DNA微米花型结构复合体、组合产品、制备方法和应用与流程

dna微米花型结构复合体、组合产品、制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物化学领域，具体涉及一种dna微米花型结构复合体、组合产品、制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，其完整性对于维持人体生理稳态，保持体温体液平衡等方面起着至关重要的作用。皮肤大面积损伤或深度损伤很可能导致严重的伤残甚至死亡。例如糖尿病或周围血管疾病之类的慢性疾病导致的伤口愈合受损；急性损伤后，皮肤器官功能丧失，使机体容易受到感染、热失调和体液流失。大面积的皮肤损伤时常难自愈，往往需要医学手段的干预。伤口修复是一个复杂而关键的生物过程，如何快速高质地修复创面是皮肤组织工程的重要问题。
3.目前临床常使用传统单一性伤口敷料给予补救措施。这种敷料主要对伤口外部环境起保护作用，通过吸取渗出液降低感染风险，需要依靠自身皮肤的愈合能力辅助促进伤口修复，其疗效较差。后来逐渐发展为自体皮肤移植，皮肤替代物等复合性伤口敷料，但自体细胞来源有一定的局限性，皮肤替代物也存在生物相容性差和价格高昂等问题。
4.间充质干细胞(mscs)具有自我复制和定向分化的独特性质，在损伤修复、组织再生、抗衰老、血液疾病、神经系统疾病、骨关节病等疾病临床诊疗中具有极大的发展潜力和良好的应用前景，是最具前景的种子细胞之一。首个干细胞治疗药物于2012年在加拿大获批上市，全球及我国基于干细胞的医疗技术和产品呈现加速增长的态势。
5.间充质干细胞是具有促进血管生成、抗凋亡以及免疫调节等功能的来源广泛的祖细胞，能够从脂肪，骨髓等组织中提取而大量获得，同时具有伦理问题少、免疫原性低等优点，被广泛用于干细胞治疗中。实际治疗应用中，需要使用大量高活力的mscs用于发挥治疗功能。而在损伤修复治疗中，面临干细胞的定植黏附能力不足、细胞活力受损、促血管生成效果有限等问题。如何提升干细胞活力，维持和增强其在创口的黏附、血管内皮细胞损伤修复、促进血管生成和伤口愈合，是mscs用于损伤修复领域的重大问题。
6.目前尚未有将核酸材料联合mscs协同治疗的相关报导。


技术实现要素：

7.因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种dna微米花型结构复合体、组合产品、制备方法和应用。本发明利用dna微米花型结构与mscs混合，提升干细胞活力，维持和增强其在创口的黏附、血管内皮细胞损伤修复、促进血管生成和伤口愈合。
8.在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
9.术语“mscs”是指：间充质干细胞。
10.术语“rca”是指：dna微米花滚环扩增。
11.术语“ros”是指：活性氧。
12.术语“vwf”是指：血管性血友病因子。
13.术语“vegf”是指：血管内皮生长因子。
14.术语“vegfr”是指：血管内皮生长因子受体。
15.术语“rgd”是指：有炔丙基甘氨酸修饰的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，是整合素受体靶向肽。
16.术语“pcr”是指：聚合酶链式反应。
17.术语“abts”是指：3-乙基-2-亚硝基亚胺-2,3(2h)苯噻唑。
18.术语“dpph”是指：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼。
19.术语“hgf”是指：肝细胞生长因子。
20.术语“dpiyalswsgma肽”是指：间充质干细胞特异性靶向肽。
21.术语“eplqlkm肽”是指：也称“e7靶向肽”，是骨髓间充质干细胞靶向肽。
22.术语“cu(ii)-tbta复合物”是指：c
30h30
cun
10
o4s，铜(ii)-tbta络合物是用于点击化学偶联反应的催化剂组分。
23.术语“phr”是指：炔丙基甘氨酸。
24.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种dna微米花型结构复合体，所述dna微米花型结构复合体通过dna微米花形结构载体杂交装载功能组分制得；其中：
25.所述功能组分至少包含促进黏附作用的多肽、具有靶向干细胞功能的多肽、具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体；
26.所述dna微米花型结构复合体的尺寸为50nm～5μm，优选为300nm～3μm，更优选为500nm～2μm。
27.根据本发明第一方面的dna微米花型结构复合体，其中，
28.所述促进黏附作用的多肽为促进黏附作用的核酸偶联多肽；和/或
29.所述具有靶向干细胞功能的多肽为具有靶向干细胞功能的核酸偶联多肽。
30.根据本发明第一方面的dna微米花型结构复合体，其中，
31.所述dna微米花形结构载体的结构为长单链dna模版通过扩增形成的核酸纳米花型结构；和/或
32.所述dna微米花形结构载体模板的长度为40nt～400nt，优选为40nt～200nt，更优选为40nt～100nt；
33.优选地，所述扩增为滚环扩增；和/或
34.优选地，所述长单链dna模版的序列为seq id no:21或seq id no:22，最优选为seq id no:21。
35.根据本发明第一方面的dna微米花型结构复合体，其中，
36.所述促进黏附作用的多肽或核酸偶联多肽中的多肽为rgd环肽或rgd线性肽，最优选为rgd环肽；
37.所述具有靶向干细胞功能的多肽或核酸偶联多肽中的多肽为dpiyalswsgma肽或eplqlkm肽，最优选为eplqlkm肽；和/或
38.所述具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体选自以下一种或多种：具有vegfr识别功能的核酸适配体、具有vwf识别功能的核酸适配体、具有cd31识别功能的核酸适配体，优选为具有vegfr识别功能的核酸适配体和/或具有vwf识别功能的核酸适配体。
39.根据本发明第一方面的dna微米花型结构复合体，其中，
40.所述促黏附环肽的序列选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11，优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，更优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3；
41.所述促黏附线性肽的序列选自以下一种或多种：seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14，优选为seq id no:12或seq id no:14，最优选为seq id no:12；
42.所述具有靶向干细胞功能的多肽的序列为seq id no:15或seq id no:16，最优选为seq id no:16；
43.所述具有vegfr识别功能的核酸适配体的序列为seq id no:17或seq id no:18，最优选为seq id no:17；
44.所述有vwf识别功能的核酸适配体的序列为seq id no:19或seq id no:20，最优选为seq id no:19；
45.所述促进黏附作用的核酸偶联多肽的序列为seq id no:25或seq id no:26；和/或
46.具有靶向干细胞功能的核酸偶联多肽的序列为seq id no:27。
47.本发明的第二方面提供了一种用于皮肤修复或再生的组合产品，所述组合产品包括：
48.第一方面的dna微米花型结构复合体；和
49.间充质干细胞；其中，所述间充质干细胞的来源选自以下一种或多种：人脂肪、骨髓、脐带、胎盘、牙髓、肝脏，优选地，所述间充质干细胞通过废弃脂肪组织提取获得；
50.优选地，所述组合产品为试剂盒。
51.本发明的第三方面提供了制备第一方面所述的dna微米花型结构复合体的方法，所述方法包括以下步骤：
52.(1)退火组装后进行酶连反应，得到环化模板；
53.(2)dna微米花扩增；
54.(3)功能基团杂交并纯化，即得所述dna微米花型结构复合体；
55.优选地，所述步骤(1)中还包括：将模板和引物按比例混合，加入缓冲液后加热退火；
56.优选地，所述步骤(2)中还包括：将步骤(1)制备的环化模板在pcr仪中复制组装，得到扩增产物；和/或
57.优选地，所述步骤(3)中还包括：在步骤(2)的扩增产物中加入所述促进黏附作用的多肽和所述具有靶向血管内皮细胞的核酸适配体，加热退火后，再将产物进行纯化，即得所述dna微米花型结构复合体。
58.根据本发明第三方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中：
59.所述模板的序列为seq id no:21或seq id no:22，最优选为seq id no:21；
60.所述引物的序列为seq id no:23；
61.所述模板和所述引物浓度相同，其体积比为1:1～1:5，优选为1:1～1:2，最优选为1:1；
62.所述酶连反应的连接酶为t4连接酶；和/或
63.所述加热的温度为70～100℃，优选为80～100℃，更优选为90～100℃，最优选为95℃。
64.根据本发明第三方面的制备方法，其中，
65.所述步骤(2)中：所述pcr的程序为20～40℃10～25h，优选为25～35℃12～20h，最优选为30℃15h；和/或
66.所述步骤(3)中：所述促进黏附作用的多肽和所述具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体的摩尔浓度比为5:1～1:5，优选为3:1～1:3，更优选为3:1；
67.优选地，当步骤(3)中的多肽为核酸偶联多肽时，所述核酸偶联多肽的制备方法还包括：将叠氮修饰的dna与炔基修饰的多肽通过点击化学反应，得到核酸偶联多肽；其中，所述叠氮修饰的dna的序列更优选为seq id no:23，所述炔基修饰的多肽的序列更优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:12、seq id no:13；
68.更优选地，所述叠氮修饰的dna与所述炔基修饰的多肽的摩尔比为1:2～8，进一步优选为1:3～7，更进一步优选为1:3～5；
69.进一步优选地，所述点击化学反应在避光下进行，所述点击化学反应的温度为20～40℃，优选为20～35℃，更优选为20～30℃；所述点击化学反应的时间为10～30h，优选为10～20h，更优选为12～18h；
70.更进一步优选地，所述点击化学反应在抗坏血酸和二价铜催化剂催化下进行，所述二价铜催化剂优选为cu(ii)-tbta复合物。
71.本发明的第四方面提供了第一方面所述的dna微米花型结构复合体或第二方面所述的组合产品在制备用于修复或再生皮肤组织的药物或医疗产品中的应用；
72.优选地，所述修复皮肤组织选自以下一种或多种：修复或再生创面、血管闭合、糖尿病相关的皮肤损伤、烧伤后的创面，更选自以下一种或多种：修复或再生创面、血管闭合、糖尿病相关的皮肤损伤；和/或
73.优选地，所述医疗产品选自以下一种或多种：敷料、水凝胶、微针、贴片、补片。
74.本发明的序列如seq id no.1-27所示：
75.seq id no:1：c(rgdfk)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状，因此，seq id no.1以说明书此处记载的序列信息为准)。
76.seq id no:2:c(rgdfc)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.2以说明书此处记载的序列信息为准)。
77.seq id no:3:c(radfc)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.3以说明书此处记载的序列信息为准)。
78.seq id no:4:c(rgdfe)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.4以说明书此处记载的序列信息为准)。
79.seq id no:5:c(radfk)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.5以说明书此处记载的序列信息为准)。
80.seq id no:6:c(rgdfv)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.6以说明书此处记载的序列信息为准)。
81.seq id no:7:c(radfv)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环
状和phr，因此，seq id no.7以说明书此处记载的序列信息为准)。
82.seq id no:8:c(rgdyc)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.8以说明书此处记载的序列信息为准)。
83.seq id no:9:c(rgefk)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.9以说明书此处记载的序列信息为准)。
84.seq id no:10:c(rgdye)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.10以说明书此处记载的序列信息为准)。
85.seq id no:11:c(radyk)gg-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现环状和phr，因此，seq id no.11以说明书此处记载的序列信息为准)。
86.seq id no:12:rgd-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现phr，因此，seq id no.12以说明书此处记载的序列信息为准)。
87.seq id no:13:rgds-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现phr，因此，seq id no.13以说明书此处记载的序列信息为准)。
88.seq id no:14:rgdfk-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现phr，因此，seq id no.14以说明书此处记载的序列信息为准)。
89.seq id no:15:dpiyalswsgma-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现phr，因此，seq id no.15以说明书此处记载的序列信息为准)。
90.seq id no:16:eplqlkm-phr(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现phr，因此，seq id no.16以说明书此处记载的序列信息为准)。
91.seq id no:17:5
’‑
gtcgtgtttgttgttgttttcatttttgcggccc-3’(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现5
’‑
和-3’，因此，seq id no.17以说明书此处记载的序列信息为准)。
92.seq id no:18:5
’‑
gctgataggatgggttgtaggtctagggggggg cc-3’(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现5
’‑
和-3’，因此，seq id no.18以说明书此处记载的序列信息为准)。
93.seq id no:19:atccctatagtgagtcgtattaggcgtgcagtgccg aaggcctggcggtgcctccgtcacgcccgcgaagcg。
94.seq id no:20:tgagactccccaactttcgccaacaaccgaggga gtctca。
95.seq id no:21:5
’‑
p-tagtgagtcgtattaatatatgtgtactaggccg aaa atataatcccta(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现5
’‑
和-3’，因此，seq id no.21以说明书此处记载的序列信息为准)。
96.seq id no:22:5
’‑
p-atagtgagtcgtattaatatatgccctgacttc aacgtcacattctgtgacagctcaactatcagggcaatataaaggagg aaggaggtttttttttttttttatccct(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现5
’‑
，因此，seq id no.22以说明书此处记载的序列信息为准)。
97.seq id no:23:taatacgactcactatagggat。
98.seq id no:24:tgtgtactaggccgaaaa-3`azide(n3)(由于本技术所附序列表，其标准格式无法体现-3`azide(n3)，因此，seq id no.24以说明书此处记载的序列信息为准)。
99.seq id no:25:seq id no:24与seq id no:1的偶联产物c(rgdfk)gg-phr-ssdna，
其中，ssdna的序列为3
’‑
aaaagccggatcatgtgt-5’。
100.seq id no:26:seq id no:24与seq id no:12的偶联产物rgd-phr-ssdna，其中，ssdna的序列为3
’‑
aaaagccggatcatgtgt-5’。
101.seq id no:27:seq id no:24与seq id no:16的偶联产物eplqlkm-phr-ssdna，其中，ssdna的序列为3
’‑
aaaagccggatcatgtgt-5’。
102.根据本发明的一个具体实施方式，本发明提供了一种基于dna微米花型材料的干细胞治疗药物。
103.材料：这种基于dna微米花型材料的干细胞治疗药物由两部分组成：干细胞辅助功能的dna微米花型结构和人脂肪来源的间充质干细胞。
104.干细胞辅助功能的dna微米花型结构：核心结构为dna微米花形结构，尺寸为500nm-2000nm；
105.rgd环肽-dna复合物由以下制备方法制备得到：
106.(a)将叠氮修饰的单链dna(序列如seq id no:24所示)和炔基修饰的具有黏附功能的多肽(seq id no:1、seq id no:2、seq id no:12、seq id no:13)分别溶解于水和pbs缓冲液中，配置得到单链dna母液和具有黏附功能的多肽母液；将抗坏血酸溶解于水中，配置得到抗坏血酸母液；
107.其中，dna母液的浓度为100μm、多肽母液的浓度为200μm、抗坏血酸的浓度为10mm、二价铜催化剂cu(ii)-tbta复合物的浓度为10mm；
108.(b)将步骤(a)得到的dna母液、多肽母液、抗坏血酸母液、cu(ii)-tbta复合物和dmso混合，于30℃下避光反应20h后；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到所述多肽-dna复合物，最后使用紫外分光光度计定量。
109.以dna微米花形结构作为载体，定量杂交装载多种功能组分——促进黏附作用的多肽或核酸偶联多肽(例如rgd环肽，rgd线性肽)，靶向间充质干细胞的多肽(如e7肽)，靶向内皮细胞的核酸适配体(如具有vegfr识别功能或vwf识别功能)。其结构制备过程如下：
110.(1)退火组装
111.将模板template-50以及引物primer-22等比例混合于40μl体系中，其中初始浓度均为10μm的模板和引物各2.8μl，再加入10
×
t4 buffer 4μl以及去离子水29.4μl。95℃加热5min，再缓慢退火至4℃，每1℃为一个梯度降温，每个梯度停留时间均为2min。
112.(2)酶连反应
113.退火组装结束后，在pcr管加入1μl t4连接酶(20000units 50μl)进行酶连反应，条件为24℃酶连12h，之后65℃10min酶失活，之后缓慢降温至4℃。每2℃为一个梯度，每个梯度停留时间均为2min。
114.(3)dna微米花扩增
115.将10
×
phi29 buffer，dntp，10
×
bsa，phi29酶取出，置于冰盒上待用。将去离子水19.6μl，10
×
phi29 buffer 6μl，dntp 3μl，10
×
bsa 0.6μl，以及酶连后模板25.8μl加入到管中，最后加入phi29酶5μl。混匀后放入pcr仪中复制组装，pcr程序为30℃15h，之后65℃10min使酶失活，之后每隔2min降低2℃，4℃保存。
116.(4)功能基团杂交
117.每管加入浓度均为200μm的c(rgdfk)gg-phr-ssdna和vwf aptamer各4.5μl以及1μ
l 10
×
hybridization buffer(200mm tris-hcl,3m nacl,50mm mgcl2,ph 7.5)，混匀后放入pcr仪中95℃加热5min，再缓慢退火至4℃备用。
118.(5)纯化
119.将杂交功能基团后的产物转移至离心管中，加入200μl的1
×
hybridization buffer溶液，震荡混匀。5000r，5min离心，重复洗一次。最后吸弃上清，将离心管底部产物用60μl的1
×
hybridization buffer混匀，超声30s，取出观察，若离心管里有絮状物则继续超声30s，待沉淀全部分散后制样。
120.人脂肪来源的间充质干细胞：人脂肪来源的间充质干细胞(hamscs)是通过接受吸脂手术患者的废弃脂肪组织而提取获得，能够进行传代扩增和冻存保种。细胞分离提取过程如下：
121.(1)清洗
122.抽脂脂肪组织分装20ml于50ml离心管中，加入d-hank’s溶液至50ml,离心：800rpm,3分钟，清洗2遍。
123.(2)消化
124.按照脂肪组织：胶原酶p＝3:1的比例加入配好过滤的0.2％胶原酶p,封口膜封住50ml离心管，37℃摇床消化20-30分钟，至均一无块状物即可。
125.(3)过滤
126.消化产物加入适量d-hank’s溶液稀释，用100μm筛网过滤，除去未消化的部分组织等物质。
127.(4)离心清洗
128.向过滤好的脂肪组织中加入适量d-hank’s溶液，离心:1500rpm,10分钟。重复该步骤2次，洗去血细胞和胶原酶p,清洗时注意更管新的离心管，减少油状物质残留。
129.(5)接种
130.按照约每10ml-20ml左右脂肪(初始体积)接种一个t75的密度接种细胞，于37℃，5％ co2恒温培养箱中培养。24-48小时后更换新鲜培养基。
131.(6)重贴
132.24-48小时后(换液时)收集上清，离心：1200rpm,5分钟，按照每2瓶细胞重贴1瓶的密度接种。
133.本发明的dna复合物提供了多种分子有效载荷，包括肽和适配体，并在体外和体内引发了强大的抗氧化作用和增强的msc功能。生物相容性纳/微米材料与干细胞的结合有助于最大限度地提高mscs调节创伤环境的再生效率。dna材料联合msc治疗在健康和糖尿病小鼠中显示出快速和稳健的伤口闭合和血管形成。
134.部分现有技术提供的降低皮肤衰老和提高皮肤损伤修复的生物制剂，其白茅素可以促进表皮干细胞的增殖，降低表皮干细胞的衰老，但是不能够增强干细胞分泌vegf的情况，同时也不能够挽救干细胞在氧化应激条件下的细胞活力。还有部分现有技术通过将pge2和间充质干细胞混合培养，从而增强间充质干细胞的功能，促进间充质干细胞向损伤部位的迁移，能够有效减轻各种肺损伤，但是干细胞需要预先经过处理，培养周期较长，不能够满足实际应用的需求。
135.本发明的dna微米花型结构复合体及组合产品可以具有但不限于以下有益效果：
136.1.本发明利用自组装dna复合材料，帮助mscs在皮肤伤口中的粘附和保留，并加速伤口闭合和再上皮化。dna微米花扩增(rca)衍生的dna复合材料由大量dna序列组成，可作为活性氧(ros)清除剂，保护加载的细胞免受氧化刺激。功能化的dna复合材料携带crgd肽和血管性血友病因子(vwf)适配体，实现对干细胞和受损血管内皮细胞的协同识别和粘附。值得注意的是，dna复合附着的mscs显示出增强的细胞活力，增殖和改善生长因子的分泌，以增强伤口愈合的潜力。这些dna结构辅助干细胞还增强了体外和体内的血管生成，促进了血管内皮生长因子(v egf)的分泌和细胞迁移。
137.2.本发明的一种使用dna复合物赋能mscs用于皮肤创伤治疗的策略。这些预先设计的dna复合物提供了多种分子有效载荷，包括肽和适配体，并在体外和体内引发了强大的抗氧化作用和增强的msc功能。生物相容性纳米/微米材料与干细胞的结合有助于避免副作用，并最大限度地提高mscs调节创伤环境的再生效率。随着一系列生长因子的分泌得到改善，促进了血管内皮细胞的增殖、迁移和管形成，dna复合mscs治疗在免疫缺陷鼠中显示出快速且稳定的伤口闭合和血管形成功能。
138.3.本发明的基于dna自组装技术和干细胞治疗的方法能够有效地优化伤口修复和再生。除此之外，本发明在应用治疗时，两组分可以现用现混，给药方式为在伤口表面滴加，具有良好的顺应性和安全性。基于此，所开发的利用生物相容性生物材料调控干细胞功能的策略是治疗其他类型皮肤和组织创伤的有力工具。
附图说明
139.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
140.图1示出了核酸微米花型结构的制备流程及相应应用。
141.图2示出了dna微米花型结构复合体的表征；其中，图2a示出了微米花型结构在扫描电子显微镜(sem)镜下观察到的形貌图；图2b示出了微米花型结构在透射电子显微镜(tem)镜下观察到的形貌图。
142.图3示出了制备基于dna微米花型结构复合体的组合产品使用流程图。
143.图4示出了dna微米花型结构复合体的抗氧化应激功能；图4a示出了不同浓度的核酸微米花型结构的dpph自由基清除效率；图4b示出了不同浓度的核酸微米花型结构的羟基自由基清除效率；图4c示出了不同浓度的核酸微米花型结构的abts自由基清除效率。
144.图5示出了dna微米花型结构复合体的促血管生成功能；其中，图5a示出了干细胞的vegf基因在rna水平上的表达升高；图5b示出了干细胞的hgf基因在rna水平上的表达升高，且p值均小于0.01。
145.图6示出了核酸微米花和干细胞的组合产品对裸鼠全层皮肤损伤的修复具有良好的恢复效果(n＝7)。
146.图7示出了核酸微米花和干细胞的组合产品对裸鼠全层皮肤损伤的修复在不同天数下，伤口恢复情况的数据分析。
具体实施方式
147.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
148.本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
149.以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
150.试剂：
151.核苷酸序列seq id no:19、seq id no:21—seq id no:24，均购自生工生物工程(上海)有限公司；多肽seq id no:1和seq id no:12购自上海淘普生物科技有限公司；t4连接酶，phi29酶及10
×
reaction buffer，均购自new england biolabs公司；sybr qpcr supermix plus，购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；8mm快速活检取样器购自深圳华阳生物技术有限公司。
152.仪器：
153.热循环pcr仪，购自美国伯乐生物科技公司，型号t100；紫外可见分光光度仪，购自日本岛津公司，型号uv-2450；酶标仪，购自美国pe公司，型号enspire；超微量分光光度计，购自赛默飞世尔科技公司，型号nanodrop one；定量pcr系统，购自杭州朗基科学仪器有限公司，型号q2000。
154.本发明以下实施例中所使用的序列如下所示：
155.seq id no:1：c(rgdfk)-gg-phr(crgd多肽-环肽)。
156.seq id no:19：atccctatagtgagtcgtattaggcgtgcagtgccg aaggcctggcggtgcctccgtcacgcccgcgaagcg(vwf aptamer)。
157.seq id no:21：5
’‑
p-tagtgagtcgtattaatatatgtgtactaggccg aaa atataatcccta(模板链template-50)。
158.seq id no:23：taatacgactcactatagggat(primer-22)。
159.seq id no:24：tgtgtactaggccgaaaa-3`azide(n3)(ssdna)
160.seq id no:25：seq id no:24与seq id no:1的偶联产物(c(rgdfk)gg-phr-ssdna)。
161.seq id no:26:seq id no:24与seq id no:12的偶联产物rgd-phr-ssdna，其中，ssdna的序列为3
’‑
aaaagccggatcatgtgt-5’。
162.seq id no:27:seq id no:24与seq id no:16的偶联产物eplqlkm-phr-ssdna，其中，ssdna的序列为3
’‑
aaaagccggatcatgtgt-5’。
163.实施例1
164.本实施例用来说明dna微米花型结构复合体的制备方法。
165.dna微米花型结构复合体：核心结构为dna微米花形结构，尺寸为500nm-2000nm；本实施例所制备的dna微米花型结构复合体的尺寸为1100nm。
166.以dna微米花形结构作为载，再按需求定量杂交装载多种功能组分——促进黏附作用的核酸偶联多肽(例如rgd环肽，rgd线性肽)，靶向间充质干细胞的多肽(例如e7肽)，靶向内皮细胞的核酸适配体(如具有vegfr识别功能或vwf识别功能)。其结构制备过程如下：
167.1、制备dna微米花形结构载体：
168.(1)退火组装
169.将模板template-50(序列如seq id no:21所示)以及引物primer-22(序列如seq id no:23所示)等浓度，按体积比为1:1混合于40μl体系中，其中初始浓度均为10μm的模板和引物各2.8μl，再加入10
×
t4 buffer4μl以及去离子水29.4μl。95℃加热5min，再缓慢退火至4℃，每1℃为一个梯度降温，每个梯度停留时间均为2min。
170.(2)酶连反应
171.退火组装结束后，在pcr管加入1μl t4连接酶(20000units 50μl)进行酶连反应，条件为24℃酶连12h，之后65℃10min酶失活，之后缓慢降温至4℃。每2℃为一个梯度，每个梯度停留时间均为2min。
172.(3)dna微米花扩增
173.将10
×
phi29 buffer，dntp，10
×
bsa，phi29酶取出，置于冰盒上待用。将去离子水19.6μl，10
×
phi29 buffer 6μl，dntp 3μl，10
×
bsa 0.6μl，以及酶连后模板25.8μl加入到管中，最后加入phi29酶5μl。混匀后放入pcr仪中复制组装，pcr程序为30℃15h，之后65℃10min使酶失活，之后每隔2min降低2℃，4℃保存，即得所述dna微米花形结构载体，如图2所示，图2示出了dna微米花型结构复合体的表征；其中，图2a示出了微米花型结构在扫描电子显微镜(sem)镜下观察到的形貌图；图2b示出了微米花型结构在透射电子显微镜(tem)镜下观察到的形貌图。
174.2、功能基团杂交：
175.(4)制备c(rgdfk)gg-phr-ssdna：
176.(a)将叠氮修饰的单链dna(序列如seq id no:24所示)和炔基修饰的具有黏附功能的多肽(炔基修饰的具有黏附功能的多肽为seq id no:1—seq id no:16，本技术所使用的多肽序列如seq id no:1所示)分别溶解于水和pbs缓冲液中，配置得到单链dna母液和具有黏附功能的多肽母液；将抗坏血酸溶解于水中，配置得到抗坏血酸母液；其中，dna母液的浓度为100μm、多肽母液的浓度为200μm、抗坏血酸的浓度为10mm、二价铜催化剂cu(ii)-tbta复合物的浓度为10mm。
177.(b)将步骤(a)得到的dna母液、多肽母液、抗坏血酸母液、cu(ii)-tbta复合物和dmso混合，于30℃下避光反应20h后；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到所述多肽-dna复合物，最后使用紫外分光光度计定量。
178.(5)杂交：
179.每管加入浓度均为200μm的c(rgdfk)gg-phr-ssdna(序列如seq id no:25所示)和vwf aptamer(序列如seq id no:19所示)各4.5μl以及1μl 10
×
hybridization buffer(200mm tris-hcl,3m nacl,50mm mgcl2,ph7.5)，混匀后放入pcr仪中95℃加热5min，再缓慢退火至4℃备用。
180.(6)纯化
181.将杂交功能基团后的产物转移至离心管中，加入200μl的1
×
hybridization buffer溶液，震荡混匀。5000r，5min离心，重复洗一次。最后吸弃上清，将离心管底部产物用60μl的1
×
hybridization buffer混匀，超声30s，取出观察，若离心管里有絮状物则继续超声30s，待沉淀全部分散后制样，即得所述dna微米花型结构复合体。
182.实施例2～5
183.本实施例用来说明dna微米花型结构复合体的制备方法。
184.实施例2-4的制备方法与实施例1相同，不同之处如表1所示：
185.表1实施例2-5制备的dna微米花型结构复合体
[0186][0187][0188]
实施例6
[0189]
本实施例用来说明间充质干细胞的制备方法。
[0190]
人脂肪来源的间充质干细胞：人脂肪来源的间充质干细胞(hamscs)是通过接受吸脂手术患者的废弃脂肪组织而提取获得，能够进行传代扩增和冻存保种。细胞分离提取过程如下：
[0191]
(1)清洗
[0192]
抽脂脂肪组织分装20ml于50ml离心管中，加入d-hank’s溶液至50ml,离心：800rpm,3分钟，清洗2遍。
[0193]
(2)消化
[0194]
按照脂肪组织：胶原酶p＝3:1的比例加入配好过滤的0.2％胶原酶p,封口膜封住50ml离心管，37℃摇床消化25分钟，至均一无块状物即可。
[0195]
(3)过滤
[0196]
消化产物加入适量d-hank’s溶液稀释，用100μm筛网过滤，除去未消化的部分组织等物质。
[0197]
(4)离心清洗
[0198]
向过滤好的脂肪组织中加入适量d-hank’s溶液，离心:1500rpm,10分钟。重复该步骤2次，洗去血细胞和胶原酶p,清洗时注意更管新的离心管，减少油状物质残留。
[0199]
(5)接种
[0200]
按照每15ml脂肪(初始体积)接种一个t75的密度接种细胞，于37℃，5％ co2恒温培养箱中培养。36小时后更换新鲜培养基。
[0201]
(6)重贴
[0202]
36小时后(换液时)收集上清，离心：1200rpm,5分钟，按照每2瓶细胞重贴1瓶的密度接种。
[0203]
实施例7
[0204]
本实施例用来说明dna微米花型结构复合体的表征。
[0205]
将实施例1制备的dna微米花型结构复合体分别制样后，置于扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察组装后核酸微米花型结构的形貌大小。
[0206]
图2示出了dna微米花型结构复合体的表征；其中，图2a示出了微米花型结构在扫描电子显微镜(sem)镜下观察到的形貌图；图2b示出了微米花型结构在透射电子显微镜(tem)镜下观察到的形貌图。
[0207]
由图2可知，已成功制备了dna微米花型结构复合体。
[0208]
实施例1-5制备的dna微米花型结构复合体，其抗氧化功能均是源于核酸碱基的抗氧化特性。由于各复合体的化学成分均以核酸结构为主，因此仅以示例性地选择实施例1制备的dna微米花型结构复合体进行以下试验，但是本领域技术人员应当理解试验例1-3的试验结果同样适用于实施例2-5。
[0209]
试验例1
[0210]
本实施例用来说明dna微米花型结构复合体的抗氧化应激功能。
[0211]
使用abts，dpph，超氧阴离子检测试剂盒检测10ng/μl，25ng/μl,50ng/μl浓度dna抗氧化应激水平，结果如图4所示。
[0212]
图4示出了dna微米花型结构复合体的抗氧化应激功能；图4a示出了不同浓度的核酸微米花型结构的dpph自由基清除效率；图4b示出了不同浓度的核酸微米花型结构的羟基自由基清除效率；图4c示出了不同浓度的核酸微米花型结构的abts自由基清除效率。
[0213]
由图4可知，dna微米花型结构复合体具有抗氧化应激功能。
[0214]
试验例2
[0215]
本实施例用来说明dna微米花型结构复合体的促血管生成功能。
[0216]
将20ng/μl rca与mscs共孵育24小时后收集rna检测vegf和hgf基因表达水平。
[0217]
图5示出了dna微米花型结构复合体的促血管生成功能；其中，图5a示出了干细胞的vegf基因在rna水平上的表达升高；图5b示出了干细胞的hgf基因在rna水平上的表达升高，且p值均小于0.01。
[0218]
由图5可知，dna微米花型结构复合体能够在rna水平上增强间充质干细胞vegf基因和hgf基因的上调。
[0219]
试验例3
[0220]
本实施例用来说明皮肤损伤模型建立及治疗。
[0221]
1、建立：使用1.25％三溴乙醇麻醉裸鼠，用碘伏消毒皮肤表面，使用皮肤活检取样器，在背部中心做一个8mm全层皮肤切口损伤建模。
[0222]
2、治疗：将15μg dna微米花直接滴加在损伤表面。(再滴加20μl浓度为8
×
107msc细胞悬液)静置20分钟后，取透明敷贴贴到损伤部位。
[0223]
图6示出了核酸微米花和干细胞的组合产品对裸鼠全层皮肤损伤的修复具有良好的恢复效果。由图7的数据分析(n＝7)可知，在损伤后的第三天，组合产品分别与材料组和细胞组相比，伤口恢复差别明显，p值均小于0.01。在第六，九和第十二天，联合治疗组和其他组的伤口恢复对比，均有一定的差别。总得来看，组合产品分别与材料组和细胞组相比，都有更好的治疗效果。
[0224]
用于损伤修复治疗时，这种基于dna微米花型材料的干细胞治疗药物操作十分简
便，仅需将具有干细胞辅助功能的dna微米花型结构直接滴加在伤口表面，再滴加mscs悬液，贴上透明敷贴即可。单次滴加治疗一次，模型小鼠损伤完全愈合，较对照组(盐水处理组、单独mscs处理组、单独dna微米花型结构处理组、商品化敷贴组)恢复更快、疤痕组织更少、具有更好的损伤修复效果。
[0225]
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

技术特征：
1.一种dna微米花型结构复合体，其特征在于，所述dna微米花型结构复合体通过dna微米花形结构载体杂交装载功能组分制得；其中：所述功能组分至少包含促进黏附作用的多肽、具有靶向干细胞功能的多肽、具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体；所述dna微米花型结构复合体的尺寸为50nm～5μm，优选为300nm～3μm，更优选为500nm～2μm。2.根据权利要求1所述的dna微米花型结构复合体，其特征在于，所述促进黏附作用的多肽为促进黏附作用的核酸偶联多肽；和/或所述具有靶向干细胞功能的多肽为具有靶向干细胞功能的核酸偶联多肽。3.根据权利要求1或2所述的dna微米花型结构复合体，其特征在于：所述dna微米花形结构载体的结构为长单链dna模版通过扩增形成的核酸纳米花型结构；和/或所述dna微米花形结构载体模板的长度为40nt～400nt，优选为40nt～200nt，更优选为40nt～100nt；优选地，所述扩增为滚环扩增；和/或优选地，所述长单链dna模版的序列为seq id no:21或seq id no:22，最优选为seq id no:21。4.根据权利要求1至3中任一项所述的dna微米花型结构复合体，其特征在于：所述促进黏附作用的多肽或核酸偶联多肽中的多肽为rgd环肽或rgd线性肽，最优选为rgd环肽；所述具有靶向干细胞功能的多肽或核酸偶联多肽中的多肽为dpiyalswsgma肽或eplqlkm肽，最优选为eplqlkm肽；和/或所述具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体选自以下一种或多种：具有vegfr识别功能的核酸适配体、具有vwf识别功能的核酸适配体、具有cd31识别功能的核酸适配体，优选为具有vegfr识别功能的核酸适配体和/或具有vwf识别功能的核酸适配体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的dna微米花型结构复合体，其特征在于：所述促黏附环肽的序列选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11，优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，更优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3；所述促黏附线性肽的序列选自以下一种或多种：seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14，优选为seq id no:12或seq id no:14，最优选为seq id no:12；所述具有靶向干细胞功能的多肽的序列为seq id no:15或seq id no:16，最优选为seq id no:16；所述具有vegfr识别功能的核酸适配体的序列为seq id no:17或seq id no:18，最优选为seq id no:17；所述有vwf识别功能的核酸适配体的序列为seq id no:19或seq id no:20，最优选为seq id no:19；
所述促进黏附作用的核酸偶联多肽的序列为seq id no:25或seq id no:26；和/或具有靶向干细胞功能的核酸偶联多肽的序列为seq id no:27。6.一种用于皮肤修复或再生的组合产品，其特征在于，所述组合产品包括：权利要求1至5中任一项所述的dna微米花型结构复合体；和间充质干细胞；其中，所述间充质干细胞的来源选自以下一种或多种：人脂肪、骨髓、脐带、胎盘、牙髓、肝脏，优选地，所述间充质干细胞通过废弃脂肪组织提取获得；优选地，所述组合产品为试剂盒。7.制备权利要求1至5中任一项所述的dna微米花型结构复合体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)退火组装后进行酶连反应，得到环化模板；(2)dna微米花扩增；(3)功能基团杂交并纯化，即得所述dna微米花型结构复合体；优选地，所述步骤(1)中还包括：将模板和引物按比例混合，加入缓冲液后加热退火；优选地，所述步骤(2)中还包括：将步骤(1)制备的环化模板在pcr仪中复制组装，得到扩增产物；和/或优选地，所述步骤(3)中还包括：在步骤(2)的扩增产物中加入所述促进黏附作用的多肽和所述具有靶向血管内皮细胞的核酸适配体，加热退火后，再将产物进行纯化，即得所述dna微米花型结构复合体。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：所述模板的序列为seq id no:21或seq id no:22，最优选为seq id no:21；所述引物的序列为seq id no:23；所述模板和所述引物浓度相同，其体积比为1:1～1:5，优选为1:1～1:2，最优选为1:1；所述酶连反应的连接酶为t4连接酶；和/或所述加热的温度为70～100℃，优选为80～100℃，更优选为90～100℃，最优选为95℃。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中：所述pcr的程序为20～40℃10～25h，优选为25～35℃12～20h，最优选为30℃15h；和/或所述步骤(3)中：所述促进黏附作用的多肽和所述具有靶向内皮细胞功能的核酸适配体的摩尔浓度比为5:1～1:5，优选为3:1～1:3，更优选为3:1；优选地，当步骤(3)中的多肽为核酸偶联多肽时，所述核酸偶联多肽的制备方法还包括：将叠氮修饰的dna与炔基修饰的多肽通过点击化学反应，得到核酸偶联多肽；其中，所述叠氮修饰的dna的序列更优选为seq id no:24，所述炔基修饰的多肽的序列更优选选自以下一种或多种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:12、seq id no:13；更优选地，所述叠氮修饰的dna与所述炔基修饰的多肽的摩尔比为1:2～8，进一步优选为1:3～7，更进一步优选为1:3～5；进一步优选地，所述点击化学反应在避光下进行，所述点击化学反应的温度为20～40℃，优选为20～35℃，更优选为20～30℃；所述点击化学反应的时间为10～30h，优选为10～20h，更优选为12～18h；更进一步优选地，所述点击化学反应在抗坏血酸和二价铜催化剂催化下进行，所述二
价铜催化剂优选为cu(ii)-tbta复合物。10.权利要求1至5中任一项所述的dna微米花型结构复合体或权利要求6所述的组合产品在制备用于修复或再生皮肤组织的药物或医疗产品中的应用；优选地，所述修复皮肤组织选自以下一种或多种：修复或再生创面、血管闭合、糖尿病相关的皮肤损伤、烧伤后的创面，更选自以下一种或多种：修复或再生创面、血管闭合、糖尿病相关的皮肤损伤；和/或优选地，所述医疗产品选自以下一种或多种：敷料、水凝胶、微针、贴片、补片。

技术总结
本发明提供了一种DNA微米花型结构复合体、组合产品、制备方法和应用。所述DNA微米花型结构复合体以DNA微米花形结构载体为材料，杂交装载功能组分而得。本发明利用DNA微米花型结构与MSCs混合，提升干细胞活力，维持和增强其在创口的黏附、血管内皮细胞损伤修复、促进血管生成和伤口愈合。进血管生成和伤口愈合。进血管生成和伤口愈合。


技术研发人员：丁宝全 赵春华 李卓婷 蒋乔 李静 尚颖旭
受保护的技术使用者：国家纳米科学中心
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/9/11