一种水生生物中脂肪酸的提取和分析方法

1.本发明涉及脂肪酸提取领域，具体涉及一种水生生物中脂肪酸的提取和分析方法。


背景技术：

2.食物网结构、捕食者与被捕食者之间的动态、觅食行为以及这些因素对于个体的生长、繁殖和生存的影响，都是我们了解生态系统结构和功能的重点。然而在水生环境中，此类信息一般不容易获得或者可靠性不高，这是因为在这些生态系统中生物体不能轻易获得，相应地也就无法直接观察到物种间的相互作用，导致难以准确描述食物组成特征。因此，使用不同类型的营养标志物的替代方法已被开发出来，其中一个便是使用脂质和脂肪酸(fa)来研究食物网动态。
3.脂肪酸的特点及其存储模式使它们成为摄食和食物网结构的有效示踪物。首先，脂肪酸可以在生物体内合成并修饰碳链长度以及增加双键，但是这些生化过程受到一些限制，这取决于物种类型以及系统的发育类型。其次，与其他食物中的营养物质(如蛋白质和碳水化合物)不同，脂肪酸在生物体内的代谢过程中相对稳定，在生物消化吸收过程中基本结构不变，并通过基本形式储存于生物组织中，这些限制存在于植物、细菌和动物中，并由消费者组织吸收，使得脂肪酸在食物链中进行生物积累，由此可以通过追踪特定脂肪酸来反推食物网起源。再次，与大多数其他营养物质不同，脂肪储存在动物体内的特定位置，这些大量储存物质可以在需要的时候进行利用，以提供短期或长期的能源需求。因此，脂肪酸随着时间进行积累，能够代表一段时间的食物摄入集合。
4.自然环境中的脂肪酸样品通常来源于藻类、浮游植物、浮游动物、底栖动物等生物，但这些生物丰度往往很低，采集难度较高，且体型极小，通常需要在显微镜下才能观察到其存在，导致可获得的样本量干重通常只有0.01g左右，而现有的针对各类脂肪酸的提取及分析方法所需的样本量至少是0.1g，导致现有方法难以适用于小样品量的提取和分析，继而导致无法进一步探究水生生物食物网中的能量流动和物质传输的过程。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明要解决的技术问题是现有的水生生物中脂肪酸的提取和分析方法不能适用于小样品量，从而通过优化工艺条件，提供一种可用于小样品量的水生生物中脂肪酸的提取和分析方法。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.根据本发明的实施例，第一方面，本发明提供了一种水生生物中脂肪酸的提取方法，包括如下步骤：
8.(1)样品预处理：将水生生物样品依次进行冷冻干燥处理和均质化处理；
9.(2)低温厌氧提取：在厌氧环境中向完成步骤(1)预处理后的样品中加入低温溶剂，低温下离心处理，取有机相，蒸发浓缩，冷冻保存；
10.所述低温溶剂为0～4℃且体积比为0.5～1：1～2：0.6～2的氯仿、甲醇和氯化钠水溶液，所述氯化钠水溶液的浓度为0.6～1.8wt％。
11.根据本发明的实施例，步骤(1)中所述冷冻干燥处理包括，先将所述水生生物样品置于-20～-80℃下完全冷冻，再真空冷冻干燥；先经过冷冻处理将水分固定，再进行真空冷冻干燥可以使样品中的水分由冰直接升华为水汽，达到干燥的目的。
12.根据本发明的实施例，所述均质化处理包括，在厌氧环境中依次将冷冻干燥后的样品研磨均匀，加入0～4℃的氯仿，之后于-20～-80℃下放置至少12h，其中所述样品的质量与所述氯仿的体积之比为5～10：1～2，比例关系为mg/ml。
13.根据本发明的实施例，所述氯仿、甲醇包括甲醇、体积比1～3：1的氯仿和甲醇的混合溶剂。
14.根据本发明的实施例，完成步骤(1)预处理后的样品与所述低温溶剂的体积之比为1～2：1～5。
15.根据本发明的实施例，所述厌氧环境是通过氮气流吹扫实现的。
16.根据本发明的实施例，所述离心处理的温度为0～4℃，转速为2500～4000r/min，时间为4～6min。
17.根据本发明的实施例，在所述离心处理之前，先在0～4℃下超声处理5～15min，再涡旋混匀0.5～2min，可以使超声过程中破碎的细胞与试剂进一步混合，提高提取效率。
18.第二方面，本发明提供一种水生生物中脂肪酸的分析方法，包括如下步骤：在0～4℃下依次向由上述的提取方法得到的提取物中加入内标物，挥发溶剂后再加入甲苯和酸性试剂-甲醇溶液；加热反应，待反应完成后降至室温，加入碳酸氢钾水溶液和正己烷，离心分离后降温至0～4℃，取上层液体，将溶剂挥发至干后用正己烷溶解并转移至另一容器中，定容，得到待测溶液；
19.对所述待测溶液进行气相色谱分析，所述气相色谱分析中的升温程序为：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。
20.根据本发明的实施例，所述内标物为0～4℃、1μg/μl的十九烷酸-正己烷溶液。
21.根据本发明的实施例，所述内标物与所述提取物的体积比为4：200～1000。
22.根据本发明的实施例，所述反应是在厌氧条件下进行的，反应温度为50～60℃，时间为12～20h。
23.根据本发明的实施例，所述碳酸氢钾水溶液和正己烷的体积比为1～2：4～5。
24.根据本发明的实施例，所述碳酸氢钾水溶液的浓度为1～3wt％。
25.根据本发明的实施例，所述提取物与所述甲苯、所述酸性试剂-甲醇溶液的体积比为0.2～1：1～2。
26.根据本发明的实施例，所述酸性试剂为硫酸和/或盐酸。
27.根据本发明的实施例，所述硫酸-甲醇溶液中硫酸与甲醇的体积比为1～2：98～99。
28.根据本发明的实施例，所述盐酸-甲醇溶液中盐酸与甲醇的体积比为4～6：94～96。
29.根据本发明的实施例，所述气相色谱分析条件包括：
30.采用毛细管gc色谱柱：长100mm，内径0.25mm，色谱柱内的膜厚度0.20μm；
31.载气为氦气，流量为1ml/min；
32.进样体积1μl；
33.氢火焰离子检测器为250℃，氢气流速为35ml/min，氮气流速为30ml/min，空气流速为350ml/min。
34.根据本发明的实施例，所述分析方法还包括，使用xcalibur软件结合标准曲线对所得gc谱图进行数据解析的步骤。
35.本发明提供的水生生物中脂肪酸的提取和分析方法适用于饱和脂肪酸、短链不饱和脂肪酸、支链脂肪酸以及长链不饱和脂肪酸。
36.与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
37.1.本发明实施例提供的水生生物中脂肪酸的提取方法，包括如下步骤：(1)样品预处理：将水生生物样品依次进行冷冻干燥处理和均质化处理；(2)低温厌氧提取：在厌氧环境中向完成步骤(1)预处理后的样品中加入低温溶剂，低温下离心处理，取有机相，蒸发浓缩，冷冻保存；所述低温溶剂为0～4℃且体积比为0.5～1：1～2：0.6～2的氯仿、甲醇和氯化钠水溶液，所述氯化钠水溶液的浓度为0.6～1.8wt％。
38.发明人充分考虑到，不饱和脂肪酸在受到光、热、水等外界因素影响时极易发生水解或氧化，导致其氧化酸败，并且此类反应呈链式发生，与氧气接触后会自动氧化生成醛、酮、酸等氢过氧化物，同时随着脂肪酸中不饱和度的增加，其不稳定性也随之增加，例如顺-9,12-十八烷二烯酸甲酯(lin)氧化后将形成9-，13-二烯烃氢过氧化物等混合物，并最终生成壬烯醛、己醛、戊烷以及戊醛等；而顺-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯(ala)氧化后将形成共轭二烯-9-，12-，13-，16-氢过氧化物的混合物，并最终生成癸三烯酸、辛酸甲酯、庚二烯醛、己烯醛以及丙醛等。由于此类反应的反应速率与温度及氧气成正比，因此本发明将提取全过程控制在0～4℃的厌氧环境中进行，能够最大限度地减缓脂肪酸的水解或氧化，提升其稳定性，大大提高了脂肪酸的提取率，从而使得本发明可实现小样品量的提取和分析。与现有的针对各类长链不饱和脂肪酸的提取及分析方法所需样本量至少0.1g相比，本发明的方法最多只需0.01g水生生物样品，对于藻类和浮游植物等植物样品只需5～10mg，底栖动物、浮游动物和鱼类等动物样品只需4～6mg，便能在不影响分析效果的前提下实现对脂肪酸的高效提取。
39.本发明实施例提供的提取方法采用氯仿和甲醇作为提取溶剂，相比于二氯甲烷、乙醚、石油醚等有机溶剂，氯仿、甲醇的极性更强，可以更加充分地从样品中提取脂肪酸。在提取过程中添加特定浓度的氯化钠溶液的目的是为了去除非脂类杂质的干扰，从而更有利于脂肪酸的提取。
40.2.本发明实施例提供的水生生物中脂肪酸的提取方法，采用吸管移液法对离心管中的有机相进行提取，克服了吸取有机相过程中水相的干扰，能够更加充分地提取脂质提取物，获得的脂质提取物更加纯净。
41.本发明实施例提供的提取方法，考虑到氯仿、甲醇都属有毒溶剂，故而在保证提取效果的前提下控制样品与提取溶剂的用量比，从而最大限度地减少提取溶剂的用量，并结合超声波的超声提取，大幅缩短了提取时间，提高了提取效率。
42.3.本发明实施例提供的水生生物中脂肪酸的提取方法，均质化处理包括，在厌氧
环境中依次将冷冻干燥后的样品研磨均匀，加入0～4℃的氯仿，保持低温环境可以尽量减少待提取物氧化腐败，之后于-20～-80℃下放置至少12h，可以最大限度地使待提取物溶解在溶剂中。
43.4.本发明实施例提供的水生生物中脂肪酸的分析方法，通过在提取物中加入内标物、甲苯以及酸性试剂-甲醇溶液进行酯化反应，再加入碳酸氢钾水溶液和正己烷进行皂化反应；本发明在酯化反应中采用甲苯作为溶剂，在酸性试剂催化下使脂肪酸与甲醇发生酯化反应，由于该反应是可逆的，故而在反应结束后加入碳酸氢钾使之与脂肪酸甲酯发生皂化反应生成rcoo-k，避免因水浴结束后温度降低而导致提取物减少，从而避免用于分析的样品损耗。
44.本发明通过采用酸性试剂-甲醇溶液进行酸催化酯化，具有普适性。如果储存过程中样品受温度、微生物、光照等影响，导致样品酸价增加，若此时使用碱性催化剂与样品进行反应，将降低酯化效果；另外，后续添加碳酸氢钾水溶液可以与酸催化剂反应，减少酯化反应的逆反应发生。
45.在进行气相色谱分析时采用的升温程序包括：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。在脂肪酸测试过程中，由于某些脂肪酸甲酯保留时间十分接近，因此色谱条件优化主要针对升温程序进行，本发明通过采用上述升温程序，能够最大限度地分离相似的脂肪酸甲酯，大大减少了样品用量，克服了水生生物样品量不足的问题，满足小样品量的分析。
46.5.本发明实施例提供的水生生物中脂肪酸的分析方法，所用的色谱柱为脂肪酸甲酯专用柱，结合标准曲线的保留时间可以精确定位每一种脂肪酸甲酯的浓度，从而测出样品中49种脂肪酸的含量，加和即可得到总脂肪酸含量，其中包括lin、ala、epa、dha等必需脂肪酸。对于痕量食物来源标记物脂肪酸，在水生态的研究中，食物来源一般指硅藻、绿藻、蓝藻等藻类，而一般以16:1ω7和epa为硅藻的标记物脂肪酸，18:1ω7和lin为蓝藻的标记物脂肪酸，ala为绿藻的标记脂肪酸等。所以说，本发明的分析方法可用于测定水产品中的总脂肪含量、各种必需脂肪酸含量和痕量食物来源标记物脂肪酸的含量，同样可应用于食品及保健品营养成分和质量评估。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1是本发明实施例中标准曲线的气相色谱图。
具体实施方式
49.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
50.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
51.参照《河流生态调查技术方法》(isbn 978-7-03-000000-0)来收集水生生物样品。常见不饱和脂肪酸的气相色谱保留时间如下表所示；另外，pufa、terr.fa、bafa均为几种脂肪酸的集合，pufa为多不饱和脂肪酸(双键数量≥2)，terr.fa为陆源脂肪酸，bafa为细菌脂肪酸。
52.名称简称保留时间(min)顺-9,12-十八烷二烯酸甲酯lin36.52顺-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯ala38.79顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸甲酯epa45.44顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸甲酯dha50.57
53.标准曲线的绘制：用正己烷将37种脂肪酸甲酯混标(supelco crm47885)和细菌酸甲酯混标(supelco 47080-u)依据2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml的浓度梯度进行稀释，得到7点标准曲线(r2》0.999)，用于气相色谱结果定量分析。图1为标准曲线的气相色谱含量，不同水生生物中同一脂肪酸的保留时间相同，峰面积越大，含量越高。
[0054][0055]
其中，n表示样本数量；x表示所采用的样品x1、x2、x3、
…
的平均值；
[0056]
平均相对偏差(％)＝相对偏差/平均值
×
100。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，包括如下步骤：
[0059]
(1)样品预处理：将底栖动物放入-80℃冰箱中至完全冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥12h后，用洁净的玻璃棒研磨均匀；称取5mg底栖动物样品置于玻璃管中，加入2ml的0℃的三氯甲烷，在氮气流下盖上盖子，放入-80℃冰箱中保存12h。
[0060]
(2)不饱和脂肪酸提取：取出上述样品，加入1ml 0℃的甲醇、1ml 0℃的三氯甲烷：甲醇溶液(体积比为2:1)和0.8ml 0℃的氯化钠溶液(质量分数为0.9％)，在氮气气流下盖上盖子，然后在0℃中超声10min，涡旋混匀1min，0℃下3000r/min离心5min。采用“吸管移液法”，将吸管插入离心管的下层有机相中，利用胶头吸起下层液体并转移至另一玻璃管中，在氮气流下盖上盖子，置于0℃中保存。在原玻璃管中用0℃的三氯甲烷冲洗吸管后，再次依次重复超声、涡旋、离心、提取下层液体、冲洗吸管两遍；结束后，将装有提取物的玻璃管置于氮气流下蒸发浓缩至1.5ml并盖上盖子，放入-20℃环境中保存。
[0061]
(3)不饱和脂肪酸甲酯化：取1ml提取物至玻璃管中，加入4μl的0℃浓度为1μg/μl的十九烷酸为内标物，在氮气流下将其吹干，随后加入1ml 0℃的甲苯和2ml浓度为1％0℃的硫酸-甲醇溶液，在氮气流下盖上盖子，置于50℃恒温水浴锅中加热12h，水浴完成后，待其恢复至室温，加入2ml浓度为2％0℃的碳酸氢钾溶液和5ml 0℃的正己烷，随后在氮气流
下盖上盖子，依次涡旋30s，0℃下1500r/min离心2min；吸取提取上层液体，在氮气流下盖上盖子，置于0℃环境中保存；向原玻璃管中加入5ml 0℃的正己烷，涡旋、离心、提取上层液体。在25℃的水浴中用氮气将提取物吹干；用1ml 0℃的正己烷冲洗管璧，溶解后将其转移至gc进样瓶中，在氮气流下吹至近干，并定容至1000μl，在氮气流下盖上盖子，待进行气相色谱分析测定其长链不饱和脂肪酸组成和含量。
[0062]
(4)气相色谱仪测定：将gc进样瓶置于气相色谱仪中，色谱条件设定为：
①
毛细管gc色谱柱：100m，0.25mm i.d.，0.20μm(supelco)。
②
升温程序：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。载气为氦气，流量为1ml/min，进样体积1μl。氢火焰离子检测器(fid)为250℃，氢气流速为35ml/min，氮气流速为30ml/min，空气流速为350ml/min。
[0063]
(5)待气相色谱仪运行结束后，使用xcalibur软件结合标准曲线对气相谱图进行定量分析，从而得到样品中长链不饱和脂肪酸的组成和含量。表1为底栖动物样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为90.0％，相对偏差为3.3％。表2为底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为0～3.0％。
[0064]
表1底栖动物样品十九烷酸内标物回收率
[0065]
编号123理论峰面积(mv)125291252912529测定峰面积(mv)113751083811646回收率(％)90.786.592.9
[0066]
表2底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果
[0067][0068][0069]
实施例2
[0070]
本实施例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，包括如下步骤：
[0071]
(1)样品预处理：将浮游动物样品放入-60℃冰箱中至完全冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥12h后，用洁净的玻璃棒研磨均匀；称取5mg浮游动物样品置于玻
璃管中，加入1.5ml的2℃的三氯甲烷，在氮气流下盖上盖子，放入-20℃冰箱中保存20h。
[0072]
(2)不饱和脂肪酸提取：取出上述样品，加入1.5ml 2℃的甲醇、1ml2℃的三氯甲烷：甲醇溶液(体积比为1:1)和0.6ml2℃的氯化钠溶液(质量分数为0.6％)，在氮气气流下盖上盖子，然后在2℃中超声5min，涡旋混匀2min，2℃下2500r/min离心6min。采用“吸管移液法”，将吸管插入离心管的下层有机相中，利用胶头吸起下层液体并转移至另一玻璃管中，在氮气流下盖上盖子，置于2℃中保存。在原玻璃管中用2℃的三氯甲烷冲洗吸管后，再次依次重复超声、涡旋、离心、提取下层液体、冲洗吸管两遍；结束后，将装有提取物的玻璃管置于氮气流下蒸发浓缩至1.5ml并盖上盖子，放入-20℃环境中保存。
[0073]
(3)不饱和脂肪酸甲酯化：取1ml提取物至玻璃管中，加入4μl的2℃浓度为1μg/μl的十九烷酸为内标物，在氮气流下将其吹干，随后加入0.2ml 2℃的甲苯和1.5ml浓度为1.5％2℃的硫酸-甲醇溶液，在氮气流下盖上盖子，置于55℃恒温水浴锅中加热16h，水浴完成后，待其恢复至室温，加入1ml浓度为1％2℃的碳酸氢钾溶液和4ml 2℃的正己烷，随后在氮气流下盖上盖子，进行涡旋、离心、依次涡旋30s，2℃下1500r/min离心2min；吸取提取上层液体，在氮气流下盖上盖子，置于2℃环境中保存；向原玻璃管中加入5ml 2℃的正己烷，涡旋、离心、提取上层液体。在25℃的水浴中用氮气将提取物吹干；用1ml2℃的正己烷冲洗管璧，溶解后将其转移至gc进样瓶中，在氮气流下吹至近干，并定容至1000μl，在氮气流下盖上盖子，待进行气相色谱分析测定其长链不饱和脂肪酸组成和含量。
[0074]
(4)气相色谱仪测定：将gc进样瓶置于气相色谱仪中，色谱条件设定为：
①
毛细管gc色谱柱：100m，0.25mm i.d.，0.20μm(supelco)。
②
升温程序：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。载气为氦气，流量为1ml/min，进样体积1μl。氢火焰离子检测器(fid)为250℃，氢气流速为35ml/min，氮气流速为30ml/min，空气流速为350ml/min。
[0075]
(5)待气相色谱仪运行结束后，使用xcalibur软件结合标准曲线对气相谱图进行定量分析，从而得到样品中长链不饱和脂肪酸的组成和含量。表3为浮游动物样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为89.1％，相对偏差为1.2％。表4为浮游动物样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为0.0～6.9％。
[0076]
表3浮游动物样品十九烷酸内标物回收率
[0077]
编号123理论峰面积(mv)250592505925059测定峰面积(mv)220912268622189回收率(％)88.290.588.5
[0078]
表4浮游动物样品不饱和脂肪酸测定结果
[0079][0080][0081]
实施例3
[0082]
本实施例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，包括如下步骤：
[0083]
(1)样品预处理：将底栖动物放入-20℃冰箱中至完全冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥12h后，用洁净的玻璃棒研磨均匀；称取5mg浮游植物样品置于玻璃管中，加入1ml的4℃的三氯甲烷，在氮气流下盖上盖子，放入-80℃冰箱中保存18h。
[0084]
(2)不饱和脂肪酸提取：取出上述样品，加入0.5ml 4℃的甲醇、1ml4℃的三氯甲烷：甲醇溶液(体积比为1:1)和2ml4℃的氯化钠溶液(质量分数为1.8％)，在氮气气流下盖上盖子，然后在4℃中超声15min，涡旋混匀0.5min，4℃下4000r/min离心4min。采用“吸管移液法”，将吸管插入离心管的下层有机相中，利用胶头吸起下层液体并转移至另一玻璃管中，在氮气流下盖上盖子，置于4℃中保存。在原玻璃管中用4℃的三氯甲烷冲洗吸管后，再次依次重复超声、涡旋、离心、提取下层液体、冲洗吸管两遍；结束后，将装有提取物的玻璃管置于氮气流下蒸发浓缩至1.5ml并盖上盖子，放入-20℃环境中保存。
[0085]
(3)不饱和脂肪酸甲酯化：取1ml提取物至玻璃管中，加入4μl的4℃浓度为1μg/μl的十九烷酸为内标物，在氮气流下将其吹干，随后加入0.6ml 4℃的甲苯和1ml浓度为5％4℃的盐酸-甲醇溶液，在氮气流下盖上盖子，置于60℃恒温水浴锅中加热20h，水浴完成后，待其恢复至室温，加入1.5ml浓度为3％4℃的碳酸氢钾溶液和4.5ml 4℃的正己烷，随后在氮气流下盖上盖子，进行涡旋、离心、依次涡旋30s，4℃下1500r/min离心2min；吸取提取上层液体，在氮气流下盖上盖子，置于4℃环境中保存；向原玻璃管中加入5ml 4℃的正己烷，涡旋、离心、提取上层液体。在25℃的水浴中用氮气将提取物吹干；用1ml4℃的正己烷冲洗管璧，溶解后将其转移至gc进样瓶中，在氮气流下吹至近干，并定容至1000μl，在氮气流下盖上盖子，待进行气相色谱分析测定其长链不饱和脂肪酸组成和含量。
[0086]
(4)气相色谱仪测定：将gc进样瓶置于气相色谱仪中，色谱条件设定为：
[0087]
①
毛细管gc色谱柱：100m，0.25mm i.d.，0.20μm(supelco)。
②
升温程序：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。载气为氦气，流量为1ml/min，进样体积1μl。氢火焰离子检测器(fid)为250℃，氢气流速为35ml/min，氮气流速为30ml/min，空气流速为350ml/min。
[0088]
(5)待气相色谱仪运行结束后，使用xcalibur软件结合标准曲线对气相谱图进行定量分析，从而得到样品中长链不饱和脂肪酸的组成和含量。表5为浮游植物样品十九烷酸
内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为89.8％，相对偏差为0.3％。表6为浮游植物样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为1.0～8.4％。
[0089]
表5浮游植物样品十九烷酸内标物回收率
[0090]
编号123理论峰面积(mv)250591252925059测定峰面积(mv)224381128922473回收率(％)89.590.189.7
[0091]
表6浮游植物样品不饱和脂肪酸测定结果
[0092][0093][0094]
实施例4
[0095]
本实施例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，与实施例1的区别仅在于，将底栖动物样品替换为藻类样品。表7为藻类样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为90.6％，相对偏差为2.9％。表8为藻类样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为3.3～9.6％。
[0096]
表7藻类样品十九烷酸内标物回收率
[0097]
编号123理论峰面积(mv)125291252912529测定峰面积(mv)110491176211243回收率(％)88.293.989.7
[0098]
表8藻类样品不饱和脂肪酸测定结果
[0099]
编号123平均值相对偏差平均相对偏差(％)lin(％)2.923.183.033.040.134.3ala(％)0.760.80.810.790.033.3epa(％)1.111.081.271.150.108.9dha(％)1.100.990.981.020.076.5pufa(％)16.1318.4818.0017.541.247.1terr.fa(％)3.283.623.793.560.267.3
bafa(％)12.9311.3210.7711.671.129.6
[0100]
实施例5
[0101]
本实施例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，与实施例1的区别仅在于，将底栖动物样品替换为鱼类样品。表5为鱼类样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为93.2％，相对偏差为2.2％。表10为鱼类样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为1.7～8.7％。
[0102]
表9鱼类样品十九烷酸内标物回收率
[0103]
编号123理论峰面积(mv)125291252912529测定峰面积(mv)1136611882.811789回收率(％)90.794.894.1
[0104]
表10鱼类样品不饱和脂肪酸测定结果
[0105]
编号123平均值相对偏差平均相对偏差(％)lin(％)2.042.221.922.060.157.3ala(％)1.991.841.671.830.168.7epa(％)5.055.595.175.270.285.4dha(％)9.8910.1810.3210.130.222.2pufa(％)33.0832.0132.4632.520.541.7terr.fa(％)6.256.706.576.510.233.6bafa(％)7.868.647.868.120.455.5
[0106]
对比例1
[0107]
本对比例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，与实施例1的区别仅在于，将实施例1中的低温环境由0℃调整为-5℃。
[0108]
表11为底栖动物样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为85.0％，相对偏差为2.2％。表12为底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为0.0～2.6％。
[0109]
表11底栖动物样品十九烷酸内标物回收率
[0110]
编号123理论峰面积(mv)125291252912529测定峰面积(mv)104201058810945回收率(％)83.284.587.4
[0111]
表12底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果
[0112]
含量123平均值相对偏差平均相对偏差(％)lin(％)3.933.963.973.950.020.5ala(％)3.773.743.743.750.020.5epa(％)14.1714.6014.2614.340.231.6dha(％)5.355.595.615.520.142.6pufa(％)36.9437.4736.9437.120.310.8
terr.fa(％)0.000.000.000.000.000.0bafa(％)8.378.188.378.310.111.3
[0113]
对比例2
[0114]
本对比例提供的水生生物中长链不饱和脂肪酸的提取和分析方法，与实施例1的区别仅在于，将实施例1中的低温环境由0℃调整为5℃。
[0115]
表13为底栖动物样品十九烷酸内标物回收率，十九烷酸内标物的平均回收率为78.2％，相对偏差为5.8％。表14为底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果，可以看出样品中脂肪酸测定的平均相对偏差范围为0.0～2.1％。
[0116]
表13底栖动物样品十九烷酸内标物回收率
[0117]
编号123理论峰面积(mv)125291252912529测定峰面积(mv)1044495219418回收率(％)83.476.075.2
[0118]
表14底栖动物样品不饱和脂肪酸测定结果
[0119]
含量123平均值相对偏差平均相对偏差(％)lin(％)3.933.974.033.980.051.3ala(％)3.823.733.773.770.051.2epa(％)14.6515.2715.0214.980.312.1dha(％)5.695.625.595.630.050.9pufa(％)37.8338.3338.4238.190.320.8terr.fa(％)0.000.000.000.000.000.0bafa(％)8.247.998.298.170.161.9
[0120]
根据本发明实施例1～实施例5可知，脂肪酸含量在不同生物样品中存在一定程度的差异，由于脂肪酸的酯化反应为可逆反应，难以将样品中的全部脂肪酸酯化，因此本发明的分析方法主要以十九烷酸内标物回收率来衡量样品中脂肪酸的甲酯化效率，十九烷酸的回收率越高说明提取效果越好；实验结果表明，实施例1～5中十九烷酸的回收率在89％以上，说明本发明的提取方法对不同生物样品中的脂肪酸均具有较好的提取效果。而对比例1和对比例2中的十九烷酸内标回收率均低于实施例1，说明较低或较高的提取温度都会导致甲酯化效率降低，提取效果不佳。十九烷酸内标物的相对偏差和脂肪酸的平均相对偏差范围越小，表明实验过程控制较好，可重复性越好。
[0121]
由于不饱和脂肪酸在水生食物网中具有示踪作用，因此可根据生物体内不饱和脂肪酸的组成及含量来判断维持其生长繁殖的食物来源。其中lin、ala、epa和dha等pufa可以用于鉴别藻类食物来源，terr.fa可以用于鉴别陆源食物来源，bafa可以用于鉴别细菌及真菌食物来源。因此可借助此方法测定水生生物样品中不饱和脂肪酸组成及含量，进而应用于探究水生生物食物网中的能量流动和物质传输过程。
[0122]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种水生生物中脂肪酸的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品预处理：将水生生物样品依次进行冷冻干燥处理和均质化处理；(2)低温厌氧提取：在厌氧环境中向完成步骤(1)预处理后的样品中加入低温溶剂，低温下离心处理，取有机相，蒸发浓缩，冷冻保存；所述低温溶剂为0～4℃且体积比为0.5～1：1～2：0.6～2的氯仿、甲醇和氯化钠水溶液，所述氯化钠水溶液的浓度为0.6～1.8wt％。2.根据权利要求1所述的水生生物中脂肪酸的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述冷冻干燥处理包括，先将所述水生生物样品置于-20～-80℃下完全冷冻，再真空冷冻干燥；和/或，所述均质化处理包括，在厌氧环境中将冷冻干燥后的样品研磨均匀，加入0～4℃的氯仿，之后于-20～-80℃下放置至少12h，其中所述样品的质量与所述氯仿的体积之比为5～10：1～2，比例关系为mg/ml。3.根据权利要求1所述的水生生物中脂肪酸的提取方法，其特征在于，所述氯仿、甲醇包括甲醇、体积比1～3：1的氯仿和甲醇的混合溶剂。4.根据权利要求1所述的水生生物中脂肪酸的提取方法，其特征在于，完成步骤(1)预处理后的样品与所述低温溶剂的体积之比为1～2：1～5；和/或，所述厌氧环境是通过氮气流吹扫实现的。5.根据权利要求1～4任一项所述的水生生物中脂肪酸的提取方法，其特征在于，所述离心处理的温度为0～4℃，转速为2500～4000r/min，时间为4～6min；和/或，在所述离心处理之前，先在0～4℃下超声处理5～15min，再涡旋混匀0.5～2min。6.一种水生生物中脂肪酸的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：在0～4℃下向由权利要求1～5任一项所述的提取方法得到的提取物中加入内标物，挥发溶剂后再加入甲苯和酸性试剂-甲醇溶液；加热反应，待反应完成后降至室温，加入碳酸氢钾水溶液和正己烷，离心分离后降温至0～4℃，取上层液体，将溶剂挥发至干后用正己烷溶解并转移至另一容器中，定容，得到待测溶液；对所述待测溶液进行气相色谱分析，所述气相色谱分析中的升温程序为：初始温度为100℃保持3min，以3℃/min的速度递增至200℃并保持3min，再以3℃/min的速度递增至240℃并保持6min。7.根据权利要求6所述的水生生物中脂肪酸的分析方法，其特征在于，具有如下特征中的至少一个：所述内标物为0～4℃、1μg/μl的十九烷酸-正己烷溶液；所述内标物与所述提取物的体积比为4：200～1000；所述反应是在厌氧条件下进行的，反应温度为50～60℃，时间为12～20h；所述碳酸氢钾水溶液和所述正己烷的体积比为1～2：4～5；所述碳酸氢钾水溶液的浓度为1～3wt％。8.根据权利要求6所述的水生生物中脂肪酸的分析方法，其特征在于，所述提取物与所述甲苯、所述酸性试剂-甲醇溶液的体积比为0.2～1：1～2；所述酸性试剂为硫酸和/或盐酸；所述硫酸-甲醇溶液中硫酸与甲醇的体积比为1～2：98～99；或，
所述盐酸-甲醇溶液中盐酸与甲醇的体积比为4～6：94～96。9.根据权利要求6～8任一项所述的水生生物中脂肪酸的分析方法，其特征在于，所述气相色谱分析条件包括：采用毛细管gc色谱柱：长100mm，内径0.25mm，色谱柱内的膜厚度0.20μm；载气为氦气，流量为1ml/min；进样体积1μl；氢火焰离子检测器为250℃，氢气流速为35ml/min，氮气流速为30ml/min，空气流速为350ml/min。10.根据权利要求6～9任一项所述的水生生物中脂肪酸的分析方法，其特征在于，所述分析方法还包括，使用xcalibur软件结合标准曲线对所得gc谱图进行数据解析的步骤。

技术总结
本发明属于脂肪酸提取领域，具体涉及一种水生生物中脂肪酸的提取和分析方法。所述提取方法包括如下步骤：样品预处理：将水生生物样品依次进行冷冻干燥处理和均质化处理；低温厌氧提取：在厌氧环境中向预处理后的样品中加入低温溶剂，低温下离心处理，取有机相，蒸发浓缩，冷冻保存；本发明在低温厌氧环境中进行脂肪酸的提取，能够最大限度地减缓脂肪酸的水解或氧化，提升其稳定性，大大提高了脂肪酸的提取率。所述分析方法是将提取物进行酯化和皂化反应后，能够避免提取物损耗，再采用气相色谱进行分析，能够最大限度地分离相似的脂肪酸甲酯，大大减少了样品用量，克服了水生生物样品量不足的问题，满足小样品量的分析。满足小样品量的分析。


技术研发人员：鄢科恒 郭芬 罗一多 高伟 李飞龙 张远
受保护的技术使用者：广东工业大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/12