灭活乳酸菌制剂的应用及其应用方法

1.本发明属于微生物去除真菌毒素技术领域，涉及一种灭活乳酸菌制剂的应用，还涉及灭活乳酸菌制剂吸附大米储藏时产生的霉菌毒素的方法。


背景技术：

2.全世界每年约有25％的谷物由于真菌毒素的污染而影响食用。霉变损耗在大米入库仓储的过程损耗中占据相当比重，如何高效、绿色、经济地减少真菌毒素带来的霉变感染是节粮减损中重要的一环。稻谷在储藏时易生黄曲霉、赭曲霉等真菌及其生产的霉菌毒素，如若不及时遏制粮库中的霉菌污染，不仅对其余粮食的保存产生威胁导致大米营养价值降低甚至产生毒害，还会发生极大的粮食浪费。目前大米中霉菌毒素的脱毒方法：利用有活性乳酸菌代谢过程中产生的小分子物质和特殊酶系抑制消除霉菌毒素，使用100℃以上高温进行处理、小苏打浸泡、辐射处理、直接丢弃等。
3.当前主要通过物理、化学的方法消减真菌毒素含量。但是这些方法具有破坏营养、去毒不彻底和成本高等缺陷，还容易造成毒素残留损害健康，从而造成实际防控、脱毒效果不理想。利用生物技术来脱毒除毒是节粮减损目前亟待拓展的领域，在未来具有强大的潜力。微生物制剂除毒的过程绿色环保，与物理方法相比能最大程度上保留粮食原有的营养价值和风味，与化学方法相比更健康安全。迄今为止，包括黄曲霉、寄生曲霉、烟曲霉等10种重要曲霉的全基因组序列已经测定完成和公布。这为进一步明晰产毒真菌的生理生化特性和毒素合成的机理提供了极其难得的研究平台，也给针对产毒真菌特性制造合适生物试剂提供可靠的理论支撑。乳酸菌可以通利用代谢产物来降解霉菌毒素尤其是大米中易生的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素，一般来说，活性乳酸菌主要靠其代谢产物和生产的特殊酶系降解霉菌毒素，然而由于这些产物的特殊性质，用这种机理处理大米时对处理温度、酸碱度、湿度等环境条件要求极高，不便于在粮库仓储时使用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灭活乳酸菌制剂的应用，还提供一种去除大米感染霉菌毒素的方法。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.1.灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用，所述灭活乳酸菌制剂为灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液的混合制剂。
7.进一步灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用中，所述灭活为热灭活，即将培养的鼠李糖乳杆菌菌液和乳酸乳球菌菌液在70℃处理2-3小时。
8.进一步灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用中，所述灭活乳酸菌制剂中灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液体积比为1:1-2。
9.进一步，在应用时，再加入壳聚糖。
10.2.本发明还提供一种用灭活乳酸菌制剂吸附大米储藏时产生的霉菌毒素的方法，
具体方法为在被霉菌毒素侵染的大米中添加灭活乳酸菌制剂，待静置吸附5-10小时后，过滤出大米，干燥后再加入壳聚糖储藏。
11.进一步所述的方法中，所述灭活乳酸菌制剂为灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液的混合制剂。
12.进一步所述的方法中，所述灭活乳酸菌制剂中灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液体积比为1:1-2。
13.进一步所述的方法中，鼠李糖乳杆菌菌液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌用固体mrs培养基富集培养，再挑单菌落用液体mrs培养基在37℃培养24-48小时即可；乳酸乳球菌菌液的制备方法为：将乳酸乳球菌用固体mrs培养基富集培养，再挑单菌落用液体mrs培养基在37℃培养24-48小时即可。
14.进一步所述的方法中，所述灭活为所述灭活为热灭活，即将培养的鼠李糖乳杆菌菌液和乳酸乳球菌菌液在70℃处理2-3小时。
15.进一步所述的方法中，壳聚糖的加入量为大米质量的0.2-0.5％。
16.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种以灭活的鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌按照一定配比制备的乳酸菌制剂，该菌剂可以吸附大米储藏时产生的黄曲霉菌和赭曲霉菌等霉菌毒素，乳酸菌细胞壁由肽聚糖基质、蛋白质s层、中性多糖组成。这些组分具有黏附和结合大分子等的功能。乳酸菌细胞以细胞壁组分和霉菌毒素之间形成细胞外弱共价键来结合毒素，该过程为物理过程，活性乳酸菌也可以经由此过程与霉菌毒素产生结合。当对乳酸菌进行热灭活处理，灭活后细胞壁上的完整性被破坏，肽聚糖的交联被打破，从而导致孔径增加，此时毒素不仅与细胞壁结合，还可以与细胞壁内的原生质膜结合，从而导致对毒素吸附能力的增加，同时也避免了乳酸菌新陈代谢过程中产生有害物质，提高了生物安全性。并且灭活乳酸菌细胞吸收了毒素后对肠道上皮细胞的黏附能力下降，假如有残余灭活乳酸菌不慎被食用入人体，对人体健康的损害也大大降低至几乎为零。灭活乳酸菌细胞与霉菌毒素结合的产物即便受到高温处理也不会解除结合。
17.本发明所提供的用混合灭活乳酸菌吸附大米储藏时产生的霉菌毒素的方法，不仅是在存在被霉菌毒素侵染隐患的大米中添加混合灭活乳酸菌制剂，还添加壳聚糖可阻隔水分抑制大米呼吸作用，延长了大米保存期，不易再度被霉菌感染，减少大米储藏过程中损耗的生物产品。本发明的灭活乳酸菌消除霉菌毒素的影响利用细胞壁和细胞壁内的原生质膜对毒素的吸附结合，这个物理过程不受环境条件的影响，可以在粮食仓储时应用。
附图说明
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
19.图1为实施例4实验中的第30天实物图；
20.图2为实施例4实验中的第60天实物图；
21.图3为实施例4实验中的第90天实物图；
22.图4为实施例4实验中的第120天实物图；
23.图5为实施例4实验中的第150天实物图；
24.图6为实施例4实验中的第180天实物图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的优选实施例技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
26.实施例1
27.本发明中混合灭活乳酸菌制剂制备方式：配制两份乳酸菌用的固体mrs培养基(mrs培养基，原料包括蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸钾铵、琼脂等，北京陆桥技术股份有限公司生产，称取65g加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟)，分别用以培养0.2ml鼠李糖乳杆菌和0.2ml乳酸乳球菌(由atcc菌种保藏中心提供的冻干菌株复苏活化后传代培养得到，为第二代)。在35℃恒温培养2天，取菌落做富集培养。先加入12ml mrs培养基，凝固后注入5ml水琼脂培养基，上述两种菌落在此培养基和厌氧环境下35℃培养2天，挑取菌落划线纯化2次，取单菌落接入液体mrs培养基(mrs培养基，原料包括蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸钾铵、琼脂等，北京陆桥技术股份有限公司生产，称取6.5g加热溶解于100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟)，在37℃培养24-48小时，培养完毕后，将培养的菌液在70℃处理3小时得热灭活的鼠李糖乳杆菌液和乳酸乳球菌液。将灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液按1:1-2体积量均匀混合后，得混合灭活乳酸菌制剂，使用时再将混合灭活乳酸菌制剂与无菌水按照1：50-100体积比混匀。优选的按灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液1:1体积量均匀混合，下述实施例均按1：1体积量混合。
28.取0.1g黄曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入100倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。同样取0.1g赭曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入100倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。两组大米在室温条件下静置5小时，期间可翻动1～2次。过滤出大米，分别取混合液用酶标仪检测霉菌毒素浓度，结果如表1所示。酶标仪荧光强度表示霉菌毒素浓度，霉菌毒素发荧光，荧光强度为荧光区域与非荧光区域面积比值。结果表明混合灭活乳酸菌制剂对黄曲霉素和赭曲霉素均有吸附效果，且5小时基本吸附完全。
29.表1黄曲霉素和赭曲霉素被混合灭活乳酸菌制剂吸附过程中的荧光强度变化
[0030][0031]
实施例2
[0032]
取0.1g黄曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入壳聚糖粉末0.2份。同样取0.1g赭曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入壳聚糖粉末0.2份。
[0033]
两组大米在室温条件下静置5小时，期间可翻动1～2次。分别取恰好铺满表面皿一
层的混合固体用酶标仪检测霉菌毒素浓度，霉菌毒素发荧光，荧光强度为荧光区域与非荧光区域面积比值。结果如表2所示，结果表明壳聚糖粉末对黄曲霉素和赭曲霉素没有吸附效果。
[0034]
表2黄曲霉素和赭曲霉素被壳聚糖粉末吸附过程中的荧光强度变化
[0035][0036]
实施例3
[0037]
取1g黄曲霉菌菌丝磨碎混入1000g正常大米，加入80倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。同样取1g赭曲霉菌菌丝磨碎混入1000g正常大米，加入80倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。两组大米在室温条件下静置5小时，期间可翻动1～2次。过滤出大米，分别将各混合液均分为7份，在10℃-130℃梯度温度下分别用酶标仪检测霉菌毒素浓度，结果如表3所示，酶标仪荧光强度表示霉菌毒素浓度，结果表明混合灭活乳酸菌制剂对霉菌毒素的吸附一定范围内不受温度的影响。
[0038]
表3不同温度处理下灭活乳酸菌与霉素毒素结合物的释放情况
[0039][0040]
实施例4
[0041]
取0.5g黄曲霉菌菌丝磨碎混入500g正常大米，加入80倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。同样取0.5g赭曲霉菌菌丝磨碎混入500g正常大米，加入80倍稀释后的混合灭活乳酸菌制剂到至少没过大米。大米在室温条件下静置5小时，期间可翻动1～2次。过滤出大米并在50℃-70℃烘干，将其均分为两组，第一组不加入任何试剂，第二组加入壳聚糖粉末0.3g并充分翻拌均匀。在同一25℃潮湿环境下静置180天，图1-图6分别为第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天的实验实物图，左边为加了壳聚糖粉末组，右边为未加壳聚糖粉末组。从第30天开始每30天分别取样检测大米中霉菌毒素的浓度，具体数据见表4，结果表明，经混合灭活乳酸菌制剂处理后再加入壳聚糖粉末的大米延长了大米保存期，不易再度被霉菌感染。
[0042]
表4同一环境下加入和未加入壳聚糖粉末的大米再度被真菌感染的情况
[0043][0044][0045]
对比例1
[0046]
配制两份乳酸菌琼脂培养基(mrs培养基，原料包括蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸钾铵、琼脂等，北京陆桥技术股份有限公司生产，称取65g加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟)分别用以培养0.2ml鼠李糖乳杆菌和0.2ml乳酸乳球菌(由atcc菌种保藏中心提供的冻干菌株复苏活化后传代培养得到，为第二代)。在35℃恒温培养2天，取菌落做富集培养。先加入12mlmrs培养基，凝固后注入5ml水琼脂培养基，上述两种菌落在此培养基和厌氧环境下35℃培养2天，挑取菌落划线纯化2次，取单菌落接入液体培养基(mrs培养基，原料包括蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸钾铵、琼脂等，北京陆桥技术股份有限公司生产，称取6.5g加热溶解于100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟)，在37℃培养24-48小时，培养完毕后，将培养的菌液不进行热灭活处理，两种菌液等份体积量均匀混合后，得混合活性乳酸菌制剂。使用时同样再与无菌水按照1：50-100体积比混匀，。
[0047]
取0.1g黄曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入100倍稀释后的活乳酸菌制剂到至少没过大米。同样取0.1g赭曲霉菌菌丝磨碎混入100g正常大米，加入100倍稀释后的活乳酸菌制剂到至少没过大米。两组大米在室温条件下静置5小时，期间可翻动1～2次。过滤出大米，分别取混合液用酶标仪检测霉菌毒素浓度，具体数据见表5，结果表明未经灭活的活乳酸菌制剂对黄曲霉素和赭曲霉素吸附效果较差，有显著的差异。
[0048]
表5黄曲霉素和赭曲霉素被混合活性乳酸菌制剂吸附过程中的荧光强度变化
[0049][0050]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌制剂为灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液的混合制剂。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活为热灭活，即将培养的鼠李糖乳杆菌菌液和乳酸乳球菌菌液在70℃处理2-3小时。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌制剂中灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液体积比为1:1-2。4.灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用，其特征在于，应用时，再加入壳聚糖。5.一种用灭活乳酸菌制剂吸附大米储藏时产生的霉菌毒素的方法，其特征在于，具体方法为在被霉菌毒素侵染的大米中添加灭活乳酸菌制剂，待静置吸附5-10小时后，过滤出大米，干燥后再加入壳聚糖储藏。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述灭活乳酸菌制剂为灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液的混合制剂。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活乳酸菌制剂中灭活的鼠李糖乳杆菌菌液和灭活的乳酸乳球菌菌液体积比为1:1-2。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，鼠李糖乳杆菌菌液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌用固体mrs培养基富集培养，再挑单菌落用液体mrs培养基在37℃培养24-48小时即可；乳酸乳球菌菌液的制备方法为：将乳酸乳球菌用固体mrs培养基富集培养，再挑单菌落用液体mrs培养基在37℃培养24-48小时即可。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活为所述灭活为热灭活，即将培养的鼠李糖乳杆菌菌液和乳酸乳球菌菌液在70℃处理2-3小时。10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于，壳聚糖的加入量为大米质量的0.2-0.5％。

技术总结
本发明涉及一种灭活乳酸菌制剂在吸附大米储藏时产生的霉菌毒素中的应用，并提供了用混合灭活乳酸菌吸附大米储藏时产生的霉菌毒素的方法，具体的以混合热灭活乳酸菌和壳聚糖配合使用，可物理吸附被大米表面污染的霉菌毒素，以期能在最大程度上保持大米原有风味，并且大幅减少二次侵染的可能。本发明的灭活乳酸菌制剂利用细胞壁和细胞壁内的原生质膜对霉菌毒素的吸附结合，这个物理过程且不受环境条件的影响，可以在粮食仓储时应用。可以在粮食仓储时应用。可以在粮食仓储时应用。


技术研发人员：王丹 何亭静 罗筱 周小洁 翟力 宋嘉仪
受保护的技术使用者：重庆大学
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/9/12