达稳定性的抗菌肽spcru5。9.如权利要求1所述的抗菌肽spcru5在抑菌方面的用途，其特征在于，该抗菌肽spcru5对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和白色念珠菌中任意一种或两种以上的菌均具有抑制作用。10.如权利要求1所述的抗菌肽spcru5在作为制备抗细菌感染治疗药物或畜牧业生产中的抑菌添加剂方面的用途。

技术总结
本发明公开了一种来源于比目鱼肠道的抗菌肽SpCru5及其制备方法和用途，该抗菌肽SpCru5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过宏基因组学技术获得一株比目鱼肠道的基因组，并通过保守序列分析得到抗菌肽SpCru5及其核苷酸序列，通过基因工程技术首次实现该抗菌肽SpCru5在毕赤酵母X33中的表达，重组表达的抗菌肽SpCru5依然保持抗菌活性，并且抗菌谱广，对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。对革兰氏阳性和阴性菌均有抑菌活性。


技术研发人员：黄遵锡 宋婧楠 苗华彪 赵香帅 王璐
受保护的技术使用者：云南师范大学
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/9