抗肿瘤共价修饰莪术醇衍生物及其制备方法与应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及含有michael受体的莪术醇衍生物，及其合成方法与其在恶性肿瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.环境污染和人类生活方式的改变等因素的存在，导致恶性肿瘤的发病率成年上升，严重威胁着人类健康。世界卫生组织公布的最新统计数据显示，2020年全球恶性肿瘤新增病例为1930万例，新增死亡病例为1000万例；其中我国新增病例约为457万例，死亡病例约为300万例，均位居世界首位。
3.小分子化学药物是对抗恶性肿瘤的主要手段，临床上常用的抗肿瘤药物主要包括细胞毒药物和靶向药物两种。然而细胞毒药物，通常表现出较强的毒副作用，严重影响了恶性肿瘤患者的生存质量。靶向药物，则表现出日益增加的耐药性，成为其临床应用的瓶颈。因此亟需发展高效低毒，治疗指数高的抗肿瘤药物，来应对这一挑战。
4.莪术为姜科植物蓬莪术(curcumaphaeocaulis val.)、广西莪术(curcuma kwangsiensis s.g..lee et c.f.liang)、温莪术(curcuma wenyujin y.h.chen et c.ling)等的干燥根茎，是一味传统的道地药材，在我国有很长的使用历史。莪术最早记录于唐代甄权的《药性论》，《本草纲目》有“莪术，辛温无毒，其色黑，能破气中之血”的记载，《本草经疏》曾记载“蓬术味辛性烈，专攻气中之血，主破积消坚，去积聚癖块，经闭血瘀，扑报疼痛”，《萃金裘本草述录》也指出“广茂即莪术，凡行气破血，消积散结皆用之”。与之相对应的是，现代医学证明莪术挥发油具有抗肿瘤、抗菌、抗早孕、抗炎、保肝护肝等多种治疗功能。尤其是是抗肿瘤作用，疗效确切，效果明显，引起了广泛关注。莪术醇是莪术挥发油发挥抗肿瘤作用的物质基础之一。可通过阻滞细胞周期、诱导凋亡等多种机制发挥抗肿瘤作用，对结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、胆管癌等多种类型恶性肿瘤细胞均具有抑制活性，且作为外用药物，在我国曾短暂应用于宫颈癌的临床治疗。然而，抗肿瘤活性不佳、水溶性差、作用机制不明确等问题的存在，严重制约了进一步新药开发的进行。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明目的旨在根据共价修饰策略制备含有michael受体的莪术醇衍生物，并研究其抗肿瘤活性。
6.共价修饰是指在生物活性分子中引入高活性反应基团，使其与内源性靶蛋白发生反应形成共价键，不可逆地持续改变靶蛋白功能，进而发挥治疗作用。由于可使生物活性分子与靶蛋白的结合更牢固，作用时间更长，这一策略已成为增强药效、克服获得性耐药性、进行抗肿瘤新药开发的有效方式。
7.有鉴于此，本发明第一个方面公开了一种含有反应性michael受体的莪术醇衍生物。
8.优选地，上述的莪术醇衍生物的结构通式如下：
[0009][0010]
结构通式i中r1基团代表氢原子、烷基、芳基、杂芳基、杂芳甲基等；r2基团代表氢原子、烷基等。其中：
[0011]
所述烷基为c1-c6烷基或氘代烷基；
[0012]
所述芳基为苯基、取代苯基；
[0013]
所述取代苯基，取代基为卤素；
[0014]
所述杂芳基为吡啶基或取代吡啶基；
[0015]
所述杂芳甲基为吡啶甲基、取代吡啶甲基。
[0016][0017]
结构通式ii中r3基团代表氢原子、羟基、氰基、含氮杂环。其中：所述含氮杂环为4元至7元含氮杂环。
[0018][0019]
结构通式iii中r4和r5基团代表烷基。其中：
[0020]
所述烷基为c1-c6烷基或氘代烷基。
[0021]
进一步优选，所述衍生物为以下化合物：
[0022]
[0023]
[0024]
[0025][0026]
本发明所述两类莪术醇衍生物通过如下制备方法获得：
[0027][0028]
本发明第二个方面还提供了上述衍生物的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0029]
莪术醇首先与mcpba反应，生成环氧中间体，之后在加热以及碱性条件下，环氧化合物开环后消除得到羟基化合物ii，收率56％。
[0030]
化合物ii与dess-martin氧化剂反应后被氧化，得到化合物s1，收率78％。
[0031]
化合物s1在亚氯酸钠以及过氧化氢的作用下被氧化，得到化合物s2，收率93％。
[0032]
化合物s2与各类胺发生缩合反应，得到化合物s3-s17，收率86-97％。
[0033][0034]
室温条件下，水合三氯化钌作为催化剂，莪术醇被高碘酸钠氧化得到化合物iii，收率85％。
[0035]
化合物iii与多聚甲醛发生羟醛缩合反应，得到化合物s18，收率37％。
[0036]
化合物s18与二甲胺进行加成反应得到化合物s19，收率98％。
[0037]
本发明第三个方面公开了上述莪术醇衍生物在制备治疗癌症药物中的应用。药物中的活性成分主要为上述的莪术醇衍生物。所述癌症包括但不限于结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、胆管癌等多种类型恶性肿瘤癌症。
[0038]
与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：
[0039]
本发明以共价修饰为核心策略，我们合成了两类具有反应性michael受体的莪术醇衍生物。这些衍生物结构中，含有α,β-不饱和醛、α,β-不饱和酸、α,β-不饱和酰胺、α,β-不饱和酮，α,β-不饱和氰等反应性michael受体，对多种肿瘤细胞都表现出较之莪术醇更优的抑制活性，有望开发为高效低毒的抗肿瘤药物。
具体实施方式
[0040]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0041]
实施例1：化合物s1的合成：
[0042]
0℃下，向化合物ii(200mg,0.79mmol,1equiv.)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入nahco3(133mg,1.58mmol,2equiv.)和dess-martin氧化剂(503mg,1.19mmol,1.5equiv.)。室温下搅拌6小时，反应完成后用饱和nh4cl溶液淬灭。用乙酸乙酯萃取，分离有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩，旋干并通过柱层析(pe:ea＝5:1)纯化，得到化合物s1，得到白色固体20mg，产率为78％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.54(s,1h),6.81(s,1h),3.02(s,1h),2.39
–
2.23(m,2h),2.20
–
2.08(m,1h),2.00
–
1.85(m,2h),1.75(m,1h),1.48
–
1.36(m,2h),1.26(m,2h),1.06(d,j＝6.5hz,3h),1.03(d,j＝6.4hz,3h),0.90(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
15h23
o3251.1647；found 251.1645.
[0043]
实施例2：化合物s2的合成
[0044]
室温下，向化合物s1(200mg,0.79mmol,1equiv.)、nah2po4(28mg,0.24mmol,0.3equiv.)和30％h2o2水溶液(0.08ml)的ch3cn(0.6ml)和水(0.3ml)的混合溶液中加入naclo2(100mg,1.11mmol,1.4equiv.)。室温下将反应液搅拌过夜，反应完成后，用2n hcl水溶液酸化，之后过滤得到所需的化合物s2，得到白色固体25mg，产率为93％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ6.58(s,1h),5.82(s,1h),2.30(t,j＝8.2hz,1h),2.12(t,j＝11.9hz,1h),1.85(m,2h),1.65(m,2h),1.41(m,2h),1.33(m,1h),1.28
–
1.20(m,1h),0.94(d,j＝6.4hz,3h),0.90(d,j＝6.4hz,3h),0.85(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
15h23
o4267.1596；found 267.1595.
[0045]
实施例3：化合物s3的合成
[0046]
室温下，向化合物s2(20mg,0.08mmol,1equiv.)、edci(18mg,0.096mmol,1.2equiv.)、hobt(13mg,0.096mmol,1.2equiv.)、dipea(42μl,0.24mmol,3equiv.)的无水dcm溶液中加入哌嗪(7.6mg,0.088mmol,1.1equiv.)。25℃下搅拌过夜，反应完成后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩，旋干并通过柱层析纯化，得到化合物s3，得到白色固体29mg，产率为86％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.91(s,1h),3.60(m,4h),2.48(t,j＝9.2hz,1h),2.24(m,1h),1.95
–
1.77(m,6h),1.70(m,2h),1.61
–
1.54(m,1h),1.51
–
1.36(m,4h),1.02(d,j＝6.1hz,3h),0.98(d,j＝6.5hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
19h31
n2o3335.2335；found 335.2337.
[0047]
实施例4：化合物s4的合成
[0048]
哌嗪替换为相同当量比下的n-甲基哌嗪，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到29mg白色固体s4，收率为89％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.87(d,j＝1.5hz,1h),3.80(m,4h),2.80(s,3h),2.48(t,j＝9.2hz,1h),2.25(m,2h),1.99
–
1.79(m,3h),1.78
–
1.59(m,5h),1.55
–
1.48(m,2h),1.42(m,1h),1.02(d,j＝6.3hz,3h),0.98(d,j＝6.4hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
20h33
n2o3349.2491；found 349.2489.
[0049]
实施例5：化合物s5的合成
[0050]
哌嗪替换为相同当量比下的吗啉，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到31mg白色固体s5，收率为93％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.87(d,j＝1.6hz,1h),3.90
–
3.46(m,8h),2.93(s,1h),2.50(m,1h),2.25(m,1h)1.99
–
1.81(m,3h),1.64
–
1.57(m,2h),1.50(m,2h),1.42(m,1h),1.02(d,j＝6.3hz,3h),0.98(d,j＝6.4hz,3h),0.88(d,j＝6.4hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
19h30
no4336.2175；found 336.2173.
[0051]
实施例6：化合物s6的合成
[0052]
哌嗪替换为相同当量比下的哌啶，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到32mg白色固体s4，收率为97％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.84(d,j＝1.6hz,1h),3.86
–
3.38(m,4h),3.00(s,1h),2.51
–
2.42(m,1h),2.24(m,1h),1.97
–
1.80(m,3h),1.71
–
1.48(m,10h),1.42(m,1h),1.02(d,j＝6.2hz,3h),0.98(d,j＝6.4hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
20h32
no3334.4800；found 334.4801.
[0053]
实施例7：化合物s7的合成
[0054]
哌嗪替换为相同当量比下的四氢吡咯，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到30mg白色固体s4，收率为93％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.04
–
6.00(s,1h),3.73
–
3.39(m,4h),3.07(s,1h),2.53(t,j＝8.7hz,1h),2.24(m,1h),1.99
–
1.80(m,7h),1.68
–
1.46(m,4h),
1.40(m,1h),1.02(d,j＝6.0hz,3h),0.98(d,j＝6.4hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
19h30
no3320.2226；found 320.2228.
[0055]
实施例8：化合物s8的合成
[0056]
哌嗪替换为相同当量比下的氮杂环丁烷，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到29mg白色固体s4，收率为96％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.10(d,j＝1.4hz,1h),4.38
–
3.98(m,4h),2.85(s,1h),2.47(m,1h),2.34
–
2.18(m,3h),2.06
–
1.81(m,3h),1.69
–
1.55(m,2h),1.52
–
1.41(m,2h),1.34(m,1h),1.01(d,j＝6.7hz,3h),0.99(d,j＝6.5hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcdfor c
18h28
no3306.4260；found 306.4261.
[0057]
实施例9：化合物s9的合成
[0058]
哌嗪替换为相同当量比下的二乙胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到31mg白色固体s4，收率为97％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.86(s,1h),3.40(m,4h),2.88(s,1h),2.44(t,j＝8.6hz,1h),2.25(m,1h),1.93
–
1.80(m,2h),1.69
–
1.51(m,4h),1.41(m,1h),1.15(t,j＝7.1hz,6h),1.02(d,j＝6.0hz,3h),0.99(d,j＝6.4hz,3h),0.89(d,j＝6.4hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+c19h32
no3322.2382；found 322.2382.
[0059]
实施例10：化合物s10的合成
[0060]
哌嗪替换为相同当量比下的正丙胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到30mg白色固体s4，收率为97％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.47(d,j＝1.5hz,1h),5.79(s,1h),3.29(m,2h),2.93(s,1h),2.46
–
2.37(m,1h),2.23(m,1h),2.08
–
1.82(m,3h),1.72
–
1.46(m,7h),1.31(m,1h),1.02(m,5h),0.94(t,j＝7.4hz,3h),0.87(d,j＝6.5hz,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ166.9,140.0,132.2,103.2,87.4,60.2,48.0,41.3,40.4,36.0,31.2,30.5,28.1,22.8,22.6,21.5,11.5,11.4.hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
18h30
no3308.2226；found 308.2225.
[0061]
实施例11：化合物s11的合成
[0062]
哌嗪替换为相同当量比下的正丁胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到30mg白色固体s4，收率为92％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ6.46(d,j＝1.4hz,1h),5.74(s,1h),3.32(m,2h),2.81(s,1h),2.42(m,1h),2.23(m,1h),2.03
–
1.84(m,3h),1.70
–
1.61(m,2h),1.56
–
1.46(m,4h),1.41
–
1.26(m,4h),1.02(m,5h),0.94(t,j＝7.3hz,3h),0.88(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
19h32
no3322.4690；found 322.4693.
[0063]
实施例12：化合物s12的合成
[0064]
哌嗪替换为相同当量比下的苯胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到32mg白色固体s4，收率为95％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.56(d,j＝8.1hz,2h),7.34(t,j＝7.8hz,2h),7.12(t,j＝7.4hz,1h),6.62(d,j＝1.5hz,1h),3.05(s,1h),2.56(t,j＝9.0hz,1h),2.27(m,1h),2.12
–
2.01(m,1h),2.01
–
1.85(m,2h),1.70(m,2h),1.57
–
1.46(m,2h),1.40
–
1.31(m,1h),1.04(t,j＝5.8hz,6h),0.89(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
18h30
no3342.2069；found 342.2070.
[0065]
实施例13：化合物s13的合成
[0066]
哌嗪替换为相同当量比下的n-甲基苯胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到32mg白色固体s4，收率为90％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.37(m,2h),7.31
–
7.28(m,1h),7.19
–
7.10(m,2h),5.76(d,j＝1.5hz,1h),3.33(s,3h).2.05(s,1h),1.95
–
1.83(m,2h),
1.80
–
1.70(m,2h),1.53
–
1.47(m,3h),1.28
–
1.18(m,3h),0.94(d,j＝6.6hz,3h),0.79(d,j＝4.2hz,3h),0.70(d,j＝2.4hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
22h30
no3356.2226；found 356.2225.
[0067]
实施例14：化合物s14的合成
[0068]
哌嗪替换为相同当量比下的4-氟苯胺，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到33mg白色固体s4，收率为91％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.65(s,1h),7.52(m,2h),7.02(t,j＝8.5hz,2h),6.62(s,1h),2.54(t,j＝9.0hz,1h),2.27(t,j＝11.9hz,1h),2.07(t,j＝9.4hz,1h),1.95(m,2h),1.76
–
1.46(m,4h),1.35(m,1h),1.04(t,j＝5.9hz,6h),0.89(d,j＝6.6hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+c21h27
fno3360.1975；found 360.1974.
[0069]
实施例15：化合物s15的合成
[0070]
哌嗪替换为相同当量比下的2-氨基吡啶，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到33mg白色固体s4，收率为95％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.74(dd,j＝4.5,1.4hz,1h),8.44(dd,j＝8.4,1.4hz,1h),7.50(d,j＝1.5hz,1h),7.46(dd,j＝8.4,4.5hz,1h),2.53(m,1h),2.34(m,1h),2.23(m,1h),2.01
–
1.91(m,2h),1.87
–
1.63(m,5h),1.42(m,1h),1.09(d,j＝6.5hz,3h),1.06(d,j＝6.2hz,3h),0.95(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
20h27
n2o3343.2022；found 343.2023.
[0071]
实施例16：化合物s16的合成
[0072]
哌嗪替换为相同当量比下的4-氨基吡啶，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到31mg白色固体s4，收率为92％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.54
–
8.44(m,2h),8.01(s,1h),7.58
–
7.52(m,2h),6.69(d,j＝1.4hz,1h),2.59
–
2.53(m,1h),2.28(m,1h),2.11
–
1.88(m,3h),1.74(m,1h),1.67
–
1.59(m,1h),1.56
–
1.45(m,2h),1.35(m,1h),1.07
–
1.00(m,6h),0.89(d,j＝6.5hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
20h27
n2o3343.2022；found343.2024.
[0073]
实施例17：化合物s17的合成
[0074]
哌嗪替换为相同当量比下的4-甲氨基吡啶，其余试剂、操作同s3的合成一样，得到34mg白色固体s4，收率为97％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.56(d,j＝5.1hz,1h),7.70(m,1h),7.30(d,j＝9.7hz,2h),6.69(d,j＝1.6hz,1h),4.64(t,j＝4.1hz,2h),2.47(t,j＝9.1hz,1h),2.25(m,1h),2.05(s,1h),1.91(m,2h),1.76
–
1.67(m,1h),1.54
–
1.47(m,2h),1.33(m,2h),1.03(m,6h),0.87(d,j＝6.8hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
21h29
n2o3357.2178；found 357.2175.
[0075]
实施例18：化合物s18的合成
[0076]
室温下，向化合物iii(100mg,0.42mmol,1equiv.)的dmf(0.5ml)溶液中依次加入多聚甲醛(63mg,2.1mmol,5equiv.)、哌啶(6μl,0.055mmol,0.13equiv.)和acoh(5μl,0.092mmol,0.22equiv.)。将所得混合物在90℃下加热1小时。反应完成后，向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩，旋干并通过柱层析(pe:ea＝5:1)纯化，得到10mg白色固体s18，产率为37％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.28(d,j＝1.6hz,1h),5.77(d,j＝1.6hz,1h),2.46(m,1h),2.30(m,1h),2.07
–
1.96(m,2h),1.88
–
1.77(m,2h),1.76
–
1.67(m,1h),1.55
–
1.45(m,1h),1.37(m,1h),1.24(m,1h),1.01(d,j＝6.5hz,3h),0.89(d,j＝6.4hz,3h),0.85(d,j＝6.6hz,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ200.7,144.7,
121.9,105.5,86.2,60.0,56.5,40.9,35.4,31.0,29.8,27.2,22.4,20.6,11.6.hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
15h23
o3251.1647；found 251.1645.
[0077]
实施例19：化合物s19的合成
[0078]
向化合物s18(20mg,0.08mmol,1equiv.)的乙醇(0.5ml)溶液中缓慢加入二甲胺(2m in thf,45μl,0.09mmol，1.1equiv.)。将反应液在室温下搅拌24小时，反应完成后，减压除去溶剂并通过柱层析(pe:ea＝2:1)纯化，得到29mg黄色油状化合物s19，产率为98％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ2.72(m,2h),2.62
–
2.52(m,4h),2.48
–
2.38(m,2h),2.16(s,6h),2.09(m,2h),2.04
–
1.93(m,3h),1.89
–
1.78(m,2h),0.96(d,j＝6.8hz,3h),0.92(d,j＝6.8hz,3h),0.84(d,j＝6.8hz,3h).hrms(esi
–
tof)m/z:[m+h]
+
calcd for c
18h30
no3296.2226；found 296.2228.
[0079]
本发明合成的共价修饰莪术醇衍生物具有抗肿瘤活性，其细胞实验结果如下：
[0080]
运用cck-8法开展相应的细胞增殖抑制活性分析，具体操作如下：
[0081]
1.样品配制：用dmso(merck)溶解成后，加入pbs(-)配成0.6mm的溶液，然后用含dmso的pbs(-)稀释至30μm或10μm溶液。
[0082]
2.肿瘤细胞株：u87、a172。
[0083]
3.培养液：rpmi 1640+10％fbs+双抗
[0084]
4.其他材料：全波长多功能酶标仪：varioskan flash型号，thermo scientific生产厂商，进口96孔板等。
[0085]
5.实验方法：
[0086]
1)将u87细胞、a172细胞培养至对数生长期时使用，使用含edta的0.25％胰酶消化细胞后收集，通过细胞计数来调整细胞悬液中的细胞密度至目标值。
[0087]
2)向96孔板的每个孔中加入100μl培养基，使每孔约有6000个细胞，具体细胞数根据细胞大小及增值速度等因素决定，每组设3个复孔，轻轻摇晃均匀后将96孔板放入37℃5％co2的细胞培养箱中培养。
[0088]
3)待细胞贴壁状态良好时，向96孔板各孔中加入目标药物至目标浓度进行药物刺激，其后将96孔板放置于37℃5％co2培养箱内孵育72h。
[0089]
4)到达目标处理时间后，将事先准备好的在室温，避光下融化的cck-8溶液加入96孔板的每个孔中，每100μl培养液加入10μlcck-8。然后在避光条件下放置于37℃5％co2培养箱内孵育0.5-1h。
[0090]
5)在多功能酶标仪内震荡1min，用多功能酶标仪测定双吸收波长为450nm和620nm时每个孔的吸收值。cck-8测定法结果以对照组的吸光度值的相对百分率体现，计算结果时注意以空白对照孔调零，记录实验结果并计算细胞活力。
[0091]
体外非实体瘤细胞抑制活性结果见表1：
[0092]
表1体外胶质母细胞瘤细胞抑制活性
[0093][0094][0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种含有反应性michael受体的莪术醇衍生物。2.如权利要求1所述的莪术醇衍生物，其特征在于，所述莪术醇衍生物包括以下结构通式；3.如权利要求2所述的莪术醇衍生物，其特征在于，结构通式i中r1基团代表氢原子、烷基、芳基、杂芳基或杂芳甲基；r2基团代表氢原子或烷基。4.如权利要求3所述的莪术醇衍生物，其特征在于，所述烷基为c1-c6烷基或氘代烷基；所述芳基为苯基、取代苯基；所述取代苯基，取代基为卤素；所述杂芳基为吡啶基或取代吡啶基；所述杂芳甲基为吡啶甲基、取代吡啶甲基。5.如权利要求2所述的莪术醇衍生物，其特征在于，结构通式ii中r3基团代表氢原子、羟基、氰基或含氮杂环；所述含氮杂环为4元至7元含氮杂环。6.如权利要求2所述的结构通式i、ii莪术醇衍生物，其特征在于，结构通式iii中r4和r5基团代表c1-c6烷基或氘代烷基。7.一种制备如权利要求2结构通式i、ii所述化合物的方法，其特征在于，莪术醇首先与mcpba反应，生成环氧中间体，之后在加热以及碱性条件下，环氧化合物开环后消除得到羟基化合物ii；化合物ii与dess-martin氧化剂反应后被氧化，得到化合物s1；化合物s1在亚氯酸钠以及过氧化氢的作用下被氧化，得到化合物s2；化合物s2与各类胺发生缩合反应，得到化合物结构通式i、ii所述的化合物；。8.一种制备如权利要求2结构通式iii所述化合物的方法，其特征在于，室温条件下，水合三氯化钌作为催化剂，莪术醇被高碘酸钠氧化得到化合物iii，化合物iii与多聚甲醛发生羟醛缩合反应，得到化合物s18，化合物s18与二甲胺进行加成反应得到s19；
9.如权利要求1-6任一项所述的莪术醇衍生物在制备治疗癌症药物中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物中的活性成分为权利要求1-6任一项所述莪术醇衍生物。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及含有Michael受体的莪术醇衍生物，及其合成方法与其在恶性肿瘤治疗中的应用；本发明以共价修饰为核心策略，我们合成了两类具有反应性Michael受体的莪术醇衍生物。这些衍生物结构中，含有α,β-不饱和醛、α,β-不饱和酸、α,β-不饱和酰胺、α,β-不饱和酮，α,β-不饱和氰等反应性Michael受体，对多种肿瘤细胞都表现出较之莪术醇更优的抑制活性，有望开发为高效低毒的抗肿瘤药物。效低毒的抗肿瘤药物。


技术研发人员：张永强 魏金莲 李剑 赵雨沫
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/12