一类含有杜鹃素和SCR7的改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基及其应用的制作方法

一类含有杜鹃素和scr7的改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，是关于一类含有杜鹃素和scr7的改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基及其应用。


背景技术：

2.体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，scnt，又称克隆)是研究细胞命运重塑调控的重要模型，是唯一一种可使已经分化的体细胞重获细胞全能性，并使之发育成为动物个体的技术，对理解母源因子作用及表观基因组重建的调控机制具有重要意义，极大推动了动物育种与非人灵长类研究。自1962年john gurdon博士成功克隆爪蛙开始，体细胞核移植研究已发展了近60年，包括猴在内已有20多种哺乳动物被成功克隆，但其依然面临低发育率的痛点问题，主要表现为：1)体细胞核移植胚胎呈现合子基因组激活(zygotic genome activation，zga)障碍，约30-40％的小鼠克隆胚胎会发生2-细胞(2-cell，2c)阻滞；2)体细胞核移植胚胎存在第一次细胞命运决定缺陷，即使部分胚胎顺利克服2c阻滞，最终的囊胚率却仅有20-30％，相比而言同品系的体外受精胚胎囊胚率可达90％以上；3)体细胞核移植胚胎存在着床后滋养层发育缺陷，表现为异常的大胎盘，严重限制了母胎交互并引起胎儿发育异常。
3.随着研究的深入，科学家逐渐认识到表观遗传在胚胎发育中起重要作用，不完全的表观遗传重编程是核移植胚胎发育缺陷的主要原因之一，通过针对这些表观重编程障碍(epigenetic barrier)的人工干预，多个研究团队成功推进了细胞全能性的重塑，有效提升了核移植胚胎的发育潜能。例如，哈佛大学张毅课题组发现异常的组蛋白h3k9me3修饰是导致克隆胚胎合子基因组激活等缺陷的主要原因，过表达组蛋白去甲基化酶kdm4d可以极大提升克隆胚胎囊胚率。然而，虽然通过上述干预使得核移植胚胎囊胚率接近了90％，但其着床后的滋养层缺陷仍未被修复，体内发育依然受限。为进一步改善着床后缺陷，基于母源组蛋白h3k27me3修饰介导的非经典印迹理论，周琪课题组及ogura课题组分别通过基因敲除等方式实现母源h3k27me3印迹等效替代，部分修复了异常的胎盘表型。近期，通过合子期敲降dnmt3a/3b(修复异常的dna再甲基化)或过表达dux(修复异常组蛋白h3k9ac修饰并促进合子基因组激活)，均可显著降低克隆胎盘重量并有效提升发育率。然而，上述方法操作相对繁琐且可能破坏基因组的完整性，在实际应用中存在局限。
4.dna作为遗传物质的载体，其结构的完整性对胚胎发育及后续分化起到十分关键作用。为了维持基因组的稳定性，机体必须及时应对发育过程或环境压力下所产生的损伤。2022年dieteregli课题组在cell上报道了人类胚胎发育在进入第一个细胞周期时会因复制压力而出现s期复制叉停止、复制叉速率降低和dna合成持续到g2期的延迟，进而形成非整倍体损害胚胎发育潜能。值得注意的是，核移植过程就给予了供体细胞核巨大的压力，它要求克隆胚胎在1-2个细胞周期内就完成从体细胞向早期胚胎的转变，而对标的生殖细胞一般需要几周的时间才能做好相应的准备。其中不仅包括要迅速解聚其固有的体细胞3d基
因组结构，还需从有丝分裂样向第二次减数分裂中期样变化，随着激活进一步向早期胚胎样转变，而这一过程竟然在第一个细胞周期内就需完成，伴随显著的复制依赖的dna损伤及基因组的不稳定，而已有研究证实了核移植胚胎存在dna损伤并呈现修复异常，dna损伤修复参与对细胞全能性的调控。
5.本课题组之前的专利cn111088290a，公开日2020.05.01，公开了一种杜鹃素在基因编辑中的应用，所述杜鹃素能够靶向促进dna双链断裂中同源重组修复(homologousrecombination,hr)效率，进而为基因编辑中提高目的片段靶向整合效率提供更加便捷的依据。同时该发明中所应用的筛选系统也更为简便有效，为多种天然小分子化合物在dna双链断裂修复方面提供了合理的筛选方式，这表明可以利用特定小分子化合物来激活受损的dna损伤修复通路，以达到改善核移植胚胎的dna损伤和基因组稳定性的目的，最终实现重编程效率的提升，同时小分子价格相对低廉，批次一致，效用稳定，便于在胚胎培养基中进行添加，而且不涉及针对基因组的操作。因此，这种添加了特定小分子的有助于改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基，将是一种稳定、高效又操作简便的培养系统。
6.本课题组之前已经就杜鹃素和scr7分别应用于体细胞核移植体系能够提高胚胎发育率这一显著效果提出了专利申请，申请号分别是202310163592.8和202310163579.2。杜鹃素和scr7这两个小分子改善dna损伤的作用原理不同，前者是通过激活同源重组修复通路，而后者则是通过抑制与同源重组修复处于竞争关系的非同源末端连接修复，相当于间接激活hr。针对于此，申请人考虑同时联用杜鹃素和scr7以共同激活核移植胚胎中的同源重组修复，改善dna损伤提高基因组稳定性，最终达到改善胚胎发育的目的。而目前关于本发明的一类含有杜鹃素和scr7的改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基及其应用还未见报道。


技术实现要素：

7.本发明的第一个目的是，针对现有技术中小分子剂量所需较大的不足，提供一类同时含有杜鹃素和scr7的改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基。
8.本发明的第二个目的是，提供一种杜鹃素和scr7的应用。
9.本发明的第三个目的是，提供一种培养基的应用。
10.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一类改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基，所述培养基中包含杜鹃素和scr7。
11.作为一个优选例，所述的培养基的组分和浓度如下：
12.0.9-1.1mg/mld-glucose；
13.4.6-4.8mg/mlnacl；
14.0.3-0.4mg/mlkcl；
15.0.2-0.35mg/mlmgso4
·
7h2o；
16.0.03-0.05mg/mledta
·
2na；
17.0.5-0.6％na-lactate；
18.0.16mg/mlkh2po4；
19.0.1-0.3mg/mlcacl2
·
2h2o；
20.2.1-2.2mg/mlnahco3；
21.28-34μg/mlpyruvate；
22.4-6mg/mlbsa；
23.0.1-0.2mg/mlglutamine；
24.20-30nmfarrerol(杜鹃素)；
25.1-10μmscr7。
26.更优选地，所述培养基的组分和浓度如下：
27.1mg/mld-glucose；
28.4.76mg/mlnacl；
29.0.36mg/mlkcl；
30.0.29mg/mlmgso4
·
7h2o；
31.0.04mg/mledta
·
2na；
32.0.53％na-lactate；
33.0.16mg/mlkh2po4；
34.0.2mg/mlcacl2
·
2h2o；
35.2.11mg/mlnahco3；
36.30μg/mlpyruvate；
37.5mg/mlbsa；
38.0.15mg/mlglutamine；
39.25nmfarrerol(杜鹃素)；
40.5μmscr7。
41.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：杜鹃素和scr7在制备改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基中的应用。
42.为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的培养基在体细胞核移植胚胎培养中的应用。
43.本发明优点在于：
44.1)本发明在之前的发明基础上对两种特定小分子化合物进行联合使用，以相较于之前发明中较低的浓度进行混合，可以帮助体细胞核移植胚胎在体外环境下维持重编程过程和基因组稳定，且其效用不低于之前的发明。
45.2)本发明通过添加可提高同源重组修复效率的小分子来改善核移植重编程中引入的dna损伤，从而实现基因组的稳定维持和胚胎的正常发育。这种通过培养基实现重编程效率的提升，不仅操作方便，更加安全和高效，而且高度稳定，适合哺乳动物细胞在医学与生命科学领域的应用。
附图说明
46.附图1为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的dmso、50nmfarrerol、10μmscr7、不同浓度的farrerol和scr7联合使用、50μmmirin处理后各个发育阶段的发育率统计。图a展示了farrerol、scr7以及二者联用的发育比较，图b展示了对于farrerol和scr7联用的浓度和处理时长的发育比较，最终确认最佳联用处理方式。
47.附图2为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的
dmso、50nmfarrerol、10μmscr7、不同浓度的farrerol和scr7联合使用、50μmmirin处理后发育至4细胞的比率统计分析(图a)，以及发育至囊胚阶段的比率统计(图b)。
48.附图3为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历16小时的dmso、50nmfarrerol、10μmscr7、最佳浓度25nm的farrerol和5μmscr7联合使用处理后各个发育阶段的代表性图片。
49.附图4为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的dmso、50nmfarrerol、10μmscr7、不同浓度的farrerol和scr7联合处理后，在囊胚时期进行的nanog和cdx2抗体的免疫荧光染色实验。图a展示了nanog阳性的内细胞团(innercellmass,icm)细胞数目的统计结果，图b展示了代表性图片。
50.附图5为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的dmso、50nm farrerol、10μm scr7、不同浓度的farrerol和scr7联合处理后，在囊胚时期进行的gata6和cdx2抗体的免疫荧光染色实验。图a展示了gata6阳性的原始内胚层(primitive endoderm,pre)细胞数目的统计结果，图b展示了代表性图片。
51.附图6为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的dmso、50nm farrerol、10μm scr7、不同浓度的farrerol和scr7联合处理后，在囊胚时期的te/icm比例的统计结果。
52.附图7为ivf胚胎在经过特定时间的dmso处理，及scnt胚胎分别在经历特定时间的dmso、50nm farrerol、10μm scr7、不同浓度的farrerol和scr7联合处理后，在囊胚时期的进行的免疫荧光染色实验，图a-c分别为nanog、cdx2、gata6的相对荧光强度统计结果。
具体实施方式
53.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
54.实施例1含有杜鹃素和scr7的培养基对体细胞核移植胚胎发育缺陷改善效果
55.1材料与方法
56.1.1材料
57.试剂：培养基中所用的d-glucose,nacl,kcl,mgso4
·
7h2o,edta
·
2na,na-lactate,kh2po4,cacl2
·
2h2o,nahco3,pyruvate,bsa,glutamine均购自sigma公司，farrerol也购自该公司，货号为sml1389。scr7购自biotechne，货号为5342。孕马血清促性腺激(pmsg，三生公司)，人绒毛膜促性腺激素(hcg，三生公司)，矿物油(sigma公司)，pvp(sigma公司)，透明质酸酶(hyaluronidase，sigma公司)水银(fishier公司)，dpbs(sigma公司)，ultra-pure water(sigma公司)。
58.仪器：co2培养箱(thermo scientific公司)，超净工作台(labconco公司)，移液枪(thermo scientific公司)，普通和滤芯移液枪头(axygen)，口吸管细玻针(北京正天易科贸有限公司)，显微操作玻璃针(sutter instrument公司)，拉针仪(sutter instrument公司)，断针仪(de fonbrune style公司)，显微操作系统(narishige公司)，显微操作热台(olympus公司)，体视显微镜(olympus公司)，35mm peri dish(corning公司)，1ml/5ml/
10ml/20ml无菌注射器(米沙瓦医科工业公司)。
59.1.2方法
60.1.2.1体细胞核移植胚胎的培养
61.a)利用核移植重编程系统获得体细胞核移植胚胎(本专利中scnt胚胎则是以c57bl/6母鼠和pwk/phj公鼠进行交配获得的杂交f1代母鼠(定义为bpf1)，在其生长至6周龄时促排收集mii卵周边围绕的颗粒细胞作为供核细胞，以传统bdf1(c57bl/6母鼠与dba2公鼠交配后的f1代)母鼠的卵母细胞为受体卵，进行体细胞核移植操作获得的)；
62.b)将上述培养基在35mm的petri dish中做成20μl大小的滴放入37℃，5％co2胚胎培养箱中放置平衡0.5小时；
63.c)将核移植胚胎放入b)中平衡后的皿中进行培养，培养16小时至2-细胞早期阶段；
64.d)此后采用不含杜鹃素和scr7的上述培养基进行后续培养，培养至囊胚阶段。
65.1.2.2各个发育阶段的发育率统计
66.核移植胚胎从放入激活液开始记为0hpa(hours post activation)，6hpa时将胚胎放入含特定浓度的杜鹃素和scr7的培养基中培养6或16小时，此后移至不含杜鹃素和scr7的培养基中培养至囊胚。每日在24、48、72、120hpa时观察胚胎发育状态并拍照记录，用于计数及统计各个发育阶段的发育率。
67.1.2.3免疫荧光染色实验
68.a)当胚胎发育至特定阶段时，将胚胎转移入4％多聚甲醛溶液中处理20分钟；
69.b)用tbst溶液清洗胚胎两次，之后在室温下用含有0.2％tritonx-100的tbst溶液处理10分钟；
70.c)用tbst溶液清洗胚胎两次，之后在室温下含有2％bsa的pbs溶液处理1小时；
71.d)将对应的一级抗体用含有2％bsa的pbs溶液稀释，并用含有对应抗体的上述溶液在4℃下处理胚胎8小时以上；
72.e)用tbst溶液清洗胚胎两次，将对应的二级抗体用含有2％bsa的pbs溶液稀释，并用含有对应抗体的上述溶液在室温下处理胚胎1小时；
73.f)用tbst溶液清洗胚胎两次，用含有dapi的tbst溶液处理胚胎20分钟，之后再用tbst溶液清洗胚胎两次；
74.g)将上述处理后的胚胎放在载玻片上，盖上盖玻片后即可用激光共聚焦显微镜进行记录。
75.2统计与分析
76.大多数统计分析使用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.)进行，通常使用双尾非配对welcht检验或双尾非配对studentt检验计算统计学显著性。n，不显著。*p《0.05。**p《0.01，***p《0.001。
77.3结果
78.3.1各个发育阶段的发育率比较
79.图1揭示了单独使用杜鹃素和scr7以及联合使用均能够有效提升体细胞核移植胚胎的发育。基于此结果，于是接下来针对联合使用的最佳条件我们进行了详细的比较，设计了farrerol分为50nm、25nm、12.5nm和6.25nm的浓度梯度，对应的scr7分为了10μm、5μm、2.5
μm和1.25μm的浓度。
80.图2和图3揭示了经过比较分析，确认scnt胚胎在25nmfarrerol和5μmscr7联合处理16小时条件下发育最好，相比于dmso对照组，2-细胞阶段阻滞率降低，囊胚率由24.16％提升至69.12％，与单个使用的farrerol提升的70.02％较为接近，略微高于scr7提升的66.25％。值得注意的是，联合使用的最佳浓度为单独使用的杜鹃素和scr7的一半，这就降低了试剂的使用成本。
81.这里含dmso的培养基作为对照组，含mirin的培养基作为阴性对照，mirin小分子的作用是抑制dna同源重组修复。
82.3.2囊胚时期的谱系分化检测
83.本发明获得的最佳处理方式scnt-farrerol+scr7在发育至囊胚时检测到囊胚谱系分化程度提升，表现在内细胞团(innercellmass，icm)和原始内胚层(primitiveendoderm，pre)细胞数目都呈现增多(图4和图5)。而且整个囊胚的形态也较dmso对照组得到改善，表现在te和icm细胞的比例趋于正常(图6)。免疫荧光染色结果通过分析荧光强度，发现与谱系分化和细胞命运决定相关的基因nanog、cdx2、gata6都呈现高表达，在对应的细胞上呈现高于dmso对照组的信号富集(图7)。以上结果证明杜鹃素和scr7联合使用可以获得高质量的体细胞核移植胚胎，具备良好的谱系分化能力。
84.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一类改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基，其特征在于，所述培养基中包含杜鹃素(farrerol)和scr7。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基的组分和浓度如下：0.9-1.1mg/mld-glucose；4.6-4.8mg/mlnacl；0.3-0.4mg/mlkcl；0.2-0.35mg/mlmgso4
·
7h2o；0.03-0.05mg/mledta
·
2na；0.5-0.6％na-lactate；0.16mg/mlkh2po4；0.1-0.3mg/mlcacl2
·
2h2o；2.1-2.2mg/mlnahco3；28-34μg/mlpyruvate；4-6mg/mlbsa；0.1-0.2mg/mlglutamine；20-30nmfarrerol(杜鹃素)；1-10μmscr7。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基的组分和浓度如下：1mg/mld-glucose；4.76mg/mlnacl；0.36mg/mlkcl；0.29mg/mlmgso4
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7h2o；0.04mg/mledta
·
2na；0.53％na-lactate；0.16mg/mlkh2po4；0.2mg/mlcacl2
·
2h2o；2.11mg/mlnahco3；30μg/mlpyruvate；5mg/mlbsa；0.15mg/mlglutamine；25nmfarrerol(杜鹃素)；5μmscr7。4.杜鹃素和scr7在制备改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基中的应用。5.权利要求1-3任一所述的培养基在体细胞核移植胚胎培养中的应用。

技术总结
本发明涉及一种有助于改善体细胞核移植胚胎发育缺陷的培养基，其组分和浓度为：0.9-1.1mg/mLD-Glucose；4.6-4.8mg/mLNaCl；0.3-0.4mg/mLKCl；0.2-0.35mg/mLMgSO4


技术研发人员：陈嘉瑜 高绍荣 王育 王明珠 傅乾正
受保护的技术使用者：上海市第一妇婴保健院
技术研发日：2023.07.03
技术公布日：2023/9/9