一种构建孕期过表达CYP11A1小鼠动物模型的方法及应用

一种构建孕期过表达cyp11a1小鼠动物模型的方法及应用
技术领域
1.本发明是一种构建孕期过表达cyp11a1小鼠动物模型的方法及应用，具体涉及一种孕期过表达cyp11a1小鼠动物模型的构建方法，及其在用于后代具有自闭症行为的相关应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, asd）又称自闭症或孤独症，是儿童最常见的神经发育障碍性疾病之一，以社会交往及交流障碍、兴趣狭窄、刻板与重复行为为主要特点。近年来，国内外流行病学调查显示asd发病率呈明显递增趋势，且根据世界卫生组织的研究估计，世界上约0.76%的儿童患有asd。在世界范围内，asd已超过儿童肿瘤、白血病、艾滋病、糖尿病发生总和，给社会和家庭带来了巨大的经济压力。目前为止，asd发病机制仍不明确，可能受环境环境、遗传、生物化学等多重因素影响。
3.胎盘是孕期高度特化的器官，它不仅作为一道天然屏障，为胎儿阻挡部分病菌和有害物质的入侵，也是胎儿和母体进行营养物质和代谢废物交换的场所。此外，胎盘也能够分泌多种激素和生长因子，以维持正常妊娠过程，并调节胎儿的生长和发育。在正常妊娠过程中，胎盘滋养层能够分泌多种类固醇激素，参与对母体生理机能和胎儿生长发育的调节。其中cyp11a1编码胆固醇侧链裂解酶p450scc，催化胆固醇生成孕烯醇酮，是所有类固醇激素合成的第一步。在某些环境致畸物，孕期药物、激素和遗传易感性的作用下，cyp11a1的表达可以被上调，从而影响滋养层细胞的类固醇代谢和生理功能，甚至子代的发育等。
4.公开号为il231861a的以色列发明专利在评估不育症和推测其后代患有自闭症谱系障碍风险的方法中，已明确记载到cyp11b1和cyp11b2，及其候选家族成员cyp11a1、cyp27b1的异常表达均与女性不孕症相关，并通过对怀疑不育的女性作为检测对象，经分析发现，cyp11b1的异常表达还可以推定其后代患有自闭症谱系障碍的风险，但并没有证据表明cyp11a1与后代患自闭症谱系障碍风险的相关性，因此，在现有技术中，cyp11a1的异常表达往往被作为不孕症患者的标志物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种构建胎盘过表达cyp11a1小鼠动物模型的方法及应用，旨在探索和提供孤独症谱系障碍（asd）循证治疗所需模型的方法，为研究涉及asd的复杂机制和开发这种疾病的新防治方法奠定基础。
6.本发明通过下述技术方案实现：一种构建孕期过表达cyp11a1小鼠动物模型的方法，将小鼠hipp11基因的grna、含有cyp19启动子-kozak-小鼠cyp11a1 cds-rbg pa的供体载体和cas9 mrna共同注射到小鼠受精卵中，产生有针对性的基因敲除后代；然后通过pcr和序列分析确定f0创始动物，并将其与野生型小鼠交配以测试种系传递和f1动物的生成；幼崽将通过pcr进行基因分型，然后进行测序分析，即获得胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型。
7.本发明所述“孕期过表达”是指cyp11a在胎盘过表达。
8.进一步的，本发明还提供了孕期过表达cyp11a1在构建子代具有自闭症行为的小鼠动物模型中的应用。
9.其中，所述小鼠动物模型即为胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型。
10.除此之外，本发明还提供了胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型的应用，具体而言，包括：胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型在用于制备防治子代具有自闭症行为的药物中的应用。
11.以及，胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型在用于制备诊断/预测子代具有自闭症行为的产品中的应用。
12.其中，所述产品为试剂或试剂盒。
13.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：本发明基于cyp11a1基因为靶点，通过构建cyp11a1胎盘敲入（ki）小鼠模型，可以获得子代具有自闭症行为的小鼠，即表现出社交能力和沟通能力下降，焦虑性及重复刻板行为增加，学习和记忆缺陷等行为，再现了人类疾病的表型，因此，可将本发明构建的cyp11a1胎盘敲入（ki）小鼠模型用于子代自闭症防治、子代自闭症诊断/预测等方面的研究，并为asd的复杂机制及开发该种疾病的新治疗方法奠定基础。
14.进一步的，通过对孕期cyp11a1基因异常表达的研究发现，胎盘滋养层细胞cyp11a1基因异常表达上调将直接导致超负荷的线粒体生物合成过多的过氧化物（ros），从而诱发线粒体的损伤和凋亡。cyp11a1基因异常表达上调能够导致滋养层细胞局部微环境的改变以及炎症因子的释放，从而间接损伤神经干细胞并抑制其增殖，这说明滋养层细胞cyp11a1基因的异常表达上调可能会影响到胎儿神经系统的发育，由此，也印证了本发明胎盘过表达cyp11a1在构建子代具有自闭症行为的小鼠动物模型中的应用价值。
附图说明
15.图1为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠胎盘cyp11a1蛋白定量检测图。
16.图2为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠胎盘vd质谱定量检测图。
17.图3为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠社交能力测试。
18.图4为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠社交新奇偏好测试。
19.图5为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠高架十字0-5min的行动轨迹图。
20.图6为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在开放臂停留时间比例（ot％）情况。
21.图7为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠进入开放臂次数比例（oe％）情况。
22.图8为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠进入开放臂和封闭臂的总次数（oe+ce）情况。
23.图9为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在孕期给予vd干预后子代在中心区域的行动距离情况。
24.图10为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在孕期给予 vd 干预后子代进入中心区域的次数情况。
25.图11为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在孕期给予 vd 干预后子代在中心区
域待的时间占比情况。
26.图12为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在30min 内的埋珠数量情况。
27.图13为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠孕期给vd干预后各组子代对新事物时间认知指数（time of ri）情况。
28.图14为野生型小鼠与cyp11a1胎盘敲入小鼠在孕期给予 vd 干预后各组子代对新事物距离认知指数（distance of ri）情况。
具体实施方式
29.下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
30.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.实施例1：孕期过表达cyp11a动物模型的建立hipp11（h11）基因座是位于小鼠11号染色体上的eif4enif1和drg1基因之间的基因间区域，小鼠cyp11a1基因（ncbi参考序列：nm_019779.4）位于小鼠9号染色体上。对于ki模型，“cyp19启动子-kozak-mouse cyp11a1 cds-rbg pa”盒式磁带将被插入h11基因座（~0.7 kb 5'的eif4enif1基因和~4.5 kb 3'的drg1基因）。为了设计目标向量，pcr将使用bac克隆作为模板生成同调臂。将小鼠hipp11基因的grna、含有 "cyp19启动子-kozak-小鼠cyp11a1 cds-rbg pa "的供体载体和cas9 mrna共同注射到小鼠受精卵中，产生有针对性的基因敲除后代。通过pcr和序列分析确定f0创始动物，并将其与野生型小鼠交配以测试种系传递和f1动物的生成。幼崽将通过pcr进行基因分型，然后进行测序分析，由此获得胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型。
32.采用蛋白质电泳法进行cyp11a1胎盘敲入小鼠（即胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型）的cyp11a1胎盘过表达验证，参见图1所示，其结果显示：较野生型小鼠（wt组）而言，cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）的小鼠胎盘存在过表达cyp11a1。
33.进一步的，采用质谱法对cyp11a1胎盘敲入小鼠血清vd（总）含量进行检测，参见图2所示，其结果显示：cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）的血清vd表达量相较于较野生型小鼠（wt组）明显下降。
34.实施例2：孕期过表达cyp11a子鼠行为学检测（一）社会交往能力检测采集系统pnd 42-56采用三箱动物社交行为学实验装置检测小鼠社会交往行为。该装置被分成三个大小相等的隔间。实验总共分为三个阶段：第一阶段，将待检测小鼠放入实验装置适应10min；第二阶段，再装置一边隔间的笼子内放一只和待检测小鼠同性别同年龄而且之前无任何接触的陌生的小鼠，另外一边隔间仅放置空的笼子，中间的隔间是空的。将待检测实验动物放在中间隔间，用罗技摄像头及软件记录其在三箱动物社交行为学实验装置中的活动，计时10min，统计其和陌生的小鼠互动的时间以及空笼子接触的时间；第三阶段，在第二阶段实验中空着的金属笼子中放入第二只陌生同种小鼠，另外一边熟悉同性别的小鼠不变，中间的隔间是空的，同样记录小鼠在实验装置中的活动，计时10min，统计其和陌生的小鼠互动的时间以及和熟悉的小鼠互动的时间。
35.在社交能力测试中，分别记录野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）与装有同伴或空白笼子所待的时间，其结果参见图3所示；在社交新奇偏好测试中，分别记录野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）与熟悉小鼠或陌生小鼠所待的时间，其结果参见图4所示。由图3和图4可见，cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）在三室社会测试中表现出社会行为受损。
36.（二）高架十字迷宫实验采用高架十字迷宫实验装置来检测动物的焦虑样行为，该装置有两个开放臂和两个闭合臂(闭合臂两边具有20cm高的墙壁)，每个臂长50 cm。中间有一连接的平台 (10
×
10 cm)。实验时将小鼠放在高架十字迷宫的中间平台朝向闭合臂，并且每次实验时小鼠的朝向固定不变。让野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）在迷宫中自由探索10 min，记录其进入开放臂和闭合臂的时间。
37.高架十字迷宫试验 ( epm ) 既可以建立焦虑应激的模型也是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法，其原理是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理，形成动物的矛盾冲突来考察小鼠的焦虑状态。epm 测试的项目中，焦虑动物的oe%和ot%会明显降低。
38.实验结果参见图5至图8所示，其结果显示：cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）对比于野生型小鼠（wt组）更加焦虑。
39.（三）小鼠矿场实验采用旷场实验（高60cm）检测野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）的鼠焦虑。实验分2天，第一天将小鼠放入装置适应 5min。实验前清理该装置，将小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一，并让其自由探索环境10 min。并用弱光照明，记录小鼠分别在中央和周边区域待的时间。
40.旷场实验（oft）可以检测小鼠自发活动行为（loco-motor activity）和探索行为（exploratory behavior），是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法，可以通过中央区运进入总次数/中央区运滞留时间占比来反映小鼠的焦虑情况。
41.实验结果参见图9至图11所示，其结果显示：cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）对比于野生型小鼠（wt组）更加焦虑。
42.（四）埋珠实验针对野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）进行埋珠实验，具体是在笼具里面铺上垫料，固定间距将玻璃珠放置在垫料上，玻璃珠被看作一个不熟悉的、具有潜在威胁的物体，小鼠将这些威胁物清除的埋珠行为是本能的焦虑样反应的表现，根据固定时间内埋下（埋入体积大于50%以上）玻璃珠的数量，分析动物的焦虑水平，重复刻板行为。
43.实验结果参见图12所示，其结果显示：cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）焦虑刻板行为对比于野生型小鼠（wt组）明显增加。
44.（五）新物体识别实验新物体识别实验（ort）是一种利用啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本能来检测动物识别记忆的精细、敏感的行为学方法。小鼠对新旧物体的探索的次数、时间和距离，即小鼠在新旧物体周围活动的次数、时间和距离，检测小鼠的认知情况：若小鼠认知能力差，则在新旧物体的探索无差异；若小鼠认知能力正常，则对新事物的探索较旧事物
长。认知指数（recognition index，ri）计算公式为：ri = 新物体 / (新物体 + 旧物体)
ꢀ×
100 % 。
45.通过对野生型小鼠（wt组）和cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）进行新物体识别实验，实验结果参见图13和图14所示，其结果显示：对比野生型小鼠（wt组），在时间认知指数中，cyp11a1胎盘敲入小鼠（ki组）认知能力相对较差，具有统计学意义。
46.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种构建孕期过表达cyp11a1小鼠动物模型的方法，其特征在于：将小鼠hipp11基因的grna、含有cyp19启动子-kozak-小鼠cyp11a1 cds-rbg pa的供体载体和cas9 mrna共同注射到小鼠受精卵中，产生有针对性的基因敲除后代；然后通过pcr和序列分析确定f0创始动物，并将其与野生型小鼠交配以测试种系传递和f1动物的生成；幼崽将通过pcr进行基因分型，然后进行测序分析，即获得胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型。2.孕期过表达cyp11a1在构建子代具有自闭症行为的小鼠动物模型中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小鼠动物模型为胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型。4.胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型在用于制备防治子代具有自闭症行为的药物中的应用。5.胎盘cyp11a1基因敲入的小鼠动物模型在用于制备诊断/预测子代具有自闭症行为的产品中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述产品为试剂或试剂盒。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种构建孕期过表达CYP11A1小鼠动物模型的方法及应用，通过将小鼠Hipp11基因的gRNA、含有CYP19启动子-Kozak-小鼠Cyp11a1 CDS-rBG pA的供体载体和Cas9 mRNA共同注射到小鼠受精卵中，产生有针对性的基因敲除后代，再通过交配、基因分型和测序分析后，获得胎盘CYP11A1基因敲入的小鼠动物模型，可用于构建子代具有自闭症行为的小鼠动物模型，以及将该动物模型用于研究制备防治子代具有自闭症行为的药物以及制备诊断/预测子代具有自闭症行为的产品。制备诊断/预测子代具有自闭症行为的产品。制备诊断/预测子代具有自闭症行为的产品。


技术研发人员：张静 许文明 尹恒 谢江
受保护的技术使用者：四川大学华西第二医院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/9