鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗及其制备和应用的制作方法

1.本发明属于亚单位疫苗技术领域，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,cav)引起的，以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及高死亡率为特征的传染病。鸡是cav的唯一自然宿主，至今未发现其他禽类对本病易感。各年龄鸡都易感，但主要发生在2-3周龄的雏鸡，其中1-7日龄雏鸡最易感；随着日龄的增加，其易感性、发病率和死亡率逐渐降低。
3.目前，鸡传染性贫血疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，由于鸡传染性贫血病毒可以引起免疫抑制，灭活疫苗免疫效果不理想，所以生产中灭活疫苗使用不多见；而弱毒株疫苗有残存毒力，且活疫苗毒株国内尚无适合的商品化产品。故通过基因工程技术制备亚单位疫苗是一个有前景的疫苗方向。
4.cav基因组编码区含有三个部分或完全重叠的开放阅读框(orf)，分别编码蛋白vp1、vp2和vp3。vp1是唯一在病毒粒子上检测到的病毒衣壳蛋白，是构成中和抗原位点的组成部分。vp2是一个多功能非结构蛋白，在病毒装配过程中使vp1形成正确的构像，诱导机体产生免疫保护作用，也有丝氨酸和酪氨酸蛋白磷酸化酶活性影响病毒粒子的复制。vp3蛋白与病毒的毒力有关，能够诱导鸡胸腺细胞和类淋巴细胞系快速凋亡，导致贫血、出血症状，又称为凋亡蛋白。研究表明，用单独表达vp1蛋白的昆虫细胞接种鸡，不能刺激机体产生有保护作用的中和抗体，接种共表达vp1、vp2蛋白的昆虫细胞能刺激机体产生较强的中和抗体。另外，由于vp1的n端序列含有由高比例碱性氨基酸组成的核定位肽序列，该序列除了含有大量碱性氨基酸外还含有许多影响大肠杆菌表达的稀有密码子，表达试验结果显示vp1全基因不能在大肠杆菌工程菌宿主中表达。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的问题，本发明旨在以cav的vp1蛋白为基础，构建一种能够在大肠杆菌中高效表达的可溶性融合蛋白，而且以该融合蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
7.本发明第一方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质，或者为在seq id no.1所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签后得到的蛋白质，或者为在seq id no.1所示的氨基酸序列上经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后仍具有相同功能的蛋白质。
8.本发明第二方面提供了与所述融合蛋白相关的生物材料，具体包括以下：
9.(i).编码所述融合蛋白的核酸分子，其序列优选为如seq id no.2所示；
vp1不能在大肠杆菌表达系统中表达以及vp1蛋白单独接种免疫效果差的技术问题，制备的融合蛋白具有良好的可溶性，在透射点电镜下有明显的病毒样颗粒结构，作为疫苗接种后对免疫种鸡的子代鸡具有良好的保护能力；而且，采用大肠杆菌表达系统制备融合蛋白具有表达水平高、成本低，周期短等优点。因此，本发明提供的鸡传染性贫血病毒疫苗具有不错的应用前景。
附图说明
29.图1为实施例1中vp1基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，其中泳道1为vp1，泳道2为阴性对照，泳道3为dna marker。
30.图2为实施例1中不同表达菌诱导表达后全菌液的sds-page电泳图，其中泳道1为空白表达菌全菌对照；泳道2为e.coli.bl21/pet-28-cav vp1全菌；泳道3为e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd29全菌；泳道4为e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd56全菌；泳道5-6为e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd137全菌；泳道7为空白表达菌全菌对照；m：蛋白质分子质量标准。
31.图3为实施例1中重组表达工程菌e.coli bl21/pet28 rcav vp1诱导表达后的sds-page电泳检测结果，其中泳道1为protein marker，泳道2为阴性对照，泳道3为破菌全液，泳道4为破菌上清液。
32.图4为实施例2中重组表达工程菌e.coli bl21/pet28 rcav vp1诱导表达所得上清液纯化后的sds-page电泳检测结果，其中泳道1为protein marker，泳道2-7分别为用sepharose 4ff凝胶过滤层析纯化收集管的1～6号管。
33.图5为实施例2制备的目的蛋白在透射电镜下放大5万倍的电镜图。
具体实施方式
34.为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
35.若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
36.实施例1融合蛋白的制备
37.本例提供了一种制备氨基酸序列如seq id no.1所示融合蛋白的方法，包括以下步骤：
38.(1)cav的dna提取。
39.取鸡肝脏组织样品(来源于湖北荆州某鸡场)，加入0.05m ph7.4 pbs，用高通量组织冷冻研磨仪进行匀浆，取匀浆400μl，再使用商品试剂提取基因组dna。
40.(2)cav vp1基因的扩增和测序。
41.以步骤(1)提取的基因组dna为模板，pcr扩增vp1基因(所用引物为cav vp1pf/r，具体序列见表1)。回收扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1。另外，将扩增产物送上海生物工程有限公司进行dna序列测定，检测结果表明扩增所得vp1基因大小与凝胶电泳检测结果一致，且序列如seq id no.3所示(该序列与genbank,mk484615.1序列最相
近，同源性为99.78％)。
42.(3)vp1基因序列的优化。
43.本例通过pcr扩增的方式对vp1基因进行改造，具体为：通过设计系列pcr引物，优化vp1蛋白n端序列的剪切方式。如本例提供了四条带酶切位点的上游引物，分别为nd0 primer、nd29 primer、nd56 primer、nd137 primer，并以带酶切位点的vp1-pr为通用下游引物(各引物序列见表1，其中下划线处为酶切位点)。通过不同的上游引物引物可实现对vp1蛋白n端不同长度的截短表达。
44.以步骤(1)提取的基因组dna为模板，采用不同的引物对进行pcr扩增，回收扩增产物。再将扩增产物与pet-28a质粒载体分别用ecori/xhoi酶切后连接，得到4个重组表达质粒，分别为pet-28-cav vp1(含有全长vp1基因序列)，pet-28-cav vp1nd29，pet-28-cav vp1nd56和pet-28-cav vp1nd137。
45.将4个重组表达质粒分别转化至大肠杆菌bl21中，制成四种重组表达工程菌，分别为未经截短的e.coli.bl21/pet-28-cav vp1，n端截短29个氨基酸残基的e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd29，n端截短56个氨基酸残基的e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd56和n端截短137个氨基酸残基的e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd137。
46.对4种重组表达工程菌进行诱导表达，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为0.03mol/l。待表达结束后，用超声波破菌并离心，然后通过sds-page电泳检测蛋白的表达量。
47.检测结果如图2所示，表明：e.coli.bl21/pet-28-cav vp1和e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd137均未见明显的蛋白表达带；而e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd29和e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd56则有明显的蛋白表达带。
48.(4)编码融合蛋白基因的获取。
49.以e.coli.bl21/pet-28-cav vp1nd56工程菌表达的蛋白为基础，对编码蛋白的基因序列进一步做如下改进：
50.①
在蛋白的n端插入cav vp2的n端32个氨基酸残基片段。具体通过pf primers 1、pf primers 2和pf primers 3(引物序列信息见表1)这三条递进引物进行顺序扩增实现。
51.②
在蛋白的c末端去掉终止密码子tga后，与来源于鸡载脂蛋白gallus gallus apolipoprotein ai(apoa1)(accession:xm_015297971，核苷酸序列如seq id no.17所示，氨基酸序列如seq id no.18所示)的疏水氨基酸残基毗邻区(apoa1 14-30)连接。将14-16位氨基酸序列“tgt”改为“tgggt”做连接肽。在连接肽后面是一个由14个氨基酸残基组成的多肽(即qarsfwqhdepqtp)。该片段能显著提高融合蛋白的水溶性。最后在该序列末端加上终止密码子gta。
52.③
另外，将cav原vp1基因1297-1259bp的cca改为ccg，以封闭ccatgg的ncoi限制酶切位点，为构建不含tag的表达工程菌做准备。
53.②
和
③
通过pr primer 1、pr primer 2、pr primer 3(引物序列信息见表1)这三条递进引物进行顺序扩增实现。
54.表1引物信息
[0055][0056]
根据上述三对递进引物进行pcr扩增，得到目的基因片段，具体过程为：
[0057]
①
以步骤(1)提取的基因组dna为模板(或以重组质粒pet-28-cav vp1nd56为模板)，以不含酶切位点的nd56 primer(序列具体如seq id no.19所示)与cav vp1pr分别为上下游引物进行扩增；
[0058]
②
以步骤
①
的扩增产物为模板，用引物pf primers 1/pr primer 1进行第一轮pcr扩增；
[0059]
③
以步骤
②
的扩增产物为模板，用引物pf primers 2/pr primer 2进行第二轮pcr扩增；
[0060]
④
以步骤
③
的扩增产物为模板，用引物pf primers 3/pr primer 3进行第三轮pcr扩增；
[0061]
⑤
将第三轮扩增完成后的扩增产物进行电泳回收并测序，测序显示其序列如seq id no.2所示。
[0062]
将目的基因片段与用ncoi/xhoi双酶切后插入pet28a质粒载体的多克隆位点上，转化大肠杆菌bl21宿主菌，构建成重组表达工程菌，并将其命名为e.coli bl21/pet28 rcav vp1。
[0063]
将e.coli bl21/pet28 rcav vp1进行诱导表达。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为0.03mol/l。然后，用超声波破菌离心后，通过sds-page电泳检测蛋白的表达量及其溶解性状。
[0064]
检测结果如图3所示，从图可知：e.coli bl21/pet28 cav rvp1有明显的蛋白表达，表达产物在破菌液的全菌中和在破菌液的上清中的含量基本相等，表明该表达蛋白是完全可溶性蛋白，且表达蛋白分子量大约53kd。
[0065]
实施例2鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗
[0066]
本例提供了一种鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗，其制备过程如下：
[0067]
(1)抗原蛋白的制备。
[0068]
采用实施例1构建的重组表达工程菌e.coli bl21/pet28 rcav vp1制备疫苗所用的抗原蛋白，制备过程如下：
[0069]
对e.coli bl21/pet28 rcav vp1进行诱导表达，其中诱导剂为α-乳糖，工作浓度为0.03mol/l。待表达结束后，用超声波破碎菌体，离心取上清，一次盐析粗纯化处理，复溶后用sepharose 4ff凝胶过滤层析纯化，收集外水洗脱峰1-6管。
[0070]
纯化蛋白sds-page检测和透射电镜检测，检测结果见图4和图5，表明：经过纯化后目的蛋白的纯度为82.9％，且所得目的蛋白在透射电镜下有明显的病毒样颗粒结构。
[0071]
(2)疫苗的制备。
[0072]
以抗原蛋白为水相，seppic isa71佐剂为油相，按照w
油相
∶w
水相
＝7/3混合，用均质机进行乳化。
[0073]
本例制备完成的疫苗中，抗原浓度约为32μg/ml。
[0074]
实施例3鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗的免疫评价
[0075]
本例采用实施例2制备的鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗进行了免疫试验，检测结果表明疫苗具有良好的保护作用。
[0076]
成年鸡感染cav后往往造成隐性感染，没有明显的临床症状和体征，导致成年鸡的攻毒实验不易做出有指导意义的评价结果。因此本例需要建立一个攻毒模型，为后续疫苗的保护效力评价奠定基础。本例的操作流程如下：
[0077]
(1)种鸡的免疫及血清抗体检测。
[0078]
取实验室孵化的136日龄spf鸡6只，采集未免疫血清，然后用实施例2制备的疫苗进行胸部肌肉注射(共2ml，左右各1ml)接种疫苗，免疫日龄及剂量详见表2，免疫前后鸡血清样本的采集及血清抗体的检测结果(检测方法为ielisas/n值)见表3。
[0079]
表2.spf鸡免疫日龄及剂量
[0080][0081][0082]
表3免疫鸡的血清抗体检测时间及检测结果(s/n)
[0083][0084]
注：s/n值大于等于2.1，为抗体阳性；student-newman-keuls统计比较免疫前后抗体检测结果，mean
±
sd行数据具有不同字母肩号的数据间差异显著(p《0.001)
[0085]
由表3可见，实验种鸡在第一次免疫3周后，进行ielisa检测其检测结果的s/n值均远高于2.1的阳性标准值。在第一次免疫后6周(或第二次免疫后3周)的s/n值，和第一次免疫后10周(或第三次免疫后4周)的s/n值虽然有所波动，但是都维持在一个较高的水平上。根据student-newman-keuls统计比较分析，这3个时间段的血液抗体无显著性差异。
[0086]
(2)母源抗体小鸡的攻毒实验。
[0087]
取鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗免疫后种母鸡产的母源抗体鸡蛋，在spf鸡专用孵化器中孵化，并取健康的小鸡用于后续实验。其中实验分组情况具体为：母源抗体鸡攻毒组，采用含母源抗体雏鸡，在1日龄时用感染鸡肝组织毒(即实施例1提取cav核酸所用的感染鸡肝组织毒)进行攻毒，组织毒匀浆上清的病毒拷贝数为6
×
105copies/μl，每只鸡胸肌注射攻毒600μl(即3.6
×
108copies/只)；spf攻毒对照组(阳性对照)，采用1日龄spf健康雏鸡8只，用相同的鸡肝组织毒攻击，组织毒匀浆的病毒拷贝数为6
×
105copies/μl，每只鸡胸肌注射攻毒600μl(即3.6
×
108copies/只)；阴性对照组，取1日龄spf健康雏鸡8只，不攻毒。
[0088]
攻毒两周后，对各组鸡的肝组织中cav核酸进行定量检测，检测结果见表4；并进一步将表中肝组织质量拷贝数(copies/mg)数据用spss统计分析软件进行anova单因素方差分析和student-newman-keuls组间比较，结果见表4和5。
[0089]
表4攻毒14天后各组小鸡肝组织病毒载量检测结果
[0090]
[0091][0092]
注：表中的
“‑‑”
表示无数据；
“‑”
表示数据无意义。
[0093]
表5 student-newman-keuls组间比较结果
[0094][0095]
注：表中
“‑”
表示数据无意义。
[0096]
从上述结果可知：母源抗体鸡攻毒组与阴性对照组的cav病毒载量无显著差异，而spf攻毒对照组的cav病毒载量显著高于母源抗体鸡攻毒组和阴性对照组，表明免疫亚单位疫苗后的母源抗体对cav有很好的保护作用。
[0097]
在攻毒两周后，另外采集抗凝血进行血常规检测，各组及检测数据分别与对照组进行t检验分析，检测结果见表6。
[0098]
表6攻毒14天后各组小鸡的血常规检测结果
[0099]
指标阴性对照组母源抗体鸡攻毒组spf攻毒对照组
白细胞数目(wbc，109/l)38.9
±
2.76a39.05
±
4.39a12.03
±
1.85
b*
红细胞数目(rbc，10
12
/l)2.87
±
0.12a2.85
±
0.21a1.57
±
0.03
b*
血红蛋白浓度(hgb，g/l)139.66
±
7.22a137.13
±
10.51a80.25
±
2.50
b*
红细胞压积(hct，％)33.43
±
1.30a32.00
±
2.21a18.08
±
0.57
b*
[0100]
由上表可知：母源抗体鸡攻毒组的白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞压积4项指标与阴性对照组差异不显著性，说明这4项指标在感染14天后依然保持正常水平，表明攻毒后母源抗体鸡的感染程度低，没有明显的临床贫血表现，说明疫苗具有良好的保护作用。
[0101]
综上所述，本发明提供的融合蛋白能够通过大肠杆菌表达系统表达，且具有良好的可溶性，将其该融合蛋白作为抗原蛋白免疫种鸡后，对其子代鸡具有很好的保护作用，故该以融合蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的应用价值。
[0102]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质，或为在seq id no.1所示序列的n端和/或c端连接标签后得到的蛋白质。2.编码权利要求1所述融合蛋白的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如seq id no.2所示。4.包含权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或转化子。5.一种鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的融合蛋白。6.一种制备权利要求5所述鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将编码权利要求1所述融合蛋白的基因片段与质粒载体连接，得到重组载体；s2、将重组载体转化至宿主细胞得到转化子，对转化子进行诱导表达；s3、待表达结束后，回收并纯化目的蛋白；s4、将目的蛋白与佐剂混合均质得到鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pet28a，所述宿主细胞为大肠杆菌。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s1包括：s11、提取鸡传染性贫血病毒的核酸，对vp1基因部分序列进行pcr扩增，且扩增所用引物序列如seq id no.19和seq id no.5所示；s12、以s1所得扩增产物为模板，依次使用seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16三对引物进行三轮递进扩增；s13、将第三轮扩增回收后与质粒载体连接。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述vp1基因全序列如seq id no.3所示。10.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗在制备预防鸡传染性贫血病药物中的应用。

技术总结
本发明公开了鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗及其制备和应用，所述疫苗包括如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白，该融合蛋白很好地解决了鸡传染性贫血病毒VP1全基因不能在大肠杆菌表达系统中表达以及VP1蛋白接种免疫效果差的问题，该融合蛋白具有良好的可溶性、免疫原性和免疫反应性，作为疫苗接种后对免疫种鸡的子代鸡具有良好的保护能力，因此，本发明提供的鸡传染性贫血病毒基因工程亚单位疫苗具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：荣俊 李国攀 王席 李杨 荣雪宁
受保护的技术使用者：荆州市长新生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/9/12