一种阿尔茨海默病早期诊断标志物及其应用

1.本发明属于医疗医药技术领域，尤其涉及一种阿尔茨海默病早期诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.尽管近年来针对阿尔茨海默病(alzheimer disease，ad)分子机制的研究取得了一定的进展，但ad的治疗前景仍不明朗。治疗靶点的选择与干预时机是影响ad病因治疗成败的关键因素，疾病早期的患者在ad病因治疗中获益更大。目前ad的主要诊断手段包括腰穿脑脊液检查和pet-ct检查。然而，腰穿为一项有创操作，具有一定风险，作为筛查手段接受率低；pet-ct检查价格昂贵、有辐射暴露风险，基层医院不具备相关检查设备，导致应用受限。以上缺点，致使ad临床前阶段的诊断难以开展。
3.目前，ad临床前阶段的诊断依赖于生物标志物的检测，根据2014年国际工作组(iwg2)发布的诊断标准，ad临床前阶段需具备脑脊液中aβ1
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42水平下降以及tau蛋白水平上升或纤维状淀粉样pet(pib-pet)滞留增加的条件。然而，腰穿为一项有创操作，具有一定风险，作为筛查手段接受率低；pet-ct(正电子发射计算机断层显像)检查价格昂贵、有辐射暴露风险，基层医院不具备相关检查设备，导致应用受限。以上缺点，致使ad临床前阶段的诊断难以开展。因此，发展简单、可靠的早期筛查手段，对于ad的早期诊断及治疗至关重要。
4.血浆神经元来源外泌体的相关研究结果具有较好的一致性，其相关蛋白在ad早期诊断、诊断及鉴别诊断中具有良好的应用价值。然而，ad作为一种复杂性疾病，其发病机制并不局限于单一靶点或通路，生物学改变同样存在该特点。此外，前期针对aβ及tau蛋白的病因治疗均以失败宣告结束，也提示需要寻找新的ad疾病通路及生物靶点。既往有关ad生物标志物与外泌体的研究，多利用elisa方法，对少数特定蛋白进行了检测，并不能全面的反映神经元来源外泌体蛋白与ad的关系。


技术实现要素：

5.本发明实施例提供一种ad早期诊断标志物及其应用，旨在解决目前ad早期诊断的所用腰穿和pet-ct检测方法的检测缺陷问题。
6.目前有关ad生物标志物与外泌体的研究，多利用elisa方法，对少数特定蛋白进行了检测，并不能全面的反映血浆神经元来源外泌体蛋白与ad的关系。
7.本发明通过利用质谱分析的方法，以基因诊断明确的家族性ad患者及症状前ad患者为筛选期研究对象，对其血浆神经元来源外泌体蛋白质组进行全面分析，筛选出可能的ad早期诊断指标ppp2r5c，进而以散发性轻度ad及遗忘型轻度认知障碍(amci)患者为验证期研究对象，判定候选指标的诊断效能，发现血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c可以作为ad早期诊断标志物。
8.综上，ppp2r5c为ad早期诊断标志物。
9.进一步地，血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c为ad早期诊断标志物。
10.ad早期诊断标志物ppp2r5c的应用，具体为：一种ad早期诊断试剂盒，包括ppp2r5c蛋白单克隆抗体。
11.所述的ppp2r5c蛋白单克隆抗体能够特异性识别ppp2r5c蛋白，对受测个体的血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c(ad早期诊断标志物)的含量进行测定，从而用于ad早期诊断。
12.进一步地，所述的ad早期诊断试剂盒，还包括血浆神经元来源外泌体提取试剂，所述的血浆神经元来源外泌体提取试剂，包括thrombinplasmaprep for exosome precipitation、pierce streptavidin agarose resin、bsa、exosomes precipitation solution、anti-human cd171 biotin。
13.本发明的目的通过下述技术方案实现：
14.本发明克服了ad早期诊断的所用腰穿和pet-ct检测方法的检测缺陷问题，本发明实验结果表明血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c蛋白水平在ad患者中明显下调，呈现出认知功能正常对照》amci》ad的趋势，从而证明血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c为ad早期诊断标志物，并且提供了基于该ad早期诊断标志物ppp2r5c的ad早期诊断试剂盒的应用。
附图说明
15.图1为本发明实施例二构建的正常对照与amci患者的受试者特征曲线结果图。
16.图2为本发明实施例二构建的正常对照与散发性轻度ad患者的受试者特征曲线结果图。
17.图3为本发明实施例二构建的散发性轻度ad患者与amci患者的受试者特征曲线结果图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
20.目前，ad临床诊断主要采用的腰穿和pet-ct存在以下缺点：腰穿为一项有创操作，具有一定风险，作为筛查手段接受率低；pet-ct检查价格昂贵、有辐射暴露风险，基层医院不具备相关检查设备，导致应用受限。为了解决上述技术问题，本发明提出了一种ad早期诊断标志物及其应用，旨在解决目前ad早期诊断的所用腰穿和pet-ct检测方法的检测缺陷问题。
21.实施例一
22.本实施例共纳入41名研究对象，其中包括13例基因诊断明确的fad(家族性ad)患者，10例无症状的ad致病基因突变携带者(pre-ad)，以及18例正常对照，为了降低组内差异，将上述样本进行了组内的混样。根据不同基因突变，将fad组13例患者混合为5组，其中携带psen1、psen2基因突变各两组、携带app基因突变一组，与之年龄性别匹配的9例正常对
照混合为三组。pre-ad同理分为5组，携带psen1基因突变为三组、携带psen2、app基因突变各一组，与之年龄性别匹配的9例正常对照混合为三组。采用改良沉淀法，提取41名研究对象的血浆神经元来源外泌体，利用label free lc-ms/ms技术对其蛋白质组进行定性、定量及生物信息学分析，找出fad组与pre-ad组共有的差异表达蛋白，发现ppp2r5c蛋白表达水平正常人＞pre-ad＞ad。
23.上述中的改良沉淀法，具体包括以下步骤：
24.1.500ul血浆，4℃融解，加入5ul蛋白酶抑制剂；
25.2.加入5ul thrombin plasma prep for exosome precipitation，室温混匀5min，10000g
×
5min；
26.3.取上清，加入10ul pierce streptavidin agarose resin及50ul 3％bsa混匀，4℃孵育5h；
27.4.在上清中加入126ul exosomes precipitation solution，静置1h后离心30min；
28.5.洗涤后，向沉淀中加入250ul pbs、5ul蛋白酶抑制剂、50ul 3％bsa、4ul anti-human cd171 biotin及25ul pierce streptavidin agarose resin,4℃孵育过夜；
29.6.次日离心弃上清，沉淀即为神经元来源外泌体。
30.上述所采用的label free lc-ms/ms技术，具体步骤如下：
31.取改良沉淀法所得外泌体蛋白样品10ug，分别进行1小时梯度q-exactive分析，共计3次lc-ms/ms分析，主要包括fasp酶解、纳升流速的高效液相色谱法的液相系统easy nlc进行分离、所有样品经过高效液相色谱分离之后，利用q-exactive质谱仪对其进行蛋白质质谱分析，质谱上机检测时间为2小时，以正离子作为检测方式，扫描范围的设定为母离子300至1800m/z，分辨率方面一级质谱需达到70,000在200m/z情况下，自控目标设定为1e6，最大it是50毫秒，动态排除时间为60.0秒。采用maxquant软件(版本号1.5.3.17)进行查库鉴定。
32.实施例二
33.本实施例共纳入64例研究对象，其中轻度ad患者20例、amci患者12例，年龄性别匹配的正常对照32例。采用改良沉淀法，提取所有研究对象血浆神经元来源外泌体蛋白，采用prm法对ppp2r5c进行定量检测。比较候选蛋白在轻度ad/正常对照、amci/正常对照以及轻度ad/amci之间的表达水平，筛选获得差异表达蛋白，构建受试者特征曲线如图1至图3所示，比较不同指标对轻度ad及amci的诊断效能，发现血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c可能作为ad早期诊断的指标，并可能于症状出现前发生变化。
34.其中：prm法具体内容为：在prm方法建立阶段，各组随机取3例样品，每例样品20ug蛋白，按照lysc+trypsin进行蛋白酶解。酶解后产物脱盐冻干，用0.1％fa复溶肽段，并用复溶肽段，并用od280测定肽段浓度测定肽段浓度，以备质谱测试。每组样品分别取适量酶解后肽段，将12例样品混合成p_mix、c for p_mix、mci_mix以及c formci_mix 4个样品。根据26个目标蛋白的序列以及前期label free的结果，初步选取目标蛋白的特异性肽段，以备后续prm检测。对4个混合样品分别进行lc-ms/ms分析，质谱分析时长为2h(2*2hr)；质谱数据采用maxquant1.5.3.17进行数据库检索，并导入skyline软件，初步筛选出能够代表目标蛋白的可信肽段，并筛选出能够进行prm定量分析的蛋白列表。对prm方法进行参数优化，确
定lc-prm/ms质谱方法。4个混合样品取适量肽段，掺入适量的aqua内标肽段，分别对其进行1小时lc-prm/ms质谱测试，重复三次质谱检测。使用skyline对数据进行分析，选取用于蛋白定量的肽段和子离子。
35.血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c在散发性轻度ad患者中明显下调，呈现出认知功能正常对照》amci》ad的趋势，提示ppp2r5c是ad的早期筛查标志物。
36.本实施例通过利用质谱分析的方法，以基因诊断明确的家族性ad患者及症状前ad患者为筛选期研究对象，对其血浆神经元来源外泌体蛋白质组进行全面分析，筛选出可能的ad早期诊断指标ppp2r5c，进而以散发性轻度ad及遗忘型轻度认知障碍(amci)患者为验证期研究对象，判定候选指标的诊断效能，发现血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c可以作为ad早期诊断标志物。
37.综上，ppp2r5c为ad早期诊断标志物。
38.进一步地，血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c为ad早期诊断标志物。
39.进一步地，血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c蛋白为ad早期诊断标志物。
40.ad早期诊断标志物ppp2r5c的应用，具体为：一种ad早期诊断试剂盒，包括ppp2r5c蛋白单克隆抗体。
41.所述的ppp2r5c蛋白单克隆抗体能够特异性识别ppp2r5c蛋白，对受测个体的血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c(ad早期诊断标志物)的含量进行测定，从而用于ad早期诊断。
42.进一步地，所述的ad早期诊断试剂盒，还包括血浆神经元来源外泌体提取试剂；所述的血浆神经元来源外泌体提取试剂，包括thrombinplasmaprep for exosome precipitation、pierce streptavidin agarose resin、bsa、exosomes precipitation solution、anti-human cd171 biotin。
43.本发明的目的通过下述技术方案实现：
44.本发明克服了ad早期诊断的所用腰穿和pet-ct检测方法的检测缺陷问题，本发明实验结果表明血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c在ad患者中明显下调，呈现出认知功能正常对照》amci》ad的趋势，从而证明血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c为ad早期诊断标志物，并且提供了基于该ad早期诊断标志物ppp2r5c的ad早期诊断试剂盒的应用。
45.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.ppp2r5c为ad早期诊断标志物。2.根据权利要求1所述ppp2r5c为ad早期诊断标志物，其特征在于：血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c为ad早期诊断标志物。3.根据权利要求1所述ppp2r5c为ad早期诊断标志物，其特征在于：血浆神经元来源外泌体中ppp2r5c蛋白为ad早期诊断标志物。4.一种ad早期诊断试剂盒，其特征在于：包括ppp2r5c蛋白单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的ad早期诊断试剂盒，其特征在于：还包括血浆神经元来源外泌体提取试剂。

技术总结
本发明公开了一种AD早期诊断标志物及其应用，属于医疗医药技术领域。具体为发现血浆神经元来源外泌体中PPP2R5C蛋白为AD早期诊断标志物。同时基于上述标志物的发现提供了标志物的应用，一种包含PPP2R5C蛋白单克隆抗体的AD早期诊断试剂盒。本发明克服了AD早期诊断的所用腰穿和PET-CT检测方法的检测缺陷问题，本发明实验结果表明血浆神经元来源外泌体中PPP2R5C在AD患者和遗忘型轻度认知功能障碍患者中均明显下调，呈现出认知功能正常对照>aMCI>AD的趋势，从而证明血浆神经元来源外泌体中PPP2R5C为AD早期诊断标志物，并且提供了基于该AD早期诊断标志物PPP2R5C的AD早期诊断试剂盒的应用。试剂盒的应用。试剂盒的应用。


技术研发人员：沈璐 刘慧 焦彬 张振涛 罗世林
受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/9/12