一种PEG修饰的DhHP-6及其制备方法和用途

一种peg修饰的dhhp-6及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及生物药物领域，特别是一种peg修饰的dhhp-6及其制备方法和用途。


背景技术：

2.过氧化物酶和过氧化物酶模拟物已广泛应用于生物传感、生物催化、生物漂白、生物修复工业废液、化学发光、聚合物合成和诊断等领域。天然过氧化物酶具有天然赋予的结合袋，具有无可挑剔的选择性，作为工业应用的生物催化剂非常有效。然而，大多数天然过氧化物酶难以分离、储存，并且需要严格的催化条件才能实际应用。因此，应开发和加强人工模拟酶以提高适应性，同时保持生物催化应用可接受的活性。deuterohemin-peptide(deuterohemin-β-alahisthrvalglulys，dhhp-6)(图1)是我们课题组设计的一种基于血红素和多肽结合的过氧化物酶模拟物，它不仅具有与过氧化物酶相似的催化活性，还表现出多种生物效应，如提高秀丽线虫的热和氧化应激抗性elegans，催化乙烯基聚合和生物医用聚合物，提高原子转移自由基聚合(atrp)转化率，以及苯酚去除能力。dhhp-6还具有潜在的药物开发价值，它能够保护心肌细胞免受氧化损伤，改善阿尔茨海默病(ad)转基因小鼠模型中的认知功能，以及通过pi3k/akt和ampk通路调节肝脏氧化应激和胰岛素抵抗。然而，dhhp-6的低分子量可能导致快速肾脏清除，影响其药效，因此限制了其在体内的应用。
3.peg修饰可以保护生物药物免受酶的作用，从而延长体内循环时间。peg修饰的概念最早由frank davis教授在20世纪70年代后期提出，并由abraham abu-chowski和j.milton harris创立了第一家和第二家专门从事peg修饰研究和开发的公司。如今，peg修饰已经成为一种成熟的生物药物修饰技术，有多种经fda批准的peg修饰蛋白质和肽类药物上市或在临床试验中。peg修饰的方法主要分为两类：非共价结合和共价结合。非共价结合，通常将样品与含peg)的分子在水性溶剂中孵育，peg结合主要由疏水或静电相互作用驱动。这种方法操作简单，但由于缺乏共价键会导致peg链随着时间的推移与样品分离。共价结合是peg与药物分子的共价结合，由于可能减少这些生物药物的共同缺点而被广泛用于提高药物的有效性和安全性。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种peg修饰的dhhp-6及其制备方法和用途。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.本发明的第一个目的是要提供一种peg修饰的dhhp-6的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、将0.1mg的dhhp-6溶解在体积比为1：1的pbs缓冲液和二甲基亚砜dmso的混合溶剂中，使总体积为1ml；
8.s2、然后向溶液中加入0.12mg peg粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液；
9.s3、将反应液于-40℃冻干后，用反相高效液相色谱仪进行表征和纯化，色谱柱为
eclipse xdb-c18，流动相为含0.1％tfa的水和含0.1％tfa的乙腈，洗脱程序为：以30％b为基线，15分钟内线性升至60％b，分析时流速为1ml/min，检测波长为390nm；纯化时流速为5ml/min，收集8.0min或9.0分钟时出现的新的洗脱峰，并用氮气吹干，再冻干，得到peg修饰的dhhp-6即mpeg-dhhp-6。
10.进一步地，所述pbs缓冲液的浓度为0.05m。
11.优选地，所述peg的分子量为5000或20000。
12.本发明的第二个目的是要提供一种利用上述方法制备的peg修饰的dhhp-6。
13.本发明的第三个目的是要提供一种peg修饰的dhhp-6的用途，所述peg修饰的dhhp-6用于制作改善缺血再灌注心脏损伤的药物。
14.与现有技术相比，本发明通过聚乙二醇(peg)修饰合成了mpeg-dhhp-6，增加了dhhp-6的分子量，通过调整二甲基亚砜dmso和pbs缓冲液的体积比为1：1，获得更高的产率；进一步检测mpeg-dhhp-6的稳定性和活性，发现mpeg-dhhp-6的稳定性有所提高，mpeg-dhhp-6能显著降低小鼠缺血再灌注后室性心动过速和心室颤动的发生率和持续时间，优于单独使用dhhp-6的效果；因此，本发明制备的mpeg-dhhp-6可用于制作改善缺血再灌注心脏损伤的药物。
附图说明
15.图1为dhhp-6分子结构图。
16.图2为dhhp-6和mpeg5k-spa高效液相色谱图。
17.图3为mpeg5k-dhhp-6在不同反应体系中的产率。
18.图4为dhhp-6及其衍生物木瓜蛋白酶消化液的rp-hplc谱图。
19.图5为不同组大鼠在缺血和再灌注期间出现的心律失常。
20.图6为大鼠心肌梗塞面积由evens blue/tcc双染色图。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
22.以下实施例所用的dhhp-6是按照现有技术在实验室合成的。α-甲氧基-ω-琥珀酰亚胺基丙酸酯-聚乙二醇(mpeg-spa)的分子量为5kda和20kda，分别从北京键凯科技有限公司购买。其他所有的试剂和溶剂均为分析纯，从常规渠道购买。雄性wistar大鼠(体重250-280g)从吉林大学实验动物中心购买。所有大鼠均饲养在标准条件下，自由进食和饮水。实验前一天停止给食。所有的动物实验均按照吉林大学动物护理和使用委员会的指导原则进行，并得到了该委员会的批准。
23.实施例1
24.取0.1mg的dhhp-6溶解在含有不同体积比的pbs缓冲液(pbs缓冲液的浓度为0.05m，ph＝7.0、7.5或8.0)和0.5ml的二甲基亚砜dmso组成的混合溶剂中，使总体积为1ml；
25.然后向溶液中加入0.12mg peg(分子量为5000或20000)粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液。
26.对比例1
27.取0.1mg的dhhp-6溶解在1ml的二甲基亚砜dmso中；
28.然后向溶液中加入0.12mg peg(分子量为5000或20000)粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液。
29.对比例2
30.取0.1mg的dhhp-6溶解在1ml的二甲基亚砜dmso(含有0.01m三乙胺)中；
31.然后向溶液中加入0.12mg peg(分子量为5000或20000)粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液。
32.分别实施例1、对比例1和对比例2获得的反应液于-40℃冻干后，分别用反相高效液相色谱仪(rp-hplc，agilent 1100系列)进行表征和纯化，色谱柱为eclipse xdb-c18，流动相为含0.1％tfa的水和含0.1％tfa的乙腈，洗脱程序为：以30％b为基线，15分钟内线性升至60％b，分析时流速为1ml/min，检测波长为390nm；纯化时流速为5ml/min，收集8.0min以上出现的新的洗脱峰，根据紫外吸收峰分别收集各组分，并用氮气吹干，再冻干；
33.使用kratosax1ma-cfr maldi-tof ms(shimadzu)从maldi-tof质谱法获得不同洗脱峰的分子量。通过将1ml的等分试样与2ml的基质溶液混合制备样品，基质溶液是α-氰基羟基肉桂酸在50％水/acn和0.3％tfa中的饱和溶液；将337nm氮激光的2ns脉冲的数据以反射模式对每个光谱进行平均，并使用25kv的加速电压进行正离子tof检测。
34.dhhp-6和mpeg5k-spa等摩尔比反应后在rp-hplc中产生两个主要峰(如图2所示)。保留时间为4.0min的峰为dhhp-6，从反应液中收集保留时间为8.0min的新洗脱峰并进行表征。该新洗脱峰的分子量通过maldi-tof ms测定，结果为5887da。尽管由于peg固有的多分散性，maldi-tof ms确定了中点值的分子量范围，但考虑到dhhp-6(1229da)和mpeg5k-spa(4774da)的分子量，获得的偶联物质量与计算的单个分子的质量总和一致，偏差很小，因此新的洗脱峰为mpeg5k-dhhp-6。在mpeg20k-dhhp-6的情况下，新的洗脱峰出现在9.0分钟。通过maldi-tof测定的mpeg20k分子量为19058da，mpeg20k-dhhp-6分子量为20228da。
35.表1和图3显示了mpeg5k-dhhp-6在不同反应体系中的产率。
36.表1
[0037][0038][0039]
当用1.2mg的mpeg-spa5k在ph 7.0的pbs中进行peg修饰反应时，产率较低，约为36％。当pbs的ph值升高到7.5或8.0时，产率分别提高到46％和50％。相比之下，在纯dmso中进行peg修饰化反应，产率非常低，仅为5％左右。当在dmso中加入三乙胺作为催化剂时，产率显著提高，达到约80％。图3显示了mpeg-dhhp-6在不同比例的pbs和dmso混合溶剂中的产率。可以看到，随着混合溶剂中dmso含量的增加，peg修饰反应的产率也随之增加。当pbs和dmso的体积比为1:1时，产率接近100％，而且与pbs的ph值无关。当dmso的体积比大于60％时，混合溶剂变得不稳定，形成悬浮液，导致产率不可靠。因此，我们认为pbs和dmso的体积比为1:1是最佳的反应条件。对于mpeg20k-dhhp-6，其产率与mpeg5k-dhhp-6类似，但略低一
些。
[0040]
因此，采用以下方法制备mpeg-dhhp-6：
[0041]
将0.1mg的dhhp-6溶解在体积比为1：1的pbs缓冲液和二甲基亚砜dmso的混合溶剂中，使总体积为1ml；
[0042]
s2、然后向溶液中加入0.12mg peg(分子量为5000或20000)粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液；
[0043]
s3、将反应液于-40℃冻干后，用反相高效液相色谱仪进行表征和纯化，色谱柱为eclipse xdb-c18，流动相为含0.1％tfa的水和含0.1％tfa的乙腈，洗脱程序为：以30％b为基线，15分钟内线性升至60％b，分析时流速为1ml/min，检测波长为390nm；纯化时流速为5ml/min，收集8.0min或9.0分钟时出现的新的洗脱峰，并用氮气吹干，再冻干，分别得到mpeg5k-dhhp-6和mpeg20k-dhhp-6。
[0044]
进一步，测试制得的mpeg5k-dhhp-6和mpeg20k-dhhp-6的酶活性，具体操作如下：将100μl mpeg5k-dhhp-6或mpeg20k-dhhp-6(0.1mg/ml溶于pbs)、100μl维生素c(5μm/ml溶于pbs)和700μl pbs混合并在37℃水浴中孵育5分钟。然后，将100μl h2o2(pbs中的1mm/ml)添加到前一种混合物中。立即在290nm的uv吸收下评估所获得的溶液5分钟。一个活性单位(u)定义为在25℃和ph 7.0下每分钟氧化1μg维生素c所需的酶量。
[0045]
作为对比：将100μl dhhp-6(0.1mg/ml溶于pbs)、100μl维生素c(5μm/ml溶于pbs)和700μl pbs混合并在37℃水浴中孵育5分钟。然后，将100μl h2o2(pbs中的1mm/ml)添加到前一种混合物中。立即在290nm的uv吸收下评估所获得的溶液5分钟。
[0046]
通过木瓜蛋白酶消化观察peg修饰对dhhp-6稳定性的影响。dhhp-6及其衍生物木瓜蛋白酶消化液的rp-hplc谱图如图4所示，由图4可知，各供试样品均出现6.6min的新洗脱峰。通过maldi-tof ms分析获得的该峰的分子量为1101da。这与dhhp-5一致，其中赖氨酸从dhhp-6水解而来。消化0.5小时后，70％的dhhp-6被水解，而mpeg5k-dhhp-6和mpeg20k-dhhp-6分别保持在95.4％和96.9％。将dhhp-6的酶活性与微过氧化物酶9(mp-9)进行比较，通过细胞色素c的水解获得典型的血红素过氧化物酶模型。dhhp-6具有与mp-9几乎相同的酶活性。由于聚乙二醇化总是导致天然蛋白质和肽的活性丧失，因此有必要检测peg修饰的dhhp-6的酶活性。结果表明，mpeg5k-dhhp-6和mpeg20k-dhhp-6是有效的酶衍生物，与mp-9相比，分别保持88％和81％的活性，具体结果如表2所示。
[0047]
表2
[0048][0049][0050]
为了验证本发明的所述peg修饰的dhhp-6用于制作改善缺血再灌注心脏损伤的药
物，进行小鼠心肌缺血再灌注试验：
[0051]
实验组
[0052]
大鼠随机分为3组(n＝15)：sham、缺血/再灌注组(model)、dhhp-6组(dhhp-6)，分别用dhhp-6(0.1mg/kg，iv)或peg预处理(mpeg20k-dhhp-6)实验组前10分钟，sham组和model组用生理盐水作为平行对照。
[0053]
体内动物实验
[0054]
20％氨基甲酸乙酯(0.5ml/100g，ip)麻醉后，大鼠仰卧固定在手术台上，连接bl-420e生物功能系统心电图线，分离右颈总动脉，左心室插管带有压力传感器。气管插管后，打开左侧第三、四肋间胸腔，接小动物呼吸器(潮气量8-12毫升，1:2呼吸，呼吸频率70-80次/分)暴露心脏。舌下静脉注射dhhp-6(1mg/kg)或peg修饰的dhhp-6(1.2mg/kg，经mpeg-20k修饰后性能下降80％)，10分钟后，找到左冠状动脉前降支和将附有细针的尼龙缝合线置于左冠状动脉前降支下，立即用套索结扎冠状动脉。心电图ⅱ记录st段抬高，r波增宽，动脉血压下降20％-30％可确认缺血成功。st段抬高下降50％以上即为再灌注成功的信号缺血再灌注后，再次结扎绞索，经颈动脉注入文士蓝0.2ml，左心室自猿至基部切成2mm厚的横截面，37℃与1％三苯基氯化四唑(ttc)孵育磷酸盐缓冲液(ph 7.4)，ttc与细胞内脱氢酶反应，将活组织染成红色，使梗塞区域呈灰白色。心肌活检被制成彩色数码照片。通过计算机图像分析系统(image plus 6.0)计算梗塞面积(is)、危险面积(aar)和梗塞与危险面积的比率(is/aar)。
[0055]
图5显示了不同组大鼠在缺血和再灌注期间出现的心律失常的示例。我们用室性心律失常事件(vae)的数量和最后发生时间来评估心律失常的敏感性。在缺血前，所有组大鼠的基线vae都很少(范围0-6事件)。缺血后，所有组大鼠的vae都增加了，其中model组大鼠的vae在缺血10分钟和再灌注开始时达到最高，而dhhp-6组和dhhp-6-peg组大鼠的vae则显著降低，结果如表3所示。
[0056]
表3
[0057][0058]
*p《0.05,compared to model，#p《0.05compared to dh-hp-6。
[0059]
由表3和图5可知：随着再灌注时间的延长，dhhp-6组和dhhp-6-peg组大鼠的vae分别减少了52％和67％，而且vf和vt的最后发生时间也明显推迟。特别是，在dhhp-6-peg组大鼠中，几乎没有观察到vf的发生。这些结果表明，dhhp-6和dhhp-6-peg预处理均能有效地抑制心肌缺血再灌注诱导的心律失常，而且dhhp-6-peg的效果更好。
[0060]
图6为大鼠心肌梗塞面积由evens blue/tcc双染色图，均匀的蓝色可以将非梗塞部分染成蓝色。ttc可使正常心肌染成砖红色，而梗死部分未染。与模型大鼠心脏相比，dhhp-6和peg治疗组大鼠心脏的梗塞面积显着减小，结果如表4所示。
[0061]
表4
[0062][0063]
由表4和图6可知：所有组均显示相似的aar/lv。在dhhp-6和peg治疗大鼠心脏中观察到比匹配模型组更小的is/aar。但在dhhp-6和peg组之间观察到相似的梗塞面积，这表明两组之间在减少梗塞面积方面具有相似的功效。
[0064]
综上所述，本发明在体积比为1:1的pbs和dmso的混合溶剂中进行peg修饰反应，成功地制备了dhhp-6的peg修饰衍生物mpeg-dhhp-6，且能够获得高达100％的产率，而且不需要三乙胺作为催化剂。peg修饰后，dhhp-6的抗蛋白酶降解能力显著提高，而过氧化物酶活性仅有轻微的降低。在小鼠心肌缺血再灌注模型中，mpeg-dhhp-6预处理能够有效地减少心肌梗死面积和心律失常的发生，表现出强大的心脏保护作用。因此，本发明制备的mpeg-dhhp-6是一种具有潜力的心血管药物候选物，值得进一步的研究和开发。
[0065]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种peg修饰的dhhp-6的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将0.1mg的dhhp-6溶解在体积比为1：1的pbs缓冲液和二甲基亚砜dmso的混合溶剂中，使总体积为1ml；s2、然后向溶液中加入0.12mgpeg粉末，混匀，反应在室温下进行2小时后终止，得到反应液；s3、将反应液于-40℃冻干后，用反相高效液相色谱仪进行表征和纯化，色谱柱为eclipsexdb-c18，流动相为含0.1％tfa的水和含0.1％tfa的乙腈，洗脱程序为：以30％b为基线，15分钟内线性升至60％b，分析时流速为1ml/min，检测波长为390nm；纯化时流速为5ml/min，收集8.0min或9.0分钟时出现的新的洗脱峰，并用氮气吹干，再冻干，得到peg修饰的dhhp-6即mpeg-dhhp-6。2.根据权利要求1所述的peg修饰的dhhp-6的制备方法，其特征在于：所述pbs缓冲液的浓度为0.05m。3.根据权利要求1所述的peg修饰的dhhp-6的制备方法，其特征在于：所述peg的分子量为5000或20000。4.一种如权利要求1-3任一所述的方法制备的peg修饰的dhhp-6。5.一种如权利要求4所述的peg修饰的dhhp-6的用途，其特征在于：所述peg修饰的dhhp-6用于制作改善缺血再灌注心脏损伤的药物。

技术总结
本发明公开了一种PEG修饰的DhHP-6及其制备方法和用途，本发明通过聚乙二醇(PEG)修饰合成了mPEG-DhHP-6，增加了DhHP-6的分子量，通过调整二甲基亚砜DMSO和PBS缓冲液的体积比为1：1，获得更高的产率；进一步检测mPEG-DhHP-6的稳定性和活性，发现mPEG-DhHP-6的稳定性有所提高，mPEG-DhHP-6能显著降低小鼠缺血再灌注后室性心动过速和心室颤动的发生率和持续时间，优于单独使用DhHP-6的效果；因此，本发明制备的mPEG-DhHP-6可用于制作改善缺血再灌注心脏损伤的药物。心脏损伤的药物。心脏损伤的药物。


技术研发人员：陆通 董晗 曹公译 王春洋 齐翀 徐廷双 于野
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/9/12