一种TP53基因p.A175L突变位点的检测试剂盒及其应用的制作方法

一种tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体讲是一种tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.原发性高血压(essential hypertension，eh)是遗传因素、环境因素、个体差异等多种因素引起的以体循环动脉血压升高为首要表现的综合征，也是严重危害人类健康的世界性公共卫生问题之一。对于原发性高血压的病因探索日益成为国内外研究的热点。寻找eh相关基因进而阐明血压升高的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展eh的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与eh的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑阻碍了eh预防及治疗水平的提高。
3.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是肝脏肿瘤中最常见的类型，是我国乃至世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，全球每年有超过80万例的新发病例。由于缺乏有效的早期诊断标志物，确诊时大部分患者处于晚期，生存时间不足6个月。很多患者在治疗过程中或治疗后不久就发生了肝内转移或远处转移，行手术切除的患者，术后5年复发率也高达70％。
4.tp53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，50％以上的恶性肿瘤会出现该基因的突变。tp53突变与hcc的发生发展，乃至临床表现有密切关联。tp53突变的hcc相对于其他基因突变类型表现出更高的侵袭性，临床多表现为分化程度低、大血管和微血管侵犯(microvascular invasion，mvi)及局部肉瘤样改变，同时伴有乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)感染，血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)水平较高等特征。
5.目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与肝细胞癌早期复发相关的tp53基因p.a175l突变位点的试剂盒的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种检测效率高，针对性强的tp53基因p.a175l突变位点检测试剂盒，其中tp53基因p.a175l突变位点的突变丰度与肝细胞癌的早期复发呈正相关，因此其可用于辅助检测肝细胞癌早期复发检测或筛查药物。
7.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒，包括检测tp53基因p.a175l突变位点的正向特异性扩增引物、反向特异性扩增引物及特异性测序引物：
8.所述正向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1所示：
9.5'-cccctgccctcaacaaga-3'；
10.所述反向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2所示：
11.5'-gccagaccatcgctatctgag-3'；
12.所述特异性测序引物的核苷酸序列如seq id no.3所示：
13.5'-tgacggaggttgtga-3'。
14.本发明还提供上述tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒的应用，用于hcc的药物筛查或评估用药效果。
15.与现有技术相比，本发明的优点在于：tp53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，50％以上的恶性肿瘤会出现该基因的突变。hcc中tp53突变的发生多与ras-mapk等信号通路的频繁激活相关。ras-mapk通路的激活一方面诱导动力蛋白相关蛋白1(dynamin-relatedprotein 1,drp1)磷酸化，加速肿瘤细胞线粒体分裂，促进肿瘤细胞增殖；另一方面诱导表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmps)等过表达，促进肿瘤侵袭和转移。因此，tp53突变的hcc相对于其他基因突变类型表现出更高的侵袭性，临床多表现为分化程度低、大血管和微血管侵犯(mvi)及局部肉瘤样改变，同时伴有乙型肝炎病毒(hbv)感染，血清甲胎蛋白(afp)水平较高等特征，患者容易发生早期复发、预后差。tp53基因p.a175l突变位点的突变丰度与肝细胞癌的早期复发呈正相关，检测tp53基因p.a175l突变位点的突变丰度的检测试剂盒能够方便快捷地在分子水平上实现对hcc早期复发的检测，检测效率高，针对性强。
附图说明
16.图1为实施方式中被检测序列的焦磷酸测序图。
17.图2为tp53 p.a175l突变与hcc早期复发之间相关性的roc曲线图。
具体实施方式
18.下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
19.本实施例提供一种tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒，包括检测tp53基因p.a175l突变位点的正向特异性扩增引物、反向特异性扩增引物及特异性测序引物：
20.所述正向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1所示：
21.5'-cccctgccctcaacaaga-3'；记为tp53-1s:524-f。
22.所述反向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2所示：
23.5'-biotin-gccagaccatcgctatctgag-3'；记为tp53-1s:524-r。
24.所述特异性测序引物的核苷酸序列如seq id no.3所示：
25.5'-tgacggaggttgtga-3'。记为tp53-1s:524-s。
26.1、收集hcc组织样本及各类临床指标
27.收集确诊的24名hcc患者肿瘤组织，所有患者均经术后组织病理诊断，肿瘤组织标本来自新鲜手术切除标本，收集后立刻置液氮保存。纳入标准为：1)同意参与研究方案的临床病人，年龄18及以上，性别不限；2)符合hcc诊断标准，行手术切除的患者。排除标准为：1)排除围手术期死亡、其他脏器器质性疾病等；2)临床资料不完整的患者。收集患者的肿瘤大小、分期、实验室指标、术后病理及免疫组化等临床数据。对患者进行术后随访，随访的主要
终点为肿瘤复发，次要终点为死亡。
28.2、焦磷酸测序检测hcc肿瘤组织tp53(p.a175l)突变丰度
29.1)dna提取：使用基因组dna抽提试剂盒进行dna提取。
30.2)引物设计：使用的引物设计软件为pyromark assay design 2.0，引物序列见下表。
[0031][0032][0033]
3)pcr扩增：扩增体系如下(50μl)。
[0034][0035]
4)pyrosequencing检测：在96孔pcr反应板中加入反应结合珠2μl，结合缓冲液38μl，pcr产物40μl，室温下充分混匀10min；开启真空泵吸取结合珠及pcr产物混悬液，依次浸入70％乙醇，0.2m naoh和冲洗缓冲液中各5s；关闭真空泵，后将探头上结合珠及pcr产物置于40μl退火缓冲液中，85℃变性2min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交；根据pyrosequencing软件序列设计信息所计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dntp；将试剂舱及96孔反应板放入pyrosequencing检测仪进行反应。
[0036]
5)数据分析：使用焦磷酸测序仪自带的pyro q-aq软件自动分析。图1为被检测序列的焦磷酸测序图。
[0037]
3、数据分析
[0038]
采用spss 25.0统计软件进行数据处理和统计分析，对符合正态分布和方差齐性的连续性计量资料采用均数
±
标准差描述，组间比较采用t检验或单因素方差分析；不符合正态分布的采用中位数(四分位间距)描述，组间比较采用非参数检验。计数资料采用频数(百分比)表示，组间比较采用卡方检验，对于理论数值过小的四格表采用fisher确切概率法。采用单因素和多因素cox比例风险回归模型分析与预后相关的独立影响因素。采用
kaplan-meier法，绘制生存曲线，组间比较采用log-rank检验。p《0.05认为差异有统计学意义。
[0039]
图2为tp53 p.a175l突变与hcc早期复发之间相关性的roc曲线分析结果，图中所示曲线下面积auc:0.724，95％置信区间ci 0.4937-0.8947，灵敏度0.9138943，特意度0.5395267。
[0040]
本发明可用于检测与hcc早期复发相关的tp53基因p.a175l突变位点突变丰度，试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对tp53基因p.a175l突变位点的突变丰度进行检测，能够快速可靠地为hcc早期复发的辅助诊断、检测或为筛查药物提供借鉴。
[0041]
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

技术特征：
1.一种tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒，其特征在于，包括检测tp53基因p.a175l突变位点的正向特异性扩增引物、反向特异性扩增引物及特异性测序引物：所述正向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1所示：5'-cccctgccctcaacaaga-3'；所述反向特异性扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2所示：5'
ꢀ‑
gccagaccatcgctatctgag-3'；所述特异性测序引物的核苷酸序列如seq id no.3所示：5'-tgacggaggttgtga-3'。2.一种权利要求1所述的tp53基因p.a175l突变位点的检测试剂盒的应用，其特征在于，用于hcc的药物筛查或评估用药效果。

技术总结
本发明公开了一种TP53基因p.A175L突变位点的检测试剂盒及其应用，涉及检测试剂盒技术领域，本发明包括检测TP53基因p.A175L突变位点的正向特异性扩增引物、反向特异性扩增引物及特异性测序引物：所述正向特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，本发明能够方便快捷地在分子水平上实现对HCC早期复发的检测，检测效率高，针对性强。强。强。


技术研发人员：于茜 毛书奇 单钰莹 陆才德
受保护的技术使用者：宁波市医疗中心李惠利医院
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/12