一种用于鉴定药用蛭类及其制品的DNA条形码、DNA微条形码及鉴定方法

一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码、dna微条形码及鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及分子标记筛选技术和生物物种鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码、dna微条形码及鉴定方法。


背景技术：

2.药用蛭类是中国传统的一味中药材，迄今为止已有两千多年的药用史。目前《中华人民共和国药典》2020版仅收录3种蛭类物种，包括吸血蛭类物种：日本医蛭(hirudonipponia whitman,1886，水蛭)和非吸血类蛭：宽体金线蛭(whitmaniapigrawhitman,1886，蚂蟥)、尖细金线蛭(whitmaniaacranulata whitman,1886，柳叶蚂蟥)。药用蛭类体内的多种活性成分如水蛭素、组织胺等等可以在人体内发挥抗凝血、抗血栓、抗纤维化以及抗炎症的作用，由药用蛭类制成的饮片被广泛的应用于治疗心脑血管疾病、慢性肾病(如原发性肾病综合征、肾病综合征高凝血症、狼疮性肾炎)、糖尿病、脏器纤维化、肿瘤、痛风、降血脂以及抗炎症等疾病。在不同的蛭类中提取的具有抗凝血的活性成分主要为蛋白质和各种多肽类大分子物质，但活性成分的分子大小和构象及作用机理却不尽相同。忽略不同蛭类的药用机制，可能会给药用蛭类饮品的临床用药安全及有效性带来一定风险，因此临床药用蛭类种类的基源鉴定尤为重要。随着药用需求导致野生药用蛭类过度捕捉，药用蛭类的价格水涨船高，因此市售药用蛭类也出现了一些非药典中收录的蛭类混伪品。由于混伪品和药典中收录药用蛭类的抗凝血机制的可能不同，这给临床用药的安全及有效性带来一定风险。因此，迫切需求寻找一种快速、准确、高效、经济的鉴别药材中动物源性成分的方法。
3.对药用蛭类的物种鉴定是药物开发和研究有效成分的前提和基础，虽然目前药用蛭类制品广泛应用于临床治疗，但因其化学成分较为复杂，不同药用蛭类物种所含化学成分亦有所差异，不同入药蛭类物种所含的有效成分和药用功效、毒副作用都可能不同；混伪品入药可能无法达到应有的药物疗效，甚者可能致使服用者产生不良反应。严控中药材质量是临床药用安全的重要保障，为了保证药用蛭类的疗效及安全性，因此需要给予入药蛭类物种进行准确的鉴定和细致的划分。
4.目前，药用蛭类的鉴别方法有经典形态鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法，但这些传统的鉴定主要依赖于专业人员经验积累，花费时间较长，易受环境因素影响及样品形态和材料部位的限制，大批量的鉴定存在较大的局限。此外，药用蛭类通常是干燥全体、切片或磨成粉出售，特别地当药材加工切断或粉碎制成中药制剂后，对其进行形态鉴定更加困难，传统的基原、性状、显微和薄层鉴别方法难以满足实际工作需求。
5.近年来，随着分子生物学技术的发展，dna条形码技术已成为物种鉴定的快速有效分析手段。dna条形码(dna barcoding)技术指的是利用生物体内能够代表该物种的一个标准基因dna区域，如线粒体细胞色素c氧化酶亚基i基因(cytochrome c oxidase i,coi)与参考序列比对，以达到快速、可靠和有效鉴定物种的目的。dna条形码技术凭借其相对客观、
高效、准确的鉴定优势在中药和食品鉴定以及微生物检测等领域迅速发展，在物种及中药材基源鉴定和分子溯源等方面的地位越来越重要。虽然基于coi的dna条形码技术在动物源中药鉴定领域发展迅速，但迟迟不能用于药用蛭类的鉴定。其原因，首先是dna条形码通用的coi引物难以特异性扩增药用蛭类的目的片段，表现为公共数据中三种药用蛭类的数据比较少；第二扩增的coi序列长度相对较长(约为658bp)，药材的炮制等过程会使dna分子降解，形成较短的核苷酸链，难以实现炮制品以及含有药用蛭类的中成药、化妆品和保健品中药用蛭类的鉴定。
6.dna微型条形码技术是在dna条形码技术的基础上筛选出长度更短的核苷酸片段作为物种鉴定的目的片段，它所需的序列更短，特异性更高，可有效解决dna降解导致coi序列难以扩增的困难。虽然现有技术中存在对宽体金线蛭和日本医蛭进行特异性pcr鉴定的研究报道，而目前均未涉及鉴定炮制品以及中成药、化妆品和保健品中所含有的药用蛭类，也尚未有准确性高的有效dna条形码鉴定《中华人民共和国药典》2020版收录的尖细金线蛭的方法出现。因此，筛选到适合鉴别炮制品以及含有药用蛭类的中成药、化妆品和保健品中药用蛭类的dna微条形码序列更有应用价值，亟需开发一种可鉴定含药用蛭类的dna分子条形码的技术。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码、dna微条形码及鉴定方法，可以准确、快速对《中国药典》包含的三种药用蛭类物种以及蛭类制品进行鉴定；该方法简便、可靠，可大大提高鉴定效率。
8.为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码，所述dna条形码的标准检测片段的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.3所示；seq id no.1源于宽体金线蛭的coi基因片段，seq id no.2源于尖细金线蛭的coi基因片段，seq id no.3源于日本医蛭的coi基因片段。
9.进一步的，所述宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoif和反向引物zhicoir的核苷酸序列分别如下：
[0010][0011]
本发明还提供了一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna微条形码，其特征在于，所述dna微条形码的检测片段的核苷酸序列如seq id no.4-seq id no.15所示；
[0012]
seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本
医蛭的coi基因片段；
[0013]
seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段；
[0014]
seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段；
[0015]
seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段。
[0016]
进一步的，宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoiminif和反向引物zhicoiminir的核苷酸序列分别如下：
[0017][0018]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi12sminif和反向引物zhi12sminir的核苷酸序列分别如下：
[0019][0020]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi nd1minif和反向引物zhi nd1minir的核苷酸序列分别如下：
[0021][0022]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi16sminif的核苷酸序列为5
’‑
ctgactgtgcaaaggtagca-3’；反向引物zhi16sminir的核苷酸序列为5
’‑
agatcgccccaatcaaaat-3’。
[0023]
本发明还提供了一种利用上述dna条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，包括以下步骤：
[0024]
(1)抽提待检测的样品的dna；
[0025]
(2)以步骤(1)提取的dna为模板，采用权利要求2中所述的引物进行pcr扩增，获得不同的目的基因；
[0026]
(3)将步骤(2)得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；
[0027]
(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，与权利要求1所述的dna条形码标准检测片段seq id no.1-3进行比对；
[0028]
若待测样品的coi序列与seq id no.1的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0029]
若待测样品的coi序列与seq id no.2的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0030]
若待测样品的coi序列与seq id no.3的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭。
[0031]
本发明还提供了一种利用上述dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，包括以下步骤：
[0032]
(1)抽提待检测的样品的dna；
[0033]
(2)对步骤(1)提取的dna采用权利要求4中所述的引物进行pcr扩增，获得不同的目的基因；
[0034]
(3)将步骤(2)得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；
[0035]
(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，再与权利要求3所述的dna微条形码的检测片段seq id no.4-15进行比对；
[0036]
若待测样品的coi序列与seq id no.4的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0037]
若待测样品的coi序列与seq id no.5的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0038]
若待测样品的coi序列与seq id no.6的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0039]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.7的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0040]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.8的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0041]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.9的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0042]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.10的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0043]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.11的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0044]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.12的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0045]
若待测样品的nd1序列与seq id no.13的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0046]
若待测样品的nd1序列与seq id no.14的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0047]
若待测样品的nd1序列与seq id no.15的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭。
[0048]
优选的，步骤(3)中，将步骤(2)得到的目的基因片段与上述dna条形码的标准检测片段seq id no.1-3进行比对，或将步骤(2)得到的目的基因片段与上述的dna微条形码的检测片段seq id no.1-15进行比对，建树并利用bptp或者bgmyc软件进行物种界定。
[0049]
进一步的，步骤(1)中，pcr扩增时设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有所述dna条形码标准检测片段或dna微条形码检测片段的pcr反应产物，阴性对照为无菌水代替pcr反应中的待测样品，其他的试剂按比例正常加入，确保pcr反应体系中不存在污染。
[0050]
优选的，步骤(2)中，所述pcr扩增程序为：首先95℃预变性5分钟；然后95℃变性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。
[0051]
优选的，步骤(1)中，所述待检测的样品包括待鉴定的三种药用蛭类药材的鲜品或干品、全虫或部分虫体、炮制品或粉末状样品，以及各种含有三种药用蛭类的不同药物剂型的中成药、化妆品、保健品；所述三种药用蛭类为：宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭。
[0052]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0053]
(1)本发明提供了一种用于鉴定《中国药典》中收录的三种药用蛭类的dna条形码标准检测基因序列及其所需的特异性的pcr扩增引物；可用于鉴定或辅助鉴定市售蛭类是否为《中国药典》包含的三种药用蛭类；也可以用于鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为对应的药用蛭类物种；也可以用于检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有一种、两种或三种药用蛭类；还可以用于制备用于检测或辅助检测对应三种药用蛭类的试剂
盒；
[0054]
(2)本发明利用扩增获得的coi特异性基因序列分析能实现快速鉴定药用蛭类物种；
[0055]
(3)本发明实现了对三种药用蛭类干体、残缺不全虫体、粉末状样品、药材炮制品、成虫与其伪品的快速鉴定；
[0056]
(4)本发明对各种含有药用蛭类的不同药物剂型的中成药、化妆品、保健品等制品的规范生产具有重要指导意义；
[0057]
(5)本发明提供的pcr扩增程序和反应体系重复性高，经多次试验证实其稳定性好；且该关键技术易于掌握，方法简便、可靠、速度快，大大提高了鉴定效率，便于企业在药材、原料药质量控制等大生产中予以实施。
[0058]
本发明提供了特异性扩增三种药用蛭类目的片段的引物及pcr方法，以三种蛭类dna为模板，能将待测样品目的基因片段高效准确地扩增出来，测序后获得片段通过后期的系统发育分析鉴定药用蛭类。同时本发明具有标本用量少、简便快捷、区分度高等优点，弥补了现有在药用蛭类基源鉴定应用中的不足。该发明有助于准确鉴定三种药用蛭类药材的鲜品或干品、全虫或部分虫体、炮制品或粉末状样品，以及各种含有药用蛭类的不同药物剂型的中成药或化妆品、保健品等中所含的药用蛭类，也有助于药用蛭类种质资源保护、管理和有效开发利用。
附图说明
[0059]
图1是利用本发明实施例四所设计的微型条形码引物对药用蛭类样品进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图；
[0060]
图2是利用本发明实施例四所设计的微型条形码引物对4种市售蛭类药材脉血康胶囊、芪蛭通络胶囊、活血通脉胶囊，龙生蛭胶囊进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图；
[0061]
图3是利用本发明实施例三所设计的dna条形码对药用蛭类样品进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
[0062]
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0063]
实施例一
[0064]
一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码，所述dna条形码的标准检测片段的核苷酸序列如seqid no.1-seqid no.3所示；seqid no.1源于宽体金线蛭(whitmaniapigrawhitman,1886)的coi基因片段，seqid no.2源于尖细金线蛭(whitmaniaacranulata whitman,1886)的coi基因片段，seqid no.3源于日本医蛭(hirudonipponia whitman,1886)的coi基因片段。
[0065]
实施例二
[0066]
一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna微条形码，所述dna微条形码的检测片段的核苷酸序列如seq id no.4-seq id no.15所示；
[0067]
seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段；
[0068]
seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段；
[0069]
seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段；
[0070]
seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段。
[0071]
实施例三
[0072]
一种利用上述dna条形码(seq id no.1-seq id no.3)来鉴定药用蛭类及其制品的方法，包括以下步骤：
[0073]
(1)抽提待检测的样品宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭中总dna；
[0074]
(2)对步骤(1)提取的dna采用以下引物进行pcr扩增，可以扩增获得不同的目的产物；pcr扩增时设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有所述dna条形码标准检测片段的pcr反应产物；阴性对照为无菌水代替pcr反应中的待测龙生水蛭样品，所述pcr扩增程序为：首先95℃预变性5分钟；然后95℃变性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存；
[0075]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoif和反向引物zhicoir的核苷酸序列分别如下：
[0076][0077][0078]
(3)将得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；
[0079]
(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，与权利要求1所述的dna条形码标准检测片段seq id no.1-3进行比对；
[0080]
若待测样品的coi序列与seq id no.1的一致性位点达到95％或以上的，可以确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0081]
若待测样品的coi序列与seq id no.2的一致性位点达到95％或以上的，可以确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0082]
若待测样品的coi序列与seq id no.3的一致性位点达到95％或以上的，可以确定待检测样品的物种为日本医蛭。
[0083]
也可以将新获得序列与dna条形码标准检测片段seq id no.1-3进行比对，建树并利用bptp或者bgmyc等软件进行物种界定。
[0084]
图3是利用本实施例所设计的dna条形码对药用蛭类样品进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图。所用的引物对为zhicoif/zhicoir。图中：泳道m为dna标准分子标量d1500 dna ladder条带，泳道1、2、3、4分别代表样品ls002、ls004、ls0013的扩增片段的大小，分别对应的标本为：日本医蛭、宽体金线蛭、尖细金线蛭，三者都由酒精低温保存。
[0085]
实施例四
[0086]
一种利用上述dna微条形码(seq id no.4-seq id no.15)来鉴定药用蛭类及其制品的方法，包括以下步骤：
[0087]
(1)抽提待检测的样品脉血康胶囊、芪蛭通络胶囊、活血通脉胶囊，龙生蛭胶囊中的总dna；
[0088]
(2)对步骤(1)提取的dna采用权利要求4中所述的引物进行pcr扩增，可以扩增获得不同的目的产物；pcr扩增时设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有所述dna条形码标准检测片段的pcr反应产物；阴性对照为无菌水代替pcr反应中的待测龙生水蛭样品，所述pcr扩增程序为：首先95℃预变性5分钟；然后95℃变性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存；
[0089]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoiminif和反向引物zhicoiminir的核苷酸序列分别如下：
[0090]
[0091][0092]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi12sminif和反向引物zhi12sminir的核苷酸序列分别如下：
[0093][0094]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi nd1minif和反向引物zhi nd1minir的核苷酸序列分别如下：
[0095]
[0096][0097]
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi16sminif的核苷酸序列为seq id no.40：5
’‑
ctgactgtgcaaaggtagca-3’；反向引物zhi16sminir的核苷酸序列为seq id no.41：5
’‑
agatcgccccaatcaaaat-3’。
[0098]
(3)将得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；
[0099]
(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，再与权利要求3所述的dna微条形码的检测片段seq id no.4-15进行比对；
[0100]
若待测样品的coi序列与seq id no.4的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0101]
若待测样品的coi序列与seq id no.5的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0102]
若待测样品的coi序列与seq id no.6的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0103]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.7的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0104]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.8的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0105]
若待测样品的12srdna序列与seq id no.9的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0106]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.10的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0107]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.11的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0108]
若待测样品的16s rdna序列与seq id no.12的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；
[0109]
若待测样品的nd1序列与seq id no.13的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；
[0110]
若待测样品的nd1序列与seq id no.14的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；
[0111]
若待测样品的nd1序列与seq id no.15的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭。
[0112]
也可以将新获得序列与dna条形码标准检测片段seq id no.4-15进行比对，建树并利用bptp或者bgmyc等软件进行物种界定。
[0113]
图1是利用本实施例所设计的微型条形码引物对药用蛭类样品进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图；图中：泳道m为dna标准分子标量d1500 dna ladder条带，其中，ls009为酒精保存的宽体金线蛭标本，yq015为市售宽体金线蛭吊干品，yq016为市售宽体金线蛭炮制品，ls013为酒精保存的尖细金线蛭标本，ls078为酒精保存的日本医蛭标本。泳道1、2、3、4分别代表使用特异性引物对(zhicoiminif/zhi12sminir，zhi12sminif/zhi12sminir，zhi16sminif/zhi16sminir，zhind1minif/zhind1minir.)特异性扩增目的片段产物的大小。
[0114]
图2是利用本实施例所设计的微型条形码引物对4种市售蛭类药材脉血康胶囊、芪蛭通络胶囊、活血通脉胶囊，龙生蛭胶囊进行提取dna、pcr扩增后的凝胶电泳图；图中：泳道m为dna标准分子标量d1500 dna ladder条带，泳道1、2、3、4分别代表特异性引物对(zhicoiminif/zhicoiminir、zhi12sminif/zhi12sminir、zhi16sminif/zhi16sminir、zhind1minif/zhind1minir)特异性扩增目的片段产物的大小。

技术特征：
1.一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码，其特征在于，所述dna条形码的标准检测片段的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.3所示；seq id no.1源于宽体金线蛭的coi基因片段，seq id no.2源于尖细金线蛭的coi基因片段，seq id no.3源于日本医蛭的coi基因片段。2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna条形码，其特征在于，宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoif和反向引物zhicoir的核苷酸序列分别如下：3.一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna微条形码，其特征在于，所述dna微条形码的检测片段的核苷酸序列如seq id no.4-seq id no.15所示；seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段；seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段；seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段；seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15分别源于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段。4.根据权利要求3所述的一种用于鉴定药用蛭类及其制品的dna微条形码，其特征在于，宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的coi基因片段的扩增引物对中，正向引物zhicoiminif和反向引物zhicoiminir的核苷酸序列分别如下：
宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的12srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi12sminif和反向引物zhi12sminir的核苷酸序列分别如下：宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的nd1基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi nd1minif和反向引物zhi nd1minir的核苷酸序列分别如下：宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭的16srdna基因片段的扩增引物对中，正向引物zhi16sminif的核苷酸序列为5
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ctgactgtgcaaaggtagca-3’；反向引物zhi16sminir的核苷酸序列为5
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agatcgccccaatcaaaat-3’。5.一种利用权利要求1所述的dna条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提待检测的样品的dna；(2)以步骤(1)提取的dna为模板，采用权利要求2中所述的引物进行pcr扩增，获得不同的目的基因；(3)将步骤(2)得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，与权利要求1所述的dna条形码标准检测片段seq id no.1-3进行比对；若待测样品的coi序列与seq id no.1的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；若待测样品的coi序列与seq id no.2的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；若待测样品的coi序列与seq id no.3的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭。6.一种利用权利要求3所述的dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抽提待检测的样品的dna；(2)对步骤(1)提取的dna采用权利要求4中所述的引物进行pcr扩增，获得不同的目的基因；(3)将步骤(2)得到的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，并对该特异性目的条带进行双向测序；(4)将测序得到的结果经过序列拼接、除去引物序列校对后，再与权利要求3所述的dna微条形码的检测片段seq id no.4-15进行比对；若待测样品的coi序列与seq id no.4的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；若待测样品的coi序列与seq id no.5的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；若待测样品的coi序列与seq id no.6的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；若待测样品的12srdna序列与seq id no.7的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；若待测样品的12srdna序列与seq id no.8的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；若待测样品的12srdna序列与seq id no.9的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭；若待测样品的16s rdna序列与seq id no.10的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；若待测样品的16s rdna序列与seq id no.11的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；若待测样品的16s rdna序列与seq id no.12的一致性位点达到95％或以上，则确定待
检测样品的物种为日本医蛭；若待测样品的nd1序列与seq id no.13的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为宽体金线蛭；若待测样品的nd1序列与seq id no.14的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为尖细金线蛭；若待测样品的nd1序列与seq id no.15的一致性位点达到95％或以上，则确定待检测样品的物种为日本医蛭。7.根据权利要求5或权利要求6所述的一种利用dna条形码或dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的目的基因片段与权利要求1所述的dna条形码的标准检测片段seq id no.1-3进行比对，或将步骤(2)得到的目的基因片段与权利要求3所述的dna微条形码的检测片段seq id no.1-15进行比对，建树并利用bptp或者bgmyc软件进行物种界定。8.根据权利要求5或权利要求6所述的一种利用dna条形码或dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，步骤(1)中，pcr扩增时设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有所述dna条形码标准检测片段或dna微条形码检测片段的pcr反应产物，阴性对照为无菌水代替pcr反应中的待测样品。9.根据权利要求5或权利要求6所述的一种利用dna条形码或dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增程序为：首先95℃预变性5分钟；然后95℃变性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸45秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。10.根据权利要求5或权利要求6所述的一种利用dna条形码或dna微条形码来鉴定药用蛭类及其制品的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待检测的样品包括待鉴定的三种药用蛭类药材的鲜品或干品、全虫或部分虫体、炮制品或粉末状样品，以及各种含有三种药用蛭类的不同药物剂型的中成药、化妆品、保健品；所述三种药用蛭类为：宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭。

技术总结
本发明公开了一种用于鉴定药用蛭类及其制品的DNA条形码、DNA微条形码及鉴定方法，DNA条形码的标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1-3所示；DNA微条形码的检测片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4-15所示。本发明提供了特异性扩增《中国药典》中收录的三种药用蛭类目的片段的引物及PCR方法，以三种蛭类DNA为模板，将待测样品中蛭类目的基因片段高效准确地扩增出来，测序后获得片段通过后期的系统发育分析鉴定药用蛭类。该发明有助于准确鉴定三种药用蛭类药材的鲜品或干品、全虫或部分虫体、炮制品或粉末状样品，以及各种含有药用蛭类的不同药物剂型的中成药或化妆品、保健品等中所含的药用蛭类。的药用蛭类。的药用蛭类。


技术研发人员：刘英奎 纵艳艳 谢有群 董佳佳 刘永 李冲
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/9/11