一种能够实现碱基颠换的CGBE单碱基编辑器及其应用

一种能够实现碱基颠换的cgbe单碱基编辑器及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种新型的cgbe碱基编辑器apoee-ncas9-cung在水稻基因打靶方面的应用，该cgbe单碱基编辑器能够实现特定位点的碱基颠换。


背景技术：

2.目前的基因编辑技术(zfn，talen，crispr/cas9)依赖于在靶位点诱导双链断裂，进而激活dna修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生dna片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应及不确定编辑的产生，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现能够实现更精准的基因替换。
3.单碱基基因编辑技术(base editors，bes)，是指能在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(apobec)或腺苷脱氨酶与cas9n(d10a)融合而形成，依赖于crispr原理使得靶点远离pam端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。
4.基于crispr/cas9基因编辑系统，2016年4月，哈佛大学生物化学家david liu组率先在《自然》杂志上报告了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑系统主要由sgrna和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而常兴组的融合蛋白仅包含cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgrna通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现c-t(g-a)或a-g(t-c)的碱基替换。
5.除了碱基转换外，碱基颠换(c-a、c-g等等)在致病点突变中同样占很大比重，2020年，中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼和毕昌昊实验室、哈佛医学院麻省总医院j.keith joung和julian gr
ü
newald实验室分别通过改造现有的单碱基编辑工具cbe，构建出哺乳动物细胞适用的介导c-g碱基颠换的高效新工具gbe/cgbe。随后，qi yiping和朱健康团队分别对不同的尿嘧啶dna糖基化酶、胞嘧啶脱氨酶和载体结构等进行了一系列的摸索和优化，在植物中实现了c-g的碱基颠换。但是，目前在植物中，cgbe依然存在效率低、副产物多等问题，这可能是动物和植物中的修复方式有很大不同所造成的，因此在植物中开发高效可实现碱基颠换的单碱基编辑工具迫在眉睫。


技术实现要素：

6.针对上述问题，为了实现在植物中开发效率高，精准可控的cgbe单碱基编辑工具，本发明通过在cgbe单碱基编辑系统中替换并且融合鳕鱼来源的尿嘧啶糖基化酶基因cung，并且使用该系统提供一种新型的高编辑效率的工具，同时保持其基因编辑精准性，此外，本发明的发明人发现了一种apo的突变体，通过对apo第125位的精氨酸(r)突变为谷氨酸(e)；第131位的精氨酸(r)突变为谷氨酸(e)获得该突变体，其对应的核苷酸序列为apoee，利用
该apoee配合cung可以获得更好地碱基颠换效率。本发明的新型cgbe碱基编辑工具apoee-ncas9-cung可以实现由c到g的精准高效的碱基颠换工具。
7.本发明在水稻中设计优化了来自鳕鱼的尿嘧啶dna糖基化酶(cung)基因，通过融合大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶变体apoee基因，以及失活的nspcas9蛋白基因，组成融合蛋白apoee-ncas9-cung，其序列见序列表。将apoee-ncas9-cung基因整合到本实验室自主产权的表达载体phuc411中。在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻中特异基因的精准编辑。
8.具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种新型的单碱基编辑器apoee-ncas9-cung，其特征在于，apoee-ncas9-cung碱基编辑器的基因序列至少包含：
9.(a)seq id no:1中所示的核苷酸序列；或者
10.(b)在seq id no:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
11.(c)在seq id no:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且并且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
12.(d)seq id no:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。
13.所述编辑器apoee-ncas9-cung的基因由序列表中seq id no.1所示的核苷酸序列构成。
14.另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含单碱基编辑器apoee-ncas9-cung的基因序列。
15.另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含所述的单碱基编辑器apoee-ncas9-cung或所述的表达盒。
16.另一方面，本发明提供一种所述的基因、所述表达盒或所述载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑器apoee-ncas9-cung实现对水稻基因组的单碱基编辑，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。
17.所述应用包括利用所述单碱基编辑器apoee-ncas9-cung识别带有ngg特征的pam序列，完成水稻体内dna双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有由c到g的单碱基突变位点的转基因植物或植物部分。
18.本发明中含有apoee-ncas9-cung基因的植物表达载体的构建方法是：通过无缝克隆技术将apoee、ncas9、cung三个基因串联在t载体上；利用psti/saci酶切phuc spr载体并回收，由于t-apoee-ncas9-cung序列两端加有psti/saci酶切位点，可以利用t4连接酶将apoee-ncas9-cung连接到phuc spr载体，得到植物表达载phuc apoee-ncas9-cung；进一步地，通过hindiii酶切位点利用t4连接酶将u3 spr sg2.0polyt表达框连入phuc apoee-ncas9-cung，得到phuc411 apoee-ncas9-cung。
19.另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。在另一个方面，本发明提供一种利用apoee-ncas9-cung表达载体(其含有所述高编辑效率apoee-ncas9-cung基因及其应用)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(apoee-cgbe-tac)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：
20.(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
21.(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
22.(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带apoee-ncas9-cung的打靶载体(apoee-ncas9-cung-tac)的农杆菌接触15min；
23.(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5ml农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48h；
24.(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7d；
25.(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
26.(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；
27.(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
28.其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。
29.在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。
30.表1培养基的示例性配方
[0031][0032]
表1
[0033]
表格中所提到的“优化的n6大量元素”指的是，该n6大量元素中[no
3-]/[nh4+]＝40mm/10mm。
[0034]
在优选的实施方案中，所述apoee-ncas9-cung标记基因的核苷酸序列为seq id no:1所示的核苷酸序列，具体如：
[0035]
[0036]
[0037]
[0038]
[0039][0040]
技术效果
[0041]
本发明所提供的编辑器，可以实现植物中由c到g的精准高效的碱基颠换，本发明对该编辑器进行了反复验证，证明其可以有效应用于水稻等农作物中用作高编辑效率的编辑器。利用该编辑器进行水稻基因编辑，可以编辑更多c到g颠换的突变体，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库。
[0042]
本发明为crispr/cas9基因编辑系统又提供了一个优秀的基因资源，具有重大的研究意义和社会价值。
附图说明
[0043]
图1为phuc411-apoee-ncas9-cung载体质粒示意图。
[0044]
图2为apoee-ncas9-cung编辑tac基因突变示例。
[0045]
图3为apoee-ncas9-cung编辑tac基因sanger测序图。
具体实施方式
[0046]
以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
[0047]
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书sambrook and david russell，molecular cloning:alaboratory manual,3rd ed.,vols1,2；charles neal stewart,alisher touraev,vitaly citovsky and tzvi tzfira,plant transformation technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0048]
实施例1——apoee-ncas9-cung的构建
[0049]
本技术的发明人使用来自鳕鱼中的尿嘧啶dna糖基化酶(cung)融合失活的nspcas9蛋白，以及apoee胞嘧啶脱氨酶通过下述方式组建cgbe碱基编辑系统，并将其命名为apoee-ncas9-cung。同时，以人来源的尿嘧啶dna糖基化酶(hung)，融合失活的nspcas9蛋白和apoee胞嘧啶脱氨酶构成cgbe碱基编辑系统为对照，命名为apoee-ncas9-hung。
[0050]
具体而言，将本发明构建的cung基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于puc57-amp载体上，形成puc57-amp-cung载体，并装载入大肠杆菌xl-blue菌株中。
[0051]
其次，使用购买自全氏金生物的点突变试剂盒对puc57-amp-rapo的两个氨基酸进行突变，分别为：第125位的精氨酸(r)突变为谷氨酸(e)；第131位的精氨酸(r)突变为谷氨
酸(e)；突变后的基因命名为puc57-amp-apoee(r125e,r131e)。另外，nspcas9基因序列实验室已保存。
[0052]
根据gibson拼接原理，apoee基因，nspcas9基因，cung基因连接在一起，并连接于改造的全氏金的t载体上，命名为apoee-ncas9-cung-t-spr。具体操作如下：
[0053]
根据apoee基因，nspcas9基因，cung基因的拼接顺序及t载体序列，分别合成引物：
[0054]
bp nls-abe8 fp:
[0055][0056]
bp nls for apoee hr rp:
[0057][0058]
apoee for bpnls hr fp:
[0059][0060]
ncas9 for cung hr rp:
[0061][0062]
cung for ncas9 hr fp:
[0063][0064]
bp nls for t hr rp:
[0065][0066]
以puc57-amp-apoee(r125e,r131e)为模板，用引物bp nls-abe8 fp及bp nls for apoee hr rp进行pcr扩增，回收pcr产物。以实验室保存的nspcas9基因为模板，用引物apoee for bpnls hr fp及ncas9 for cung hr rp进行pcr扩增，回收pcr产物。以puc57-amp-cung为模板，用引物cung for ncas9 hr fp及bp nls for t hr rp进行pcr扩增，回收pcr产物。将上述的三个回收片段，及经ecori酶切之后的t-spr载体片段，根据gibson拼接原理，按照nebuilder hifi dnaassembly reaction protocol说明书，构成apoee基因，nspcas9基因，cung基因融合在一起的基因，命名为apoee-ncas9-cung-t-spr，将apoee-ncas9-cung-t-spr转入到大肠杆菌xl-blue。
[0067]
实施例2——含有apoee-ncas9-cung基因植物打靶载体的构建
[0068]
从上面获得的含有apoee-ncas9-cung-t-spr载体的大肠杆菌xl-blue，用axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用psti/saci酶切，回收apoee-ncas9-cung片段。同时利用psti/saci酶对phuc spr进行线性化处理，回收phuc spr，将上述的apoee-ncas9-cung片段和phuc spr片段用t4连接酶(购于neb公司)进行连接，得到phuc apoee-ncas9-cung。进一步地，通过hindiii酶切位点利用t4连接酶将u3 spr sg2.0 polyt表达框连入phuc apoee-ncas9-cung，得到phuc411 apoee-ncas9-cung(图1)。
[0069]
选择水稻tac基因(os09g0529300)中第2869-2891位的核苷酸序列ccctttcaccttttgcgggattt(下划线部分为所述5’ngg-3’结构的pam序列)，作为打靶位点，对应的sgrna序列为aaatcccgcaaaaggtgaaa。合成sgrna序列，连至apoee-ncas9-cung表达载体上，形成靶向编辑载体apoee-ncas9-cung-tac。利用冻融法将融合后的植物表达载体转入根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)eha105菌株中(安徽农业大学农学院所保存)，用于遗传转化(图2)。
[0070]
实施例3——以apoee-cgbe-tac为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。
[0071]
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
[0072]
将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90s，倒掉酒精；再用含tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
[0073]
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50ml的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
[0074]
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
[0075]
将含有apoee-ncas9-cung-tac载体的农杆菌菌株eha105在含有50mg/l卡那霉素的lb平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/l卡那霉素的lb平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50ml的无菌离心管中加入20-30ml农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整od660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
[0076]
3、侵染和共培养
[0077]
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100
×
25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5ml农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
[0078]
4、前筛选和筛选培养
[0079]
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
[0080]
5、分化再生
[0081]
每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
[0082]
6、生根与移栽
[0083]
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
[0084]
7、分子鉴定
[0085]
在移栽之前，采取水稻叶片样品，用ctab法进行dna小提。将所得到的基因组dna样品用于pcr分析。设计以下引物进行pcr鉴定：
[0086]
tac check fp:gagctggttgagtagtcgaa
[0087]
tac check rp:ggcgagcgaataggcagcaa
[0088]
用于扩增tac靶标附近的263bp序列。将pcr组分首先在95℃保持5min，然后进行35个循环：94℃30s、62℃30s、72℃20s，最后72℃延伸5min。取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，条带大小符合则将pcr产物进行桑格测序。将测序结果与两个对照序列进行比对。对照序列1为仅包含突变体apoee，不包含优化序列cung的apoee-ncas9-hunge序列，对照序列2为野生型序列apo-ncas9-hunge(不包含突变体apoee和本发明提供的cung)。
[0089]
apo的序列为
[0090][0091]
hung序列为：
[0092][0093]
按照上述实施例的方式分别对培育含有本发明基因序列和对照基因的植株。
[0094]
在apoee-ncas9-cung-tac获得的后代植株中，在检测的48株植株中出现28株c-g突变，编辑效率达到58.3％。以同样的操作，获得apoee-ncas9-hunge对tac基因编辑的植株，结果是在检测的54棵植株中，有10棵出现c-g突变，编辑效率为18.5％。以同样的操作获得apo-ncas9-hunge对tac基因编辑的植株，获得的后代植株中，在检测的54株植株中出现6株c-g突变，编辑效率仅为11.1％。
[0095]
由此可见，使用apoee配合cung是可以实现高效的c-g碱基颠换的cgbe碱基编辑器。
[0096]
上述实验重复3次，含有本发明的apoee-ncas9-cung基因的植株，其c-g颠换的平
均编辑效率可以维持在55-60％之间，证明该编辑器的有效性。

技术特征：
1.一种能够实现碱基颠换的cgbe单碱基编辑器，其特征在于，所述单碱基编辑器为apoee-ncas9-cung，基因序列至少包含：(a)seq id no:1中所示的核苷酸序列；或者(b)在seq id no:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者(c)在seq id no:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸并且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者(d)seq id no:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的能够实现碱基颠换的cgbe单碱基编辑器，其特征在于，所述cgbe单碱基编辑器的基因由序列表中seq id no.1所示的核苷酸序列构成。3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的cgbe单碱基编辑器的基因序列。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的cgbe单碱基编辑器或权利要求3所述的表达盒。5.一种权利要求1所述的cgbe单碱基编辑器、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑器基因实现对水稻基因组的c-g的单碱基编辑。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述cgbe单碱基编辑器apoee-ncas9-cung用于将目标基因序列中特定或不特定位点的c碱基突变成g，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。7.一种将权利要求1中所述的cgbe单碱基编辑器导入水稻细胞的方法。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带cgbe单碱基编辑器的打靶载体的农杆菌接触15分钟；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到其上垫有三张无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

技术总结
本发明提供了一种能够实现碱基颠换的CGBE碱基编辑器及其应用。本发明设计合成了鳕鱼来源的尿嘧啶糖基化酶基因cUNG，融合大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶基因rAPO的突变体APOEE以及失活的Cas9蛋白基因nSpCas9，组合成为APOEE-nCas9-cUNG基因，该基因可以实现C-G的碱基颠换。并且本发明还提供包括APOEE-nCas9-cUNG基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的APOEE-nCas9-cUNG基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的单碱基替换，特别是实现高效率的C-G碱基颠换。G碱基颠换。G碱基颠换。


技术研发人员：李娟 许蓉芳 秦瑞英 谷东方 卞士权 章潇
受保护的技术使用者：安徽省农业科学院水稻研究所
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/12