一种荧光探针细胞及其制备方法、鉴定方法

1.本发明涉及一种荧光探针细胞及其制备方法、鉴定方法，属于荧光探针细胞领域。


背景技术：

2.细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3正常以酶原(32kd)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基(17kd)和两个小亚基(12kd)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
3.目前，荧光探针在生命科学研究中的应用越来越广泛。flipgfp是一个荧光依赖于蛋白酶激活的系统，包含3个部分：β链1-9和一个
ɑ
螺旋；β链10；β链11，每个部分都是形成荧光所需的必要元素组件。当这些部分彼此分离时，蛋白质不能发出荧光，当β10和β11连接在一起，但与β1-9分离时，它们将与β1-9链迅速重组，可以几十分钟内产生荧光。在flipgfp中，通常β10-11处于同向平行连接的状态而不产生荧光，在β11和linker中含有一段caspase-3的切割位点——devd，该序列被切割后，β10和β11可以重新排列到正常的反平行位置发生构象改变，从而产生荧光指示的作用，进而实现对活体细胞的凋亡等一系列现象的监测，flipgfp的原理可见图1。已有研究显示，该荧光探针使用瞬时转染后，即使不切割改变flipgfp的构象，也会导致绿色荧光蛋白复性，产生背景升高的问题，无法准确的说明细胞生理状态；并且，荧光探针的构建和筛选过程中，常常存在着构建不稳定、表达低、筛选困难等问题，限制了荧光探针的应用。因此，需要一种高效的方法来构建荧光探针稳定高表达细胞系。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种sgrna、表达盒、重组载体及表达稳定、荧光信号强的重组细胞。
5.本发明还要解决的技术问题是提供一种crispr/cas9 sgrna打靶载体、重组细胞。
6.本发明还要解决的技术问题是提供一种可以快速筛选出高表达荧光探针的稳定细胞系的构建所述crispr/cas9 sgrna打靶载体的方法。
7.本发明还要解决的技术问题是提供一种制备所述荧光探针细胞的方法及其应用。
8.本发明还要解决的技术问题是提供一种鉴定所述荧光探针细胞稳定高表达的方法。
9.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种sgrna，所述sgrna的dna序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
10.本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组细胞含有所述的sgrna的dna序列。
11.crispr/cas9 sgrna打靶载体，含有所述的sgrna的dna序列。
12.本发明内容还包括一种重组细胞含有所述的crispr/cas9 sgrna打靶载体。
13.本发明内容还包括一种荧光探针细胞是由所述的crispr/cas9 sgrna载体与含荧光探针的表达载体共同转染至细胞内得到的。
14.本发明内容还包括一种构建所述crispr/cas9 sgrna打靶载体的方法，包括以下步骤：
15.(1)对所述的sgrna的寡核苷酸链进行退火处理，得到非粘性末端的双链；
16.(2)酶切px330-u6-cbh-hspcas9载体，回收纯化后与步骤(1)所述的非粘性末端的双链相连，得到连接产物；
17.(3)将步骤(2)所述的连接产物转化、培养，提出质粒，即得到crispr/cas9 sgrna打靶载体。
18.本发明内容还包括一种制备所述的荧光探针细胞的方法，包括以下步骤：
19.(1)将所述的crispr/cas9 sgrna打靶载体与含荧光探针的表达载体共同转染至细胞内，培养，得到转染后的细胞；
20.(2)诱导步骤(1)所述的转染后的细胞表达，运用流式细胞术分选出带有绿色荧光的阳性细胞，即得到荧光探针细胞。
21.其中，步骤(1)中所述含荧光探针的表达载体为
22.px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9。
23.本发明内容还包括一种所述荧光探针细胞的应用包括在高通量荧光筛选或生物荧光成像和细胞追踪或生命科学研究中的荧光探针相关实验或药物筛选及药物研发中的应用。
24.本发明内容还包括一种鉴定所述荧光探针细胞稳定高表达的方法，包括以下步骤：
25.(1)诱导所述的荧光探针稳定高表达细胞系的荧光探针融合蛋白的表达，提取单克隆细胞株的基因组dna，分别选择aavs1位点的上下游设计引物进行pcr反应；
26.(2)当琼脂糖凝胶电泳在6000bp处显示条带时，表明荧光探针稳定高表达；当琼脂糖凝胶电泳未在6000bp处显示条带时，表明荧光探针没有稳定高表达。
27.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明提供了一种基于流式细胞术构建荧光探针稳定高表达细胞系的方法及流程，该方法可以快速筛选出高表达荧光探针的稳定细胞系，并且表达稳定、荧光信号强，在不影响细胞活性的情况下，形成了定向整合荧光探针的工具细胞株，为观测细胞内生物学特性和代谢途径提供了有效的手段，适用于生命科学研究、药物筛选和疾病诊断治疗等领域，具有广泛的应用前景。
附图说明
28.图1为flipgfp荧光探针的工作原理图；
29.图2为构建crispr/cas9 sgrna打靶载体的步骤图；
30.图3为基于流式细胞术筛选得到的flipgfp荧光探针稳定高表达细胞系图；
31.图4为单克隆细胞株的基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果图；
32.图5为hela-flipgfp的质粒图谱；
33.图6为hela-flipgfp与hela-wt的细胞荧光染色图。
具体实施方式
34.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
35.实施例1打靶载体的sgrna序列设计
36.根据插入aavs1基因序列(ncbi genebank accession number：gq380658.1)，针对aavs1位点设计sgrna序列，并构建基于crispr-cas9系统的sgrna表达载体(sgrna序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成)。sgrna表达载体包括4部分(均购于美国addgene公司)：u6启动子、靶序列、sgrna骨架和终止信号。其中，sgrna作用位点的dna序列如下：
37.seq id no.1：5
′‑
caccgcgtgggtttatcaaccactt-3
′
(sgrna1靶位点)；
38.seq id no.2：5
′‑
caccgcacgtgggtttatcaaccac-3
′
(sgrna2靶位点)；
39.seq id no.3：5
′‑
caccgacgtgggtttatcaaccact-3
′
(sgrna3靶位点)。
40.实施例2含荧光探针的表达载体与crispr/cas9 sgrna打靶载体的构建
41.将fipgfp荧光探针基因序列(fipgfp购于美国addgene公司，货号124428，其序列参考文献designing a green fluorogenic protease reporter by flipping a beta strand of gfp for imaging apoptosis in animals.zhang q,schepis a,huang h,yang j,ma w,torra j,zhang sq,yang l,wu h,nonell s,dong z,kornberg tb,coughlin sr,shu x.j am chem soc.2019 mar 1.doi:10.1021/jacs.8b13042.10.1021/jacs.8b13042；其中，flipgfp荧光探针基因序列如seq id no.4所示：
[0042]5’‑
atggacctgcctgacgaccactacctgtccacccagaccatcctgtccaaggacctgaactccggactcagatctggcagcggtctcgagatggaagttagcgctctggaaaaagaagtgtctgcactcgagaaagaagtaagtgcccttgagaaggaggtgtccgcactcgagaaggaggtcagcgccctggaaaaggaaaagcgagaccatatggttttgcttgagtatgttacagcggctggcattaccgatgcatcaggtgatgaagttgatggtggcggtggcaaggtgtccgccctgaaggaaaaagtaagcgcactgaaagaaaaggtgagcgcgctgaaggagaaagtgagcgccctgaaagagaaagtctctgcccttaaggaggatatcgagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccaaagcttgccaccatgcgcaaaggcgaagaactgtttaccggcattgtgccgattctggtggaactggatggcgatgtgaacggccataaattttttgtgcgcggcgaaggcgaaggcgatgcgaccattggcaaactgagcctgaaatttatttgcaccaccggcaaactgccggtgccgtggccgaccctggtgaccaccctgacctatggcgtgcagtgctttagccgctatccggatcatatgaaacgccatgatttttttaaaagcgcgatgccggaaggctatgtgcaggaacgcaccatttattttaaagatgatggcacctataaaacccgcgcggaagtgaaatttgaaggcgataccctggtgaaccgcattgaactgaaaggcattgattttaaagaagatggcaacattctgggccataaactggaatataactttaacagccataaagtgtatattaccgcggataaacagaacaacggcattaaagcgaactttaccattcgccataacgtggaagatggcagcgtgcagctggcggatcattatcagcagaacaccccgattggcgatggcccggttcttcttcctggcggccgctctagagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccagaattgatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgat
gaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaatctagagggcccgtttaa-3’)克隆到pcdna3.1载体上，即得到含荧光探针的表达载体px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9。其中，克隆步骤为：首先针对pcdna3-flipgfp的荧光探针部分设计引物并进行pcr(pcr试剂盒购于碧云天，货号d7228)，从而得到flipgfp片段，引物序列如下：
[0043]
①
flipgfp-f：seq id no.5：5
‘‑
cccaagctggctagcgccaccatggacctgcctga-3’；
[0044]
②
flipgfp-r：seq id no.6：5
’‑
ttaaacgggccctctagattacttgtacagctcgtcca-3’，反应体系和反应条件见表1和表2；
[0045]
表1pcr反应体系
[0046][0047]
表2pcr反应条件
[0048][0049]
利用多片段同源重组原理，插入到xho i酶切后的puc19线性化载体中，连接转化挑单菌落测序比对。crispr/cas9的打靶载体构建则是在puc19-flipgfp的基础上，同时连入从hela细胞的基因组dna内扩增的上游同源臂aavs1-l、下游同源臂aavs1-r，上下游分别插入同源臂长度约750bp。同时，按照图2所示步骤，构建sgrna与px330-u6-cbh-hspcas9(购于美国addgene，catalog42230)相连的crispr/cas9 sgrna打靶载体。具体地，在95℃，5min条件下对sgrna寡核苷酸链退火处理后，缓慢降至室温后形成非粘性末端的双链，备用。在37℃水浴中反应1h，用bbs i酶切px330-u6-cbh-hspcas9载体，酶切体系如表3所示：
[0050]
表3酶切体系
[0051]
[0052][0053]
回收纯化后与前述退火后的sgrna相连。将连接产物与荧光探针表达载体分别转化至tiangen公司提供的大肠杆菌菌株dh5α(cb101-03)，其中，转化过程如下所述：1、冰上融化dh5α感受态细胞，将连接产物与荧光探针表达载体分别加入大肠杆菌dh5α中，轻弹管壁混匀，冰上放置30min；2、42℃热激，冰上孵育2min；3、加入不含抗生素的lb培养基，37℃复苏；4、将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的筛选平板上涂板，过夜培养。通过氨苄青霉素抗性平板挑选到单克隆细菌后，将其接种到amp抗性的lb培养基内(无抗性lb培养基购于北京索莱宝科技有限公司，货号l1015；氨苄青霉素(amp)购于碧云天科技有限公司，货号st008)，于37℃，转速250rpm条件下震荡培养24h，之后将细菌通过tiangen公司质粒大量抽提试剂盒dp117，提取出两种质粒(即含荧光探针的表达载体、crispr/cas9 sgrna打靶载体)，备用。
[0054]
实施例3打靶载体与荧光探针载体共转染
[0055]
将实施例2所述的两个载体转染到hela细胞系(购于武汉普诺赛生命科技有限公司)中。转染前一天用0.25％胰酶消化细胞，于6孔板中接种5
×
105个/孔的细胞，当融合度达到70％-80％左右，即细胞数约为1.7x106个时，使用lipofectamine
tm
2000转染试剂(购于赛默飞生物有限公司，货号11668030)将crispr/cas9 sgrna载体与含荧光探针的表达载体共同运用脂质体转染方式转染至hela细胞内，8小时后观察并更换成新鲜细胞培养基培养7天。
[0056]
实施例4运用流式细胞术筛选敲入荧光探针细胞
[0057]
对于转染了打靶载体与荧光探针载体的细胞，以强力霉素dox(终浓度2μg/ml，购于碧云天科技有限公司，货号st039a)诱导flipgfp荧光探针的表达，观察荧光强度。运用流式细胞术分选出带有绿色荧光的阳性细胞，筛选出荧光信号强的细胞(图3，其中，a为未激活状态；b为激活后状态)，将其直接接种到96孔板内；一周后细胞长成单克隆聚落时，再在荧光显微镜下观察，将细胞系标注并转移到24孔板内扩大培养，细胞长满后再转移到6孔板内培养，最后再扩大至10cm的培养皿中培养。
[0058]
实施例5稳定表达荧光探针细胞系的鉴定
[0059]
将实施例4中流式细胞术分选出的阳性细胞扩增培养后，持续加入强力霉素dox抗性基因诱导荧光探针融合蛋白的表达，为鉴定荧光探针flipgfp是否成功插入到aavs1位点上，提取了单克隆细胞株的基因组dna，分别选择aavs1位点的上下游设计引物进行pcr反应(pcr试剂盒购于碧云天，货号d7228)反应体系与条件如表4和表5所示：
[0060]
表4pcr反应体系
[0061][0062]
表5pcr反应条件
[0063][0064]
根据puc19-aavs1载体序列设计pcr上下游引物，对流式细胞术分选培养后的hela细胞系与未敲入flipgfp基因的野生型hela细胞系进行琼脂糖凝胶电泳(图4，wt代表野生型未敲入该探针的hela细胞，第1、2泳道条带代表稳定表达荧光探针细胞)，结果表明(第1、2泳道条带)在定点位置aavs1的同源臂后插入了flipgfp荧光探针，证明flipgfp基因已成功插入到aavs1位点上，且flipgfp敲入后的载体图谱如图5所示。具体引物序列如下：
[0065]
aavs1-flipgfp-f：seq id no.7：5
’‑
accatgattacgccaagcttgtgttcaccaggtcgtgg-3’；
[0066]
aavs1-flipfgfp-r：seq id no.8：5
’‑
ccagttcaggtccatatggtgcactctcagtacaat-3’。
[0067]
6000bp指代的具体序列如seq id no.9所示：
[0068]5’‑
ttacgccaagcttgtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtg ctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagccc
[0069]
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[0070]
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[0071]
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[0072]
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[0073]
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[0145]
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[0146]
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[0147]
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[0148]
实施例6稳定表达荧光探针细胞系检测活细胞凋亡
[0149]
对实施例5稳定表达荧光探针的人宫颈癌hela细胞系给予诱导凋亡的药物处理，首先将表达荧光探针的hela细胞以3x106个细胞数接种于10cm培养皿内，同时加入强力霉素dox(终浓度2μg/ml)启动flipgfp基因的表达，放入培养箱内过夜贴壁培养，得到hela-flipgfp(荧光探针细胞)，然后加入终浓度为3μmol/l的诱凋亡药物jq1(购于mce公司，cas no.1268524-70-4)孵育3h，设置不加入jq1药物的hela细胞作为空白对照(hela-wt)，在荧光显微镜下检测绿色荧光的复性情况。如图6所示，野生型未敲入荧光探针的hela细胞(hela-wt)加入jq1药物诱导凋亡后，只表达红色荧光；敲入荧光探针的hela细胞(hela-flipgfp)加入jq1药物诱导凋亡后，同时表达红色和绿色荧光。通过与未加入药物处理的空白对照组相比，我们发现jq1诱导hela细胞凋亡，在镜下可见明显的flipgfp绿色荧光表达与mcherry的红色荧光共同表达，由于对照组未诱导凋亡，所以空白对照组只产生了mcherry基因表达的红色荧光，未见与绿色荧光探针的复性。

技术特征：
1.一种sgrna，其特征在于，所述sgrna的dna序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。2.表达盒、重组载体、重组细胞，其特征在于，其含有权利要求1所述的sgrna的dna序列。3.一种crispr/cas9 sgrna打靶载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的sgrna的dna序列。4.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述的crispr/cas9 sgrna打靶载体。5.一种荧光探针细胞，其特征在于，其是由将权利要求3所述的crispr/cas9sgrna载体与含荧光探针的表达载体共同转染至细胞内而得到的。6.一种构建权利要求3所述crispr/cas9 sgrna打靶载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对权利要求1所述的sgrna的寡核苷酸链进行退火处理，得到非粘性末端的双链；(2)酶切px330-u6-cbh-hspcas9载体，回收纯化后与步骤(1)所述的非粘性末端的双链相连，得到连接产物；(3)将步骤(2)所述的连接产物转化、培养，提出质粒，即得到crispr/cas9 sgrna打靶载体。7.一种制备权利要求5所述的荧光探针细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求3所述的crispr/cas9 sgrna打靶载体与含荧光探针的表达载体共同转染至细胞内，培养，得到转染后的细胞；(2)诱导步骤(1)所述的转染后的细胞表达，运用流式细胞术分选出带有绿色荧光的阳性细胞，即得到荧光探针细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述含荧光探针的表达载体为px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9。9.一种权利要求5所述荧光探针细胞在检测细胞凋亡或高通量荧光筛选或生物荧光成像和细胞追踪或生命科学研究中的荧光探针相关实验或药物筛选及药物研发中的应用。10.一种鉴定权利要求5所述荧光探针细胞稳定高表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)诱导权利要求5所述的荧光探针稳定高表达细胞系的荧光探针融合蛋白的表达，提取单克隆细胞株的基因组dna，分别选择aavs1位点的上下游设计引物进行pcr反应；(2)当琼脂糖凝胶电泳在6000bp处显示条带时，表明荧光探针细胞稳定高表达；当琼脂糖凝胶电泳未在6000bp处显示条带时，表明荧光探针细胞没有稳定高表达。

技术总结
本发明公开了一种sgRNA以及含有sgRNA的表达盒、重组载体、重组细胞、CRISPR/Cas9sgRNA打靶载体及其制备方法，sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明还公开了一种荧光探针细胞及其制备方法和应用以及鉴定荧光探针细胞稳定高表达的方法。本发明方法可以快速筛选出高表达荧光探针的稳定细胞系，并且表达稳定、荧光信号强，且在不影响细胞活性的情况下，形成了定向整合荧光探针的工具细胞株，为观测细胞内生物学特性和代谢途径提供了有效的手段，适用于生命科学研究、药物筛选和疾病诊断治疗等领域，具有广泛的应用前景。的应用前景。的应用前景。


技术研发人员：叶佳琪 张坤晓
受保护的技术使用者：江苏海洋大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/9/12