用于组装DNA片段和载体的DNA重组试剂盒以及DNA重组方法与流程

用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒以及dna重组方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒以及dna重组方法。


背景技术：

2.现有的定向克隆和多基因组装方法主要包括共转化克隆、gateway重组克隆、in-fusion、clod-fusion、slic、lic、gibson和teda组装技术等。在这些方法中，重组克隆受限制性内切酶和连接酶的依赖，对克隆多个dna片段造成限制；共转化克隆、slic大大降低dna转入大肠杆菌后的克隆效率，成本高，并且存在一定的局限性；in-fusion、clod-fusion和gibson技术依赖至少两种以上的dna外切酶和dna聚合酶，成本高，并且线性载体自连接影响克隆效率。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒以及dna重组方法，以改善上述问题。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
4.本技术提供了一种用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，所述试剂盒由udg酶、bsa、kcl、tris-hcl以及余量的水组成；
5.所述udg酶的酶活力大小为0.3u-0.75u；
6.所述dna片段的两个末端具有与所述载体同源的同源臂，所述同源臂序列的长度为15-30bp，所述载体为线性化载体。
7.进一步地，所述bsa的浓度为10mg/ml。
8.进一步地，所述kcl的浓度为850mm-1.1m。
9.进一步地，所述tris-hcl的浓度为0.2-1m，ph为7.5。
10.进一步地，所述udg酶的酶活力大小为0.45u。
11.进一步地，所述dna片段的两个末端碱基中至少一个为g。
12.进一步地，所述同源臂序列的长度为20bp。
13.本发明还提供了一种用于组装dna片段和载体的dna重组方法，其特征在于，所述重组方法包括以下步骤：
14.将所述的试剂盒、dna片段和载体混匀后进行无缝克隆组装反应；
15.将所述无缝克隆组装反应所得产物进行转化反应，得到重组dna。
16.进一步地，所述载体和dna片段的摩尔比为1:2-1:4。
17.进一步地，所述无缝克隆组装反应的反应条件为在室温下孵育2-3min，将所述无缝克隆组装反应所得产物冰浴5-10min后进行转化反应。
18.本发明的有益效果为：
19.本发明突破了传统限制性内切酶和dna外切酶的限制，在特定酶活力大小的udg酶、bsa、kcl和tris-hcl的参与下，针对所述dna片段和载体，能够快速、高转化效率地完成
单片段以及多片段所述dna和载体的组装，降低了所述dna片段和载体的组装成本，提高了克隆效率。
20.本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明实施例了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
22.图1为本发明具体实施方式中线性化puc19载体和dna片段p4的组装原理示意图。
23.图2为本发明具体实施方式中线性化puc19载体和dna片段p4进行组装时，具体的序列和发生反应的过程图。
24.图3为本发明实施例1中dsadna、dstdna、dscdna和dsgdna的荧光偏振实验结果。
25.图4为本发明实施例2中不同udg酶的反应量对tbk组装效率的影响示意图。
26.图5为本发明中实施例2中过夜培养的平板的结果图。
27.图6为本发明实施例3中线性化载体与插入片段的摩尔比对tbk组装效率的影响示意图。
28.图7为本发明实施例3中过夜培养的平板的结果图。
29.图8为本发明实施例4中udg酶的不同的反应时间对tbk组装效率的影响示意图。
30.图9为本发明实施例4中过夜培养的平板的结果图。
31.图10为本发明实施例5中tbk组装中多个dna片段组装的示意图。
32.图11为本发明实施例6中过夜培养的平板的结果图。
33.图12为本发明中实施例6中同源臂长度对tbk组装效率的影响示意图。
具体实施方式
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
36.本发明具体实施方式提供了一种用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，所述试剂盒由udg酶、bsa、kcl、tris-hcl以及余量的水组成，将udg酶、bsa、kcl、tris-hcl以及余
量的水组成的存储液以下简称tbk存储液；
37.所述udg酶的酶活力大小为0.3u-0.75u；
38.所述dna片段的两个末端具有与所述载体同源的同源臂，所述同源臂序列的长度为15-30bp，所述载体为线性化载体。
39.所述bsa的浓度为10mg/ml。
40.所述kcl的浓度为850mm-1.1m。
41.所述tris-hcl的浓度为0.2-1m，ph为7.5。
42.所述udg酶的酶活力大小为0.45u。
43.所述dna片段的两个末端碱基中至少一个为g。
44.所述同源臂序列的长度为20bp。
45.本发明具体实施方式还提供了一种用于组装dna片段和载体的dna重组方法，所述重组方法包括以下步骤：
46.将所述的试剂盒、dna片段和载体混匀后进行无缝克隆组装反应；
47.将所述无缝克隆组装反应所得产物进行转化反应，得到重组dna。
48.得到重组dna之后需要对阳性单菌落进行菌落pcr验证；菌落pcr结果正确的菌落再进行质粒提取、酶切验证；菌落pcr和酶切验证均正确的再送往生物公司进行测序。所述菌落pcr验证一种构建所用的引物为载体序列上的通用引物m13f和m13r；另一种构建所用引物为插入片段的正向引物和载体上的反向引物gfp-r所述的质粒提取采用核小体(北京)技术有限公司的超微量高纯度质粒快速提取试剂盒，所述的酶切验证所用的限制性内切酶为hindiii、ecori和bamhi、xbai，所述的测序公司为北京生工生物公司。
49.将用于组装dna片段和载体的dna重组方法简称为tbk组装。
50.所述载体和dna片段的摩尔比为1:2-1:4。
51.所述无缝克隆组装反应的反应条件为在室温下孵育2-3min，将所述无缝克隆组装反应所得产物冰浴5-10min后进行转化反应。
52.本发明具体实施方式采用的线性化载体及其处理方式如下表1所示，采用的所述dna片段及其pcr反应体系如下表2所示。
53.表1：
[0054][0055][0056]
表2：
[0057][0058]
其中表2涉及到的引物的碱基序列如核苷酸序列表所示。
[0059]
如图1和图2所示，以dna片段p4以及线性化载体puc19为例，用于组装dna片段和载体的dna重组方法步骤如下：
[0060]
dna片段p4在表2中的pcr反应体系下反应，得到含有20bp同源臂的插入片段p4；
[0061]
线性化载体puc19在表1中的反应条件下，得到hindiii、ecori双酶切线性化载体puc19；
[0062]
将所述插入片段p4、hindiii、ecori双酶切线性化载体puc19与所述试剂盒混匀后进行无缝克隆组装反应，在室温下孵育2.5min，使得插入片段p4单链退火产生5’单链末端；
[0063]
将无缝克隆组装反应所得产物冰上退火10min后直接转化e.coli完成dna的重组克隆，得到重组dna。
[0064]
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
[0065]
实施例1：udg酶参与dna组装的实验研究
[0066]
本实验设计中包括2mgbsa(10mg/ml)、udg酶(400nm)和不同碱基底物，其中bsa可以帮助udg酶识别除尿嘧啶以外的正常碱基。
[0067]
为了研究udg酶与正常碱基的结合效率，进行了如下实验：udg酶与四种不同底物荧光偏振的情况。
[0068]
实验材料包括：dsadna、dstdna、dscdna和dsgdna四种底物，其中dsadna表示两个末端碱基中至少一个为a的双链dna，其中dsgdna表示两个末端碱基中至少一个为g的双链dna，其中dscdna表示两个末端碱基中至少一个为c的双链dna，其中dstdna表示两个末端碱基中至少一个为t的双链dna；退火缓冲液；ddh2o；20mmtris-hcl溶液(ph7.5)；100mmnacl溶液；荧光标记肽fam；udg酶；其中，dsadna、dstdna、dscdna和dsgdna均通过现有的dna合成方法合成得到；其中，10
×
退火缓冲液、tris-hcl、nacl、荧光标记肽fam和udg酶均通过市场购得。
[0069]
实验仪器包括：水浴锅、酶标仪。
[0070]
udg酶与dsadna的荧光偏振实验步骤如下：
[0071]
将所述dsadna在12000rpm进行1min快速离心后，用灭菌的ddh2o分别充分溶解离心后的dsadna得到终浓度为100μm的dsadna母液；
[0072]
对所述dsadna母液中的部分dsadna母液进行fam荧光标记，将带有fam标记的
dsadna母液和不带有fam标记的dsadna母液以碱基互补配对原则，按照1：1的摩尔比混匀，用10
×
退火缓冲液和ddh2o将其稀释，使用20mmtris-hcl(ph7.5)，100mmnacl分别稀释混匀的dsadna母液，得到最终浓度为2μm的样品。接着将样品置于水浴锅中煮沸(大于等于95℃)，约5min，然后再缓慢降温。退火后即可得到双链dsadna，需置于-20℃保存，待用。
[0073]
用上述步骤同理得到双链dstdna、双链dscdna和双链dsg dna。
[0074]
分别将udg酶(400nm)、2mgbsa和所述双链dsadna(浓度为5nm)加入到样品孔1内，将高浓度蛋白udg酶(400nm)、2mgbsa和所述双链dstdna(浓度为5nm)加入到样品孔2内，将高浓度蛋白udg酶(400nm)、2mgbsa和所述双链dscdna(浓度为5nm)加入到样品孔3内，将高浓度蛋白udg酶(400nm)、2mgbsa和所述双链dsgdna(浓度为5nm)加入到样品孔4内，并设定对照样品，将所有样品放入已经预热的酶标仪(infinite200pro)内；设定反应程序为25
±
1℃，轨道振动180s，稳定10min，优化测试值默认(100)，开始反应。反应结束后测定处于稳态的荧光偏振值，由meglan软件自动计算出各个样品孔对应的各向异性值。然后，取消轨道振动选项，再次孵育10min，再测定一次，观察整个体系是否处于稳定状态，数值是否可信，当两次数据的差小于5％时，我们认为整个反应已经处于稳态。将收集好的数值用origin进行数据处理并作图，通过hill方程进行特征曲线拟合，并计算其解离常数(kd)。
[0075]
δr＝δr
max
×
pn/(kd+pn)
[0076]
公式中p代表蛋白的浓度；kd代表解离/结合曲线中值所对应的蛋白浓度，即为解离常数；δr
max
代表荧光各向异性的最大差值(＝r
max
，complex-r
free
dna)，n为hill系数，n＝1时该方程为米氏方程。
[0077]
dsadna、dstdna、dscdna和dsgdna的荧光偏振实验结果如图3所示。
[0078]
实验结果表明：udg酶在bsa的作用下进行荧光偏振实验，结果发现udg酶可识别a、g、c、t四种中的任意一种(碱基用n表示)，udg与不同识别序列结合是有偏好的。实验中使用的不同双链dna区别在于只有在识别序列的n碱基处发生改变。由图3可得，在同一条件下，随着udg蛋白的浓度增高，与dna结合逐渐饱和，其中与识别序列为g或c的bindingfraction较大，并且识别序列中n为g的序列时kd(6.648)最小。结果证明udg和两个末端碱基中至少一个为g的双链dna的序列结合活性最好。
[0079]
本技术人在dna重组实验研究中发现udg酶对dna重组反应中有重要的催化作用，能够帮助同源重组反应中的单片段dna以及多片段dna有效实现dna组装，对载体构建具有重要作用。udg酶可以通过静电作用力和氢键作用使得udg酶结合在dna片段上，udg酶对底物有高度特异性，对dna正常碱基及rna中的尿嘧啶碱基均无作用。而udg酶在bsa的辅助作用下，可对双链dna的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶具有切割作用，对dna重组具有重要作用。本发明避免了限制性内切酶的使用，降低了载体自连接，进而降低了dna重组实验的假阳性。
[0080]
实施例2：研究不同udg酶的反应量对tbk组装效率的影响
[0081]
以总体系10μl为例，5
×
tbk储存溶液至于冰上，需要注意的是5
×
tbk储存溶液中加入的udg酶的量各不相同。按照以下步骤完成实验。分别配制不同的5
×
tbk反应液：
[0082]5×
tbk反应液a1包括：0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0083]5×
tbk反应液a2包括：0.15μl1u/μl(或表示为125nm)udg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0084]5×
tbk反应液a3包括：0.3μl1u/μl(或表示为150nm)udg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0085]5×
tbk反应液a4包括：0.45μl1u/μl(或表示为175nm)udg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0086]5×
tbk反应液a5包括：0.6μl1u/μl(或表示为200nm)udg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0087]5×
tbk反应液a6包括：0.75μl1u/μl(或表示为225nm)udg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。
[0088]
需要注意的是每组实验加入5
×
tbk反应液均为2μl。
[0089]
每组实验进行组装实验时，还包括1μl线性化载体puc19(hindiii、ecori双酶切)，该载体具有laczα报告基因；5μl插入片段p4、最后ddh2o补足至10μl。对照组是为了验证假阳性克隆(载体环化)的概率，分别加入5
×
tbk储存溶液2μl、1μl线性化载体puc19，最后ddh2o补足至10μl。对实验结果分别进行菌落pcr、一代测序分析，结果见表3和附图4和图5。
[0090]
表3
[0091]
[0092][0093]
实验结果表明：实验组a4的阳性菌落占总菌落95％以上，是实验组中tbk组装效率最高的一组。每组20个阳性菌落进行pcr检测，经分离和限制性内切酶鉴定，均正确。10个质粒用m13f和m13r引物进行测序，测序结果均正确。对照组表明假阳性率低，可忽略不计。udg酶可在大肠杆菌细胞内转化后完成dna组装，并且0.45u(或表示为175nm)的udg酶阳性克隆转化率远远高于0.5u-0.75u。
[0094]
实施例3：研究线性化载体与插入片段的摩尔比对tbk组装效率的影响。
[0095]
本实验研究载体与插入片段摩尔比值1:1-1:8对tbk组装效率的影响。5
×
tbk储存溶液至于冰上，反应条件一致，线性化载体puc19、插入片段p4。按照以下步骤完成实验：
[0096]
实验组b1线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:1。
[0097]
实验组b2：线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:2。
[0098]
实验组b3：线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:4。
[0099]
实验组b4：线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:6。
[0100]
实验组b5：线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:8。
[0101]
此外，实验组反应体系中除了载体与片段的摩尔比值为变量，均包含0.45μl1u/μludg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、0.2μlbsa(10mg/ml)和1mkcl。对实验结果分别进行菌落pcr、一代测序分析，结果见表4和附图6以及附图7。
[0102]
表4
[0103][0104][0105]
实验结果表明：实验组b2和b3的阳性菌落占总菌落95％以上。每组20个阳性菌落进行pcr检测，经分离和限制性内切酶鉴定，均正确。10个质粒用m13f和m13r引物进行测序，测序结果均正确。而实验组b5阳性克隆较少，研究发现当线性化载体与插入片段的摩尔比值为1：8，阳性菌落数呈指数下降，tbk组装效率降低了约3倍，并且该差异是由所使用的比率造成的。因此，载体与片段比超过1：4会降低tbk的组装效率，线性化载体与插入片段的摩尔比最佳值为1：2-1：4。
[0106]
实施例4：研究udg酶不同的反应时间对tbk组装效率的影响。
[0107]
以总体系10μl为例，5
×
tbk储存溶液至于冰上，1μl线性化载体puc19、5μl插入片段p4，线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:2。按照以下步骤完成实验。为了优化tbk组装，本实验将udg酶、载体和插入物在室温下孵育时间从0至60min不等，从而研究tbk的组装效率。对实验结果分别进行菌落pcr、一代测序分析，结果见表5和附图8和附图9。
[0108]
表5：
[0109][0110][0111]
实验结果表明：在tbk储存液下，udg酶、载体和插入物室温孵育2.5min足以使得单链退火并产生5'单链末端，超过5分钟的孵育会严重降低克隆效率。为了提高tbk组装效率，研究表明反应时间不宜过长，最好不高于5min。
[0112]
实施例5：tbk组装也用于多个dna片段组装。
[0113]
以总体系10μl为例，5
×
tbk储存溶液至于冰上，线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:2。按照以下步骤完成实验。水稻日本晴的cdna、启动子序列和基因组分别作为模板通过pcr分别扩增一个片段p123(3654bp)，两个片段p12(2045bp)、p23(3108bp)和三个片段p1(546bp)、p2(1499bp)、p3(1609bp)，通过同源重组进行构建，这些单一片段相互组装到pcambia2300载体(bamhi、xbai双酶切)，该载体具有35s强启动子和gfp绿色荧光标签(如附图9)，根据插入片段情况，强启动子区域通过酶切位点已删除。片段与载体具有20-22bp的同源臂。本试验主要研究片段数量和tbk组装效率之间的关系，分别进行了单片段p1，两个片段p1、p23和p12、p3，以及三个片段p1、p2和p3分别与pcambia2300进行tbk组装。实验结果见附图10。对实验结果分别进行菌落pcr、一代测序分析。
[0114]
实验结果表明：每组20个阳性菌落进行pcr检测，所用引物为插入片段的正向引物和载体上的反向引物gfp-r。经分离和限制性内切酶鉴定，均正确。10个质粒使用插入片段的正向引物和载体上的反向引物gfp-r进行测序，测序结果均正确。在所有测试中，阳性菌落占总菌落的90％以上，研究结果表明，阳性菌落数量随片段数的增加而下降，表明tbk组装效率随插入片段数的增加随之下降。
[0115]
实施例6：tbk储存液中bsa和kcl溶液的最佳反应量组合。
[0116]
分别配制以下几种5
×
tbk混合液：
[0117]
反应液c1：0.45μl1u/μludg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、850mmkcl；
[0118]
反应液c2：0.45μl1u/μludg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、1mgbsa和950mmkcl；
[0119]
反应液c3：0.45μl1u/μludg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、2mgbsa和1mkcl；
[0120]
反应液c4：0.45μl1u/μludg酶、0.5mtris-hcl(ph＝7.5)、3mgbsa和1.1mkcl。
[0121]
以总体系10μl为例，5
×
tbk储存溶液至于冰上，1μl线性化载体puc19、5μl插入片段p4，线性化载体与插入片段的摩尔比值为1:2。反应条件设置为，室温(25℃)孵育2-3min后，冰上静置10min，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞并在胞内完成连接以及dna的重组克隆。所述大肠杆菌的感受态细胞制备方法采用cacl2法(不限于kcm、inoue法制备感受态细胞)，感受态细胞是大肠杆菌dh5α，化学转化方法的转化效率比电转效率高得多，本实验方案采用化学转化感受态细胞dh5α。实验结果见表6和附图11和附图12。
[0122]
表6：
[0123]
[0124][0125]
实验结果表明：当5
×
tbk储存溶液中的bsa蛋白为2mg，kcl的浓度为1m时，阳性克隆数量最多，tbk组装效率最高。表明一定浓度的kcl缓冲液和bsa蛋白之间协同作用，发挥tbk组装的最优效果。一方面kcl缓冲液增加盐溶液的浓度，钾离子与蛋白质部分结合,具有保护bsa蛋白质不易变性的优点、促进bsa的稳定性。另一方面发挥bsa保护udg酶活性，从而提高同源重组的构建效率。
[0126]
以上涉及到的引物的碱基序列如核苷酸序列表所示。
[0127]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0128]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由udg酶、bsa、kcl、tris-hcl以及余量的水组成；所述udg酶的酶活力大小为0.3u-0.75u；所述dna片段的两个末端具有与所述载体同源的同源臂，所述同源臂序列的长度为15-30bp，所述载体为线性化载体。2.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述bsa的浓度为10mg/ml。3.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述kcl的浓度为850mm-1.1m。4.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述tris-hcl的浓度为0.2-1m，ph为7.5。5.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述udg酶的酶活力大小为0.45u。6.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述dna片段的两个末端碱基中至少一个为g。7.根据权利要求1所述的用于组装dna片段和载体的dna重组试剂盒，其特征在于：所述同源臂序列的长度为20bp。8.用于组装dna片段和载体的dna重组方法，其特征在于，所述重组方法包括以下步骤：将权利要求1-7中任意一条权利要求所述的试剂盒、dna片段和载体混匀后进行无缝克隆组装反应；将所述无缝克隆组装反应所得产物进行转化反应，得到重组dna。9.根据权利要求8所述的用于组装dna片段和载体的dna重组方法，其特征在于，所述载体和dna片段的摩尔比为1:2-1:4。10.根据权利要求8所述的用于组装dna片段和载体的dna重组方法，其特征在于，所述无缝克隆组装反应的反应条件为在室温下孵育2-3min，将所述无缝克隆组装反应所得产物冰浴5-10min后进行转化反应。

技术总结
本发明提供了用于组装DNA片段和载体的DNA重组试剂盒以及DNA重组方法，涉及生物技术，所述试剂盒由UDG酶、BSA、KCl、Tris-HCl以及余量的水组成；所述UDG酶的酶活力大小为0.3U-0.75U；所述DNA片段的两个末端具有与所述载体同源的同源臂，所述同源臂序列的长度为15-30bp，所述载体为线性化载体。本发明还提供了一种DNA重组方法。本发明突破了传统限制性内切酶和DNA外切酶的限制，在特定酶活力大小的UDG酶、BSA、KCl和Tris-HCl的参与下，针对所述DNA片段和载体，能够快速、高转化效率地完成单片段以及多片段所述DNA和载体的组装，降低了所述DNA片段和载体的组装成本，提高了克隆效率。率。率。


技术研发人员：李艳艳
受保护的技术使用者：核小体（北京）生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/9/12