AGPG在作为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌治疗靶点中的应用的制作方法

gtatagcttaacgtaggcatttttttg-3'(seq id no.3)；
13.shrna2-agpg：5'-ccggaagactttgttaaccgttccctctcg aggtatagcttaacgtaggcatttttttg-3'(seq id no.4)。
14.本发明所述的小干扰rna可以按照本领域的常规方法制得，也可以进一步被胆固醇修饰。
15.本发明技术方案之三在于agpg抑制剂可以与其他抗雌激素类药物联合使用，在作为治疗乳腺癌药物中的应用。在一些实施例中，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌。
16.在另一些实施例中，所述乳腺癌为耐药性内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌。所述耐药性可以为原发性也可以为获得性耐药性，通常是指抗内分泌药物的耐药性，例如他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。agpg抑制剂可以如前所述。
17.本发明所述的抗雌激素类药物为本领域常用的抗刺激素类药物，包括但不限于他莫昔芬或氟维司群。
18.本发明所述的agpg抑制剂与其他抗雌激素类药物可以同时服用，也可以先后服用，所用剂量可以选用本领域常规的治疗有效量的剂量。
19.本发明敲除agpg显著抑制了mcf7及t47d乳腺癌细胞的增殖。在携带他莫昔芬耐药mcf7异种移植物的裸鼠中进一步证实以上发现，注射胆固醇修饰的agpg sirna有力地抑制了异种移植物的生长。该研究充分证明敲除agpg对治疗乳腺癌，特别是内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌有效，抑制效果明显。即agpg可以作为乳腺癌，特别是内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌的治疗靶点。
附图说明
20.图1为细胞系敲低结果图，其中图a为mcf7、t47d细胞系中用shrna对agpg进行敲低的结果图，结果显示shrna可以显著降低mcf7、t47d细胞中agpg的表达量。其中图b为他莫昔芬、氟维司群耐药的mcf7细胞系中用shrna对agpg进行敲低的结果图，结果显示shrna可以显著降低他莫昔芬、氟维司群耐药的mcf7细胞中agpg的表达量。
21.图2为细胞增殖和集落形成实验结果图；其中图(a-b)为细胞增殖实验结果图，结果显示agpg shrna抑制mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7的细胞增殖。图c为集落形成实验结果图，图d为图c的数量统计图；图e为集落形成实验结果图，图f为图e的数量统计图，实验结果图，结果显示agpg shrna抑制mcf7、t47d细胞的集落形成。
22.图3为细胞周期结果图；图(a-b)为流式细胞术检测实验结果图，结果显示agpg shrna导致mcf7、t47d细胞g0/g1期升高。
23.图4为肿瘤生长结果图；图(a-b)为小鼠成瘤大小统计图，结果显示agpg shrna、胆固醇修饰agpg sirna有力地抑制了裸鼠体内肿瘤的生长。
具体实施方式
24.以下结合附图和实施例对本发明进一步说明，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
25.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.本发明所用生物材料、试剂和试剂盒等均可以通过常规商业购买得到，所用实验技术均为本领域内的常规操作或参照相应商品的说明书进行操作。
27.若无特别说明，以下实施例所用的mcf7、t47d、293t细胞系购自美国类型培养库(atcc、manassas、v a)。
28.若无特别说明，以下实施例中他莫昔芬或氟维司群耐药mcf7细胞亚系的构建方法为：通过在不含酚红/谷氨酰胺的rpmi1640培养基(biological industries，beit haemek，israel)中培养mcf7细胞，并添加10％炭脱胎牛血清(biological industries)、glutamax(gibco)；开始按照0.1，0.2，1μm梯度浓度依次增加他莫昔芬(selleck，houston，tx)或按照0.01，0.05，0.1μm梯度浓度依次增加氟维司群(selleck)，每种浓度持续4个月，共培养12个月，所得细胞即为他莫昔芬或氟维司群耐药mcf7细胞亚系。他莫昔芬或氟维司群耐药mcf7细胞亚系继续维持在上述1μm他莫昔芬或0.1μm氟维司群的培养基中，未特别说明的其他条件同常规mcf7细胞的培养。
29.实施例1：敲低agpg的mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞系的构建
30.1、agpg敲低细胞系的建立
31.根据长链非编码rna(lncrna)agpg序列按照常规方法设计敲低agpg表达的shrna，本实施例所用的shrna靶序列如下表1：
32.表1
[0033][0034]
agpg的全长和shrna由genewiz(suzhou,china)合成并连接到plvx-puro和plko载体上。(plvx-puro和plko购自addgene)形成重组载体plvx-puro-agpg或plko.1-shrna。
[0035]
2、细胞慢病毒感染
[0036]
通过lipofectamine 3000试剂(invitrogen；thermo fisher scientific)将质粒pspax2、pdm2.g和plvx-puro-agpg或plvx-puro或plko.1-agpg-shrna1或plko.1-ctr shrna(ctr shrna序列如seq id no.5)共转染到293t细胞中。转染后24小时收获第一批慢病毒，在转染后48小时收获第二批慢病毒。
[0037]
3、感染
[0038]
mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞在含有慢病毒的培养基中培养24小时，用含有2μg/ml嘌呤霉素(thermo fisher scientific)的完全培养基培养48小时，获得agpg敲低的mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞系。
[0039]
4、rt-qpcr验证
[0040]
用trnzol universal(tiangen)试剂提取步骤3感染的mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维
司群耐药mcf7细胞总rna。用nanodrop2000分光光度计测量rna的浓度和质量。用hiscript ii第一链cdna合成试剂盒(+gdna wiper)(vazyme)将rna逆转录为第一链cdna。rt-qpcr反应用chamq通用sybr-qpcr混合试剂(vazyme)在7500荧光定量pcr系统上进行。qrt-pcr引物序列如下表2所示：
[0041]
表2
[0042]
geneprimer forward(正向引物)primer reverse(反向引物)agpgggaggcggaggttgtagtgaattgtgggagggaagtctgtgg18sgtaacccgttgaaccccattccatccaatcggtagtagcg
[0043]
在荧光定量pcr仪按照下列设定的程序反应：预变性，95℃，30sec；变性，95℃，10sec、退火，60℃，30sec。(变性、退火，40个循环)。
[0044]
结果如图1所示，在用慢病毒感染的mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞系中进行agpg敲低，结果显示，与对照组ctr sh相比，sh1组和sh2组对mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞中agpg的敲低均达到理想效果。
[0045]
实施例2细胞增殖检测
[0046]
细胞活力测定实验:实施例1所获得的敲低agpg的mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7细胞，收各组细胞接种于96孔板中，每孔5000个细胞。将10μl cck-8溶液(dojindo，tokyo，japan)与90μl培养基混合，加入各组细胞2小时，用微孔板分光光度计检测每孔450nm处的吸光度，以反映细胞活力。
[0047]
结果如图2(a-b)所示，agpg的敲低显著抑制了mcf7、t47d、他莫昔芬、氟维司群耐药mcf7中的细胞增殖。
[0048]
集落形成实验：实施例1所获得的agpg敲低的mcf7、t47d细胞，以500个细胞/孔的密度接种在6孔板中。细胞培养10天，然后用4％的多聚甲醛溶液(pfa)固定，并用0.1％结晶紫(solarbio)染色。采用image j软件进行集落计数。
[0049]
结果如图2c所示，agpg的下调显著抑制了mcf7、t47d细胞的集落形成。
[0050]
实施例3靶向抑制agpg抑制细胞周期
[0051]
细胞周期分析实验：进行细胞周期分析时，将10
^6
个实施例1获得的agpg敲低的mcf7、t47d细胞用75％乙醇处理并在4℃条件下固定2小时。固定后的细胞在含rnaase的200μl碘化丙啶(pi)(mce)中孵育0.5小时。染色后的细胞在流式细胞仪上进行流式细胞分析(becton dickinson，franklin lakes，nj)。数据采用modfit lt v.3.1软件进行分析。
[0052]
结果如图3所示,agpg shrna导致mcf7、t47d的g0/g1期细胞比例升高。
[0053]
实施例4靶向抑制agpg抑制肿瘤的生长
[0054]
小鼠成瘤实验：动物实验按照扬州大学指导原则进行。五周龄雌性裸鼠购自于扬州大学动物中心，雌二醇颗粒(0.72mg，ne-121，innovative research of america，florida，usa)被皮下植入五周龄雌性裸鼠背部。
[0055]
一周后，将小鼠随机分成两组，第一组，ctr shrna；第二组，agpg shrna1，将10
^7
个实施例1所述的agpg敲低的他莫昔芬耐药mcf7细胞皮下注入小鼠腋窝。
[0056]
两周后触及肿瘤形成时，第四周给予小鼠腹腔注射他莫昔芬(20mg/kg，每周两次)。连续给药6周，每周称重裸鼠的体重并用游标卡尺测量肿瘤的大小。第10周把老鼠转移至解刨室统一处死，解刨出皮下肿瘤并称量其重量，测量肿瘤的长宽记录相关数据，用(长*
宽^2)/2计算肿瘤大小)。
[0057]
结果如图4a所示，agpg shrna、胆固醇修饰agpg sirna有力地抑制了肿瘤的生长。
[0058]
实施例5靶向抑制agpg抑制肿瘤的生长
[0059]
1、agpg sirna的制备
[0060]
(1)亲脂h-磷酸盐的合成
[0061]
将咪唑(1g，14.5mmol)溶于20ml乙腈中，冷却至0℃。在此溶液中加入三乙胺(tea，2ml,14.0mmol)和pcl3(0.4ml,4.5mmol)，然后在0℃下搅拌25min。将1mmol胆固醇溶于10ml二氯甲烷中，在氩气下滴入混合物中40min。将反应混合物在室温，轨迹线性化(tlc)控制下，再搅拌1小时，然后加入3ml水并随后蒸发。将残留物溶解在30ml二氯甲烷中，用20ml水洗涤2次，在硫酸钠上干燥，过滤，然后在减压下蒸发。将粗产物溶解于ch3oh/ch2cl2(10/90)中，然后进行硅胶层析(以ch3oh/ch2c
l2 10/90至70/30,添加0.1％tea洗脱)，获得亲脂h-磷酸盐。
[0062]
(2)寡核苷酸亲脂偶联物的合成
[0063]
将步骤(1)制备的4.5mmol亲脂h-磷酸盐溶解在150ml二氯甲烷中。加入15mg sirna(seq id no.2所示：5
’‑
gcacatgcaaagctggctt-3’),均匀混合。然后用戊酰氯(1.3ul，12.5umol，溶于150ul吡啶/乙腈，2/1)反应5分钟，用乙腈洗涤，重复进行两次缩合反应。再用乙腈洗涤，0.2ml i2溶液(0.1m，吡啶/水,98/2)反应20min，乙腈、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到胆固醇修饰的sirna。
[0064]
2、体内实验
[0065]
小鼠成瘤实验：动物实验按照扬州大学指导原则进行。五周龄雌性裸鼠购自于扬州大学动物中心，雌二醇颗粒(0.72mg，ne-121，innovative research of america，florida，usa)被皮下植入五周龄雌性裸鼠背部。
[0066]
将雌二醇五周龄裸鼠背部，一周后皮下注射10
^7
个他莫昔芬耐药mcf7(mcf7-tamr)细胞。
[0067]
两周后可触及肿瘤形成时，将小鼠随机分为4组:第一组，vehicle+胆固醇-ctr sirna；第二组,vehicle+胆固醇-agpg sirna1；第三组，他莫昔芬+胆固醇-ctr sirna；第四组，他莫昔芬+胆固醇-agpg sirna1组。各组在肿瘤内注射胆固醇修饰的agpg sirna或ctr sirna(genepharma)(250nm/kg，每周两次)，第三组和第四组联合他莫昔芬(20mg/kg，每周两次)腹腔注射。连续给药6周，每周称重裸鼠的体重并用游标卡尺测量肿瘤的大小。第10周把老鼠转移至解刨室统一处死，解刨出皮下肿瘤并称量其重量，测量肿瘤的长宽记录相关数据，用卡尺测量肿瘤大小，用(长*宽^2)/2计算肿瘤大小。
[0068]
结果如图4b所示，agpg shrna、胆固醇修饰agpg sirna有力地抑制了肿瘤的生长。

技术特征：
1.agpg在作为乳腺癌治疗靶点中的应用，agpg序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌；优选的，所述的乳腺癌为他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。3.agpg抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，agpg序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌；优选的，所述的乳腺癌为他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。5.agpg抑制剂和抗雌激素类药物在联合制备治疗乳腺癌药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌；优选的，所述的乳腺癌为他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗雌激素类药物为他莫昔芬或氟维司群。8.根据权利要求3～7任一项所述的应用，其特征在于，所述的agpg抑制剂为小分子化合物或agpg的小干扰rna。9.根据权利要求3～7任一项所述的应用，其特征在于，所述小干扰rna的核苷酸序列选自seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4。10.根据权利要求3～7任一项所述的应用，其特征在于，所述小干扰rna被胆固醇修饰。

技术总结
本发明公开AGPG在作为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌治疗靶点中的应用，本发明通过稳定敲除的研究发现，AGPG能够促进体外内分泌抵抗细胞周期进展和细胞增殖。最后基于小干扰RNA的药物在体内实验中进行了测试，进一步证明小干扰RNA介导的AGPG的下调显著抑制他莫昔芬耐药MCF7异种移植物的生长。芬耐药MCF7异种移植物的生长。


技术研发人员：余诗奕 吴瑞 孙海波
受保护的技术使用者：南京捷因诊断技术有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/9/12