一种负载硼替佐米的凝胶支架及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种负载硼替佐米的凝胶支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性骨肿瘤发展迅速且死亡率高，总体生存率低，预后仍不理想。骨骼具有易被其他癌症侵袭的特性，比如发病率居首的乳腺癌的骨转移，且随着癌症患者生存期延长，骨转移的发生率逐步增加。治疗恶性骨肿瘤，仍然是一个严峻的挑战。目前，针对恶性骨肿瘤传统的治疗方法是手术切除。但这势必会导致肿瘤切除部位出现大面积骨缺损，也不可避免地在周围残留一些肿瘤细胞，若不及时消灭这些残留的肿瘤细胞，将会增加肿瘤的复发和转移的风险。
3.过去，针对骨缺损部位残留的肿瘤细胞，一般采用化疗、放疗进行治疗，但是长时间的使用抗癌药物通常会使肿瘤产生多药耐药性，且肿瘤环境中低氧含量肿瘤细胞对电离辐射的不敏感性也使得放疗疗效大打折扣，而且放疗对人体也存在较大的毒性。因此，需要发展出一些新型的便捷有效的治疗手段或者来抑制肿瘤细胞的同时促进骨组织再生。
[0004][0005]
硼替佐米(bortezomib)，cas号：179324-69-7，结构式如式ⅰ所示。硼替佐米是哺乳动物细胞中26s蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂。体外试验证明硼替佐米对多种类型的癌细胞具有细胞毒性。临床前肿瘤模型体内试验证明硼替佐米能够延迟包括多发性骨髓瘤在内的肿瘤生长。目前硼替佐米一般使用注射剂，用于多发性骨髓瘤患者的治疗。
[0006]
公开号为cn109432505a的中国发明申请公开了一种3d打印构建的多孔级复合医用凝胶支架及其制备方法，按照质量百分比组成，由以下原料组成：羟基磷灰石7-30％，载药的介孔二氧化硅0.7-2％，葡萄糖酸内酯11-16％，余量为海藻酸钠。制备方法包括以下步骤：(1)将羟基磷灰石(hap)分散到去离子水中，常温下搅拌分散均匀后，加入海藻酸钠，常温下进行搅拌反应，得到预交联溶液；(2)向步骤(1)中的预交联溶液中加入载药的介孔二氧化硅和葡萄糖酸内酯，搅拌反应后，得到轻度交联的水凝胶溶液；(3)将步骤(2)中轻度交
联的水凝胶溶液，导入到3d打印机的注射器中，按照设定的模型开始打印，打印完毕后，得到初级多孔级复合医用凝胶支架；然后将初级多孔级复合医用凝胶支架放入到氯化钙溶液中进行交联，交联完毕后，进行冷冻干燥处理，即得多孔级复合医用凝胶支架。
[0007]
公开号为cn109793920a的中国发明申请公开了一种含聚己内酯微球的胶原蛋白敷料，包括水和每100ml水中含有的以下原料：胶原蛋白0.5-4g、羟基磷灰石1-15g、pcl载药微球0.5-3g、葡萄糖酸内酯2-5g和海藻酸钠3-8g。本发明将胶原蛋白与海藻酸钠溶液结合，通过简单的复合凝胶途径制备胶原蛋白/海藻酸钠水凝胶材料，可以获得良好生物活性、相容性以及可药物装载和缓释的医学材料；并且添加了负载了药物的pcl微球，可以起到应力分散的作用，提高胶原蛋白敷料的力学性能；另外药物的负载，可实现药物的缓慢释放，可防止3d打印的胶原蛋白敷料被细菌污染，起到抗菌杀菌的作用，有利于创口修复与愈合。


技术实现要素：

[0008]
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种负载硼替佐米的凝胶支架及其制备方法和应用。
[0009]
一种负载硼替佐米的凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
(1)将海藻酸盐和羟基磷灰石分散在水中获得第一混合体系；
[0011]
(2)将硼替佐米加入所述第一混合液中并混匀获得第二混合体系；
[0012]
(3)将葡萄糖酸内酯加入所述第二混合体系中混匀，交联获得所述负载硼替佐米的凝胶支架，
[0013]
其中，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度不低于0.02μg/ml。
[0014]
葡萄糖酸内酯(gdl，葡萄糖酸-δ-内酯)易溶，加入海藻酸盐溶液后缓慢水解，导致ph缓慢但持续降低。这种ph变化使ca
2+
从纳米羟基磷灰石中解离。释放的ca
2+
引发海藻酸钠的均匀凝胶化。
[0015]
现有技术中，一般直接用氯化钙与海藻酸盐交联，由于氯化钙溶液加入海藻酸盐溶液中时，直接以钙离子溶液的形式参加交联反应，不存在钙离子缓慢释放的过程，钙离子在加入到海藻酸钠溶液中立刻发生交联反应，溶液的凝胶化又限制了钙离子在整个体系中的流动，造成了材料局部交联明显但交联不够的现象，过快的凝胶化速率导致了材料内部交联程度不同以及材料结构的不均匀。而利用羟基磷灰石释放的钙离子引导海藻酸盐交联则解决了这一问题。这是由于钙离子在从羟基磷灰石中释放出来之前已经均匀地分布在整个海藻酸盐溶液当中，随后通过gdl使钙离子从羟基磷灰石中缓慢解离，整个交联反应同时同步在整个体系的所有部位发生，使得材料的整体交联反应同时发生并且均一。
[0016]
优选的，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度为0.02～0.12μg/ml。更优选的，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度为0.1～0.12μg/ml。
[0017]
优选的，所述海藻酸盐为以下至少一种：海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙、海藻酸丙二醇脂。
[0018]
优选的，所述负载硼替佐米的凝胶支架中海藻酸盐的浓度为0.02g/ml；
[0019]
羟基磷灰石的浓度为0.06g/ml；
[0020]
葡萄糖酸内酯的浓度为0.0072g/ml。
[0021]
优选的，步骤(1)中将第一混合体系经过冷冻干燥获得羟基磷灰石/海藻酸钠支
架，然后再进行步骤(2)加入硼替佐米；
[0022]
步骤(3)中交联完成后，再经过冷冻干燥获得所述负载硼替佐米的凝胶支架。
[0023]
本发明又提供了所述制备方法制备的负载硼替佐米的凝胶支架。
[0024]
本发明还提供了所述负载硼替佐米的凝胶支架在制备用于骨组织再生的药物中的应用。
[0025]
本发明还提供了所述负载硼替佐米的凝胶支架在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。
[0026]
本技术的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
[0027]
本发明提供的载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架，结合海藻酸钠和羟基磷灰石各自的特性，将纳米羟基磷灰石加载到海藻酸钠溶液中，利用其部分产生的游离钙离子使海藻酸钠缓慢而均匀的整体交联形成凝胶作为基质，掺杂在其中的纳米羟基磷灰石也进一步提高了其机械强度，形成了具有优异成骨能力的材料体系，通过加载药物硼替佐米，冷冻干燥后获得多孔生物支架。通过纳米羟基磷灰石中的游离钙离子可成功诱导交联海藻酸钠水凝胶的形成，冻干后支架具有一定的弹性和硬度、均匀多孔的孔状结构及良好的生物活性，是肿瘤治疗与骨缺损再生的理想选择。
[0028]
在本发明中，通过使用纳米羟基磷灰石使水凝胶交联，增强了其机械性能，同时利用羟基磷灰石的微孔载药和成骨特性，制备了载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架，实现了对肿瘤的抑制和骨组织的再生。迄今为止，本领域尚未开发一种利用羟基磷灰石的交联的水凝胶支架用于载药和组织工程应用，本发明填补了这一空白。本发明的制备方法操作流程简单，原料易得，稳定性良好，安全性良好，具有量产的潜力。
[0029]
因使用纳米羟基磷灰石促进海藻酸钠水凝胶交联，增强了冻干后支架的机械强度，有利于成骨细胞的攀附，同时，纳米羟基磷灰石的成骨特性和介孔特性可用于载药和骨组织再生，解决了其他支架材料无法有效抑制肿瘤，或者肿瘤治疗剂无法协同支架材料促进骨组织再生的问题。
[0030]
由上述实施实例可知，本发明提升了支架的机械性能，同时实现了对肿瘤组织的抑制和骨组织的再生。
附图说明
[0031]
图1为本发明实例中羟基磷灰石/海藻酸钠支架的扫描电镜图。
[0032]
图2为本发明实例中羟基磷灰石/海藻酸钠支架合成过程中的x射线衍射分析变化图。
[0033]
图3为本发明实例中载药羟基磷灰石/海藻酸钠的紫外可见光谱图。
[0034]
图4为本发明实例中不同ph值(7.4和6.5)下载药羟基磷灰石/海藻酸钠中药物释放随时间的变化图。
[0035]
图5为本发明实例中不同ph值(7.4和6.5)下羟基磷灰石/海藻酸钠溶胀行为随时间的变化图。
[0036]
图6为本发明实例中不同ph值(7.4和6.5)下羟基磷灰石/海藻酸钠重量损失率随时间的变化图。
[0037]
图7为本发明实例中不同药物含量的载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架材料对4t1细
胞存活率的影响图。
[0038]
图8为本发明实例中载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架对4t1细胞杀伤能力的活死染色图。
[0039]
图9为本发明实例中载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架诱导mc3t3细胞成骨分化的alp染色和ars染色图。
[0040]
图10为本发明实例中不同时间点(3、5和7day)载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架诱导mc3t3细胞成骨分化的成骨相关因子表达图，(a)alp成骨因子表达图，(b)sp7成骨因子表达图。
[0041]
图11为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠体重变化曲线图。
[0042]
图12为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠肿瘤体积变化曲线图。
[0043]
图13为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠肿瘤重量柱状图。
[0044]
图14为发明实例中兔子股骨缺损部位micro-ct三维重建图。
[0045]
图15为发明实例中兔子股骨缺损部位成骨相关参数变化图，(a)骨体积/总骨体积(bv/tv)，(b)骨小梁数量(tb.n)，(c)骨小梁厚度(tb.th)，(d)骨小梁分离度(tb.sp)。
[0046]
图16为gdl浓度对凝胶形成影响检测结果图，其中，(a)～(f)分别对应4ml nha@sa水凝胶加入的gdl的量依次为0mg、7.2mg、10.8mg、14.4mg、21.6mg、28.8mg。
[0047]
图17为对成骨细胞的细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
[0048]
下面结合附图和具体实例对本发明作进一步的说明。
[0049]
本发明的目的在于提供一种载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架及其制备方法、应用。结合海藻酸钠和羟基磷灰石各自的特性，将纳米羟基磷灰石加载到海藻酸钠溶液中，利用其部分产生的游离钙离子使海藻酸钠缓慢而均匀的整体交联形成凝胶作为基质，掺杂在其中的纳米羟基磷灰石也进一步提高了其机械强度，形成了具有优异成骨能力的材料体系。通过加载药物硼替佐米，冷冻干燥后获得多孔生物支架。结果表明，通过纳米羟基磷灰石中的游离钙离子可成功诱导交联海藻酸钠水凝胶的形成，冻干后支架具有一定的弹性和硬度、均匀多孔的孔状结构及良好的生物活性。综上，这一材料体系具有优异的抗肿瘤能力和骨再生能力，在骨肿瘤治疗领域具有重要意义。
[0050]
实施例1
[0051]
一种载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架的制备，包括：
[0052]
步骤(1)，羟基磷灰石/海藻酸钠混合体系的制备：
[0053]
将0.8g海藻酸钠溶解在40ml去离子水中，在37℃条件下以1000rpm转速高速持续搅拌30min，形成质量分数为2％的海藻酸钠溶液。将2.4g纳米羟基磷灰石粉末加入上述海藻酸钠溶液，在37℃条件下以600rpm转速高速持续搅拌30min，使其均匀分散在海藻酸钠溶液中，得到羟基磷灰石/海藻酸钠混合体系。最后将羟基磷灰石/海藻酸钠混合体系在-20℃冷冻2h，-80℃冷冻4h，放入冷冻干燥机(fd-250101，ftfds)中在-50℃下冷冻干燥48h，以获得羟基磷灰石/海藻酸钠支架(简称：“nha@sa”)。
[0054]
步骤(2)，制备载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架：
[0055]
将4μg硼替佐米(简称：“btz”)药物(购自上海笛柏化学品技术有限公司)加入步骤
(2)所得nha@sa混合体系中，在37℃以200rpm持续搅拌24h。根据计算量加入0.288g的葡萄糖酸内酯gdl，在37℃以600rpm继续搅拌10min。将所得混合物于室温下静置3h待其交联形成凝胶。最后将水凝胶在-20℃冷冻2h，-80℃冷冻4h，放入冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，以获得载药羟基磷灰石/海藻酸钠支架(简称：“btz/nha@sa”)。本实施例中每40ml去离子水中加入4μg硼替佐米，由于其他物质加入的量都较少，对总体积影响较小，所以最终产物btz/nha@sa中硼替佐米的浓度简单地记为0.1μg/ml，下文中对btz/nha@sa中硼替佐米的浓度均按此方法计算。
[0056]
nha@sa支架的形貌分析如图1所示，支架内部结构呈多孔状，直径在50～200μm之间，允许成骨细胞长入；大量的球形纳米颗粒均匀地附着在孔壁上，孔壁粗糙，利于成骨细胞攀附增殖。
[0057]
图2为x射线衍射图，可见nha@sa支架呈现出羟基磷灰石的特征峰，进一步确认羟基磷灰石成功加载到海藻酸钠支架上。
[0058]
实施例2
[0059]
检测材料加载药物的性能、溶胀性能及降解行为。
[0060]
实验(1)，材料加载药物的性能：
[0061]
使用uv-vis分光光度计(uv-2600，shimadzu，japan)分析nha@sa(实施例1步骤(1)制备)、btz/nha@sa(实施例1步骤(2)制备)和btz药物溶液在270.5nm处的吸光度曲线。将3mgbtz/nha@sa支架浸入6ml不同ph值(6.5和7.4)的pbs溶液中，置于温度35-38℃下摇床中60h。在预定的时间点(2、4、6、8、10、12、14、24、36、48和60h)，取出等分上清(3ml)并加入等量pbs溶液。通过测量上清液在270.5nm处的吸收峰，根据btz药物标准曲线计算每个时间节点的药物释放量并绘制药物释放曲线。
[0062]
实验(2)，材料的溶胀性能：
[0063]
具体地，将btz/nha@sa支架样品称重并记录为w
1-0
，置于10ml不同ph值(6.5和7.4)的pbs溶液中。将样品置于温度35-38℃下摇床中，于不同的时间点(1、2、3、6、12、24、36和48h)将样品取出，用滤纸吸掉表面水分，称重并记录为w
1-t
。根据以下公式计算支架的溶胀率：
[0064]
溶胀率＝(w
1-t
－w
1-0
)/w
1-0
×
100％。
[0065]
实验(3)，材料的降解行为：
[0066]
具体地，将btz/nha@sa支架样品称重并记录为w
2-0
，置于10ml不同ph值(6.5和7.4)的pbs溶液中。随后将样品置于温度35-38℃下摇床中，每天换用新的pbs溶液，于不同的时间点(2、4、6、8、10、12、14、16、20和24day)将样品取出，并用去离子水清洗两遍。将所有收集的支架冷冻干燥，然后称重并相应地记录为w
2-t
。根据以下公式计算支架的降解率：
[0067]
重量损失率＝(w
2-0
－w
2-t
)/w
2-0
×
100％。
[0068]
btz/nha@sa的紫外可见光谱如图3所示，270nm处的峰是btz药物的特征性吸收峰，表明药物的成功负载。
[0069]
btz的药物释放动力学曲线如图4所示。通过模拟肿瘤(即ph 6.5)和成骨(即ph 7.4)微环境可以看到，在12h这个时间点，药物从btz/nha@sa支架中的释放速率在两种ph值下均接近90％，表明药物释放行为不受ph值变化的影响。
[0070]
通过将支架放入不同ph值(7.4和6.5)的pbs中来评估nha@sa支架溶胀行为。如图5
所示，当ph值为6.5时，nha@sa支架溶胀率在2h时约为9％，24h后达到11％，之后趋于稳定。相比之下，当ph值为7.4时，支架的溶胀率较低，2h时约为7％，24h后约为10％。此外，两组溶胀率在24h后均达到溶胀平衡。
[0071]
同时，通过测定不同ph值(7.4和6.5)下随时间变化的重量损失率，以评估nha@sa支架体外降解性能。如图6所示，在第0-12day期间，弱酸性组(ph＝6.5)支架的重量损失率较另一组低。随着时间的推移，两组支架溶解速率趋于稳定，特别是12day后，两组间数值无统计学差异(p》0.05，n＝3)。24day时，两组支架的重量分别达到初始重量的74.7％(ph 7.4)和74.4％(ph 6.5)。这一结果表明，相对较低的支架降解速率可能能够为骨修复和再生过程提供持续的结构支撑，并与缓慢的成骨过程相匹配。
[0072]
实施例3
[0073]
本实验通过在细胞水平的杀伤效果来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。所选用的肿瘤细胞为4t1小鼠乳腺癌细胞系。
[0074]
实验(1)，不同药物含量的btz/nha@sa的肿瘤细胞杀伤性能：
[0075]
具体地，先使用实施例1中同样方法制备得到不同药物浓度的btz/nha@sa支架，浓度分别有：0，0.02，0.04，0.06，0.1和0.12μg/ml，然后使用不同药物浓度的btz/nha@sa支架与4t1细胞(1
×
104个细胞/孔)在37℃、5％co2的条件下共孵育24h。然后，于每孔加入100μl培养基含10μl(10％)cck-8试剂置于培养箱继续培养一定时间后，使用酶标仪检测450nm波长的吸光度(od)值。实验过程中最佳od值控制在1.0左右较合适。每组实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。
[0076]
实验(2)，btz/nha@sa支架对肿瘤细胞杀伤能力的活死染色：
[0077]
具体地，使用1640培养基，在37℃、5％ co2条件下，将生长状况良好的对数生长期4t1细胞以(1
×
105)密度接种于24孔板，分别与nha@sa支架及btz/nha@sa支架共孵育，并设置空白对照组。24h后，对各组细胞进行活、死染色实验。首先，去除孔内培养基并用pbs轻洗两次，随后配制染色剂(2ml pbs+4μl am+6μl pi)并于每孔加入200μl。将孔板37℃黑暗环境中孵育30min，再用pbs清洗多余染色剂后加入适量培养液。最后，使用倒置荧光显微镜(ts2r fl，尼康，日本)中蓝色光源激发绿色荧光拍活细胞，绿色光源激发红色荧光拍死细胞观察染色细胞并拍照。
[0078]
将不同药物含量的btz/nha@sa支架材料与4t1肿瘤细胞共培养24h后进行细胞活力测试。如图7所示。4t1细胞活性随药物浓度的增加而降低。当btz药物含量为0.1μg/ml时，4t1肿瘤细胞的存活率约30％，所以对4t1肿瘤细胞活性的抑制率达到了约70％。这些结果证实，btz/nha@sa支架具备良好的体外抗肿瘤作用。因此，我们最终使用btz药物含量为0.1μg/ml的btz/nha@sa支架用于后续实验。
[0079]
此外，通过活/死染色进一步评估两种支架的抗肿瘤作用。如图8所示，不同支架材料与细胞共培养24h后，btz/nha@sa支架组呈现强烈的红色荧光(死细胞)，而其他两组则呈现强烈的绿色荧光(活细胞)，这进一步说明与对照组和nha@sa支架组的高细胞活性相比，nha@sa支架组4t1肿瘤细胞的细胞活力显著降低，表明从支架材料释放的药物对肿瘤细胞造成了严重损伤。
[0080]
实施例4
[0081]
本实验通过在细胞水平的成骨相关因子测定来说明材料在组织再生方面的应用。
所选用的成骨细胞为mc3t3小鼠胚胎成骨细胞系。
[0082]
实验(1)，btz/nha@sa支架促进小鼠胚胎成骨细胞的分化及矿化：
[0083]
具体地，将mc3t3细胞按照1
×
105的细胞密度接种在24孔板中，每孔加入1mlα-mem培养基并置于培养箱中培养。当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内培养基吸走，并加入2ml分别含nha@sa和btz/nha@sa支架材料的成骨分化诱导(odi)培养基(α-mem培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，10mmβ-甘油磷酸，50mg/ml l-抗坏血酸和100nm地塞米松)。每隔3天换用新鲜的成骨分化诱导培养基(使用前需预热至37℃)。分别诱导2周和4周后，视成骨细胞的形态变化及生长情况，通过bcip/nbt碱性磷酸酶显色试剂盒和茜素红s染色试剂盒进行alp和ars染色。染色过程如下：轻轻移除待染色孔内培养基，每孔加入1ml pbs静置1min后移除，洗涤两次。随用每孔加入1ml固定液，37℃固定30min。移除固定液，每孔加1ml pbs洗涤两次，然后加入100μl现配染色剂37℃染色30min。最后，用去离子水轻轻洗去染色剂后显微镜下观察并拍摄染色结果。
[0084]
实验(2)，btz/nha@sa支架诱导小鼠胚胎成骨细胞成骨相关因子表达：
[0085]
具体地，通过实时定量聚合酶链式反应(qpcr)测定成骨相关因子alp(上游引物序列：5
’‑
gataacgagatgccaccagagg-3’；下游引物序列：3
’‑
gttcagtgcggttccagacatag-5’)和sp7(上游引物序列：5
’‑
caaagaagccatacgctgacct-3’；下游引物序列：3
’‑
aggaaatgagtgagggaagggt-5’)表达水平变化。将mc3t3细胞按照1
×
105的细胞密度接种在24孔板中，每孔加入1mlα-mem培养基并置于培养箱中培养。当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内培养基吸走，并加入2ml含支架材料的成骨分化诱导(odi)培养基。培养3、5和7day后，使用trizol收集mc3t3细胞用于提取总rna。使用逆转录试剂盒得到cdna，进一步使用sybr green detection system试剂盒进行qpcr检测。每组实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。
[0086]
实验通过alp和ars染色评估btz/nha@sa支架的成骨诱导性能。如图9所示，7天后，与实验样品孵育的成骨细胞显示出比对照组更强的碱性磷酸酶活性，并且btz/nha@sa支架组表现出最显著的成骨诱导能力。14天后，nha@sa支架及btz/nha@sa支架钙结节形成能力均优于对照组。结果说明，btz/nha@sa支架对mc3t3细胞具有良好的成骨分化诱导能力。
[0087]
如图10所示，从实时定量聚合酶链式反应(qpcr)结果可见，3d及5d两个时间点各组的成骨相关因子(alp和sp7)基因表达水平均无显著增加。当成骨诱导时间为7d时，nha@sa支架组alp和sp7基因表达水平较对照组增加，同时btz/nha@sa支架组较其他两组显著增加。以上结果进一步证明btz/nha@sa支架具有积极的成骨作用，通过加载低含量的btz药物(0.1μg/ml)可以进一步增强成骨诱导作用。
[0088]
实施例5
[0089]
本实验通过在动物(小鼠)肿瘤模型中的肿瘤抑制来说明btz/nha@sa支架在肿瘤治疗方面的应用。小鼠模型为乳腺癌细胞腋下移植瘤。
[0090]
具体地，首先，清理小鼠腋窝，将含2
×
106个4t1肿瘤细胞的50μl pbs中注入小鼠皮下，待肿瘤体积达到100mm3左右时，视为肿瘤形成，记为-1days。随即将支架植入，记为0days。肿瘤部位手术过程如下：清洁并消毒肿瘤所在部位，手术刀切开后用镊子轻轻分离肿瘤与皮下组织，然后将支架植入，最后将手术伤口进行缝合。在手术之前，所有支架均在紫外线下进行2个1h周期灭菌处理。实验过程中根据以下公式计算肿瘤体积(v)：体积＝(肿
瘤长度)
×
(肿瘤宽度)2×
0.5。将荷瘤小鼠随机分为五组，每组5只(n＝5)：(i)对照组，假手术组；(ii)nha@sa支架植入；(iii)btz瘤内注射；(iv)nha@sa支架植入+btz瘤内注射；(v)btz/nha@sa支架植入。在实验期间每隔一天评估并记录各组小鼠的肿瘤大小和体重。将每次记录的肿瘤体积除以处理前肿瘤体积的比值作为小鼠肿瘤体积变化值，以此来评估肿瘤的增长率和处理对肿瘤生长的抑制作用。在第14天，通过手术收集各组小鼠肿瘤组织进行称重、成像。
[0091]
从图11中可以看出，所有处理组小鼠体重并未出现下降，随时间呈现逐渐增加的趋势，说明上述处理对小鼠的正常生理活动并无明显影响。
[0092]
图12所示，nha@sa支架组没有产生明显的肿瘤抑制效果。btz瘤内注射和nha@sa支架植入+btz瘤内注射两组具有一定的抑制肿瘤生长的效果，表明btz药物对小鼠肿瘤生长具有一定的抑制作用。然而，由于药物在肿瘤部位不能缓慢，难以释放维持长期有效治疗浓度，所以对肿瘤抑制效果有限。而btz/nha@sa支架组显著抑制了肿瘤，表现出最强的抑制效果。该结果表明，btz药物从支架中缓慢释放，在较长时间维持药物在肿瘤部位的有效浓度，从而展现出优秀的抑瘤能力。
[0093]
图13所示的肿瘤重量与肿瘤体积变化曲线基本吻合，进一步证明了btz/nha@sa支架材料在荷瘤小鼠模型中优异的肿瘤杀伤功能。
[0094]
实施例6
[0095]
本实验通过在动物(兔)骨缺损模型中的成骨作用来说明btz/nha@sa支架的骨组织再生能力。兔子模型为临界大小股骨缺损。
[0096]
具体地，实验采用直径为5mm的无菌电钻在8周龄的雄性兔子的同侧股骨处制造一个临界大小(6mm宽
×
9mm深)的股骨缺损模型。将兔子随机分为三组，每组5只(n＝5)：(a)btz药物注射组；(b)nha@sa支架植入组；(c)btz/nha@sa支架植入组。术后12周，通过腹腔注射10％水合氯醛处死兔子。随后，将股骨取出后置于标本容器，加入4％多聚甲醛在20℃下固定72h。最后，将股骨转移到75％的酒精中脱水后进行micro-ct成像，观察缺损部位的骨再生修复情况。同时，使用ct分析仪对骨缺损造模部位进行三维重建，在成像软件中去除植入材料，测定骨缺损部位骨体积/总骨体积(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)及骨小梁分离度(tb.sp)四种参数。
[0097]
从图14中micro-ct重建结果显示，btz/nha@sa支架组的骨缺损修复效果明显优于btz药物注射组和nha@sa支架组。在第12周时，缺损区域形成的新骨组织明显增多。值得注意的是，虽然植入的支架材料为圆柱形，但btz/nha@sa支架在髓腔内呈现出弥散扩大的明显矿化组织，相比于nha@sa支架的原位矿化范围更大。这一现象表明nha@sa支架有利于引导骨组织从支架外围向支架内部的生长，从而实现支架内部组织的均匀矿化。然而，btz/nha@sa支架植入后伴随btz药物及钙离子释放，可能将引导成骨细胞从原位向周围组织的迁移增殖，btz药物及钙离子协同表现出更优异的骨缺损再生能力。从骨缺损的横截面来看，btz药物注射组的骨皮质缺损尚未完全愈合，而其他两组则形成了致密且连续的骨皮质。
[0098]
采用三维重建定量分析髓腔中骨小梁和周围皮质骨区域的骨形成效果。如图15所示，btz/nha@sa支架组的骨小梁体积分数(bv/tv)显著高于nha@sa支架组及btz药物注射组，其他指标如：骨小梁数量(tb.n)和骨小梁厚度(tb.th)，肾小梁分离度(tb.sp)趋势与骨
小梁体积分数趋势相一致，表明支架材料具有良好的骨再生诱导能力。
[0099]
综上，btz/nha@sa支架可以诱导形成骨结构有序的骨皮质及骨松质，其排布、密度及组织结构具有特异性，这一愈合过程符合正常的骨生理。
[0100]
实施例7
[0101]
葡萄糖酸内酯gdl加入量筛选。
[0102]
向实施例1步骤(1)制备的nha@sa水凝胶中加入不同量的gdl，通过加入不同的量观察是否可以凝胶化。3h后各组凝胶形成情况如图16所示，图16中每组中a～f相对应的4ml nha@sa水凝胶加入的gdl的量依次为0mg、7.2mg、10.8mg、14.4mg、21.6mg、28.8mg。图中可以看出4ml nha@sa水凝胶加入28.8mg的gdl时，交联3h时已经可以形成均匀凝胶，同时水凝胶的ph趋于中性，对成骨有利。
[0103]
实施例8
[0104]
本实验检测btz/nha@sa支架对成骨细胞的细胞毒性。
[0105]
具体地，先使用实施例1中同样方法制备得到不同药物浓度的btz/nha@sa支架，浓度分别有：0，0.02，0.04，0.06，0.1和0.12μg/ml，然后使用不同药物浓度的btz/nha@sa支架与mc3t3细胞(1
×
104个细胞/孔)在37℃、5％ co2的条件下共孵育24h。然后，于每孔加入100μl培养基含10μl(10％)cck-8试剂置于培养箱继续培养一定时间后，使用酶标仪检测450nm波长的吸光度(od)值。实验过程中最佳od值控制在1.0左右较合适。每组实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。
[0106]
结果如图17所示，在较低浓度的btz下本技术btz/nha@sa支架对成骨细胞成活率具有一定提高，但浓度太高时，会对成骨细胞有轻微的杀伤，所以，总的来说，btz/nha@sa支架使用时，btz药物的浓度不宜过高，0.1μg/ml的浓度下兼顾了药效和副作用，会较为合适。
[0107]
由上述实施例可知，本发明提供的btz/nha@sa支架中，在肿瘤治疗与骨缺损再生修复领域中具有重要意义。
[0108]
研究发现btz通过泛素介导的smurf和nf-κb途径抑制破骨细胞分化，从而减少ovx诱导的小鼠骨质疏松。然而，很少有研究探讨btz在局部给药中的应用。先前的研究集中在btz的缓释性能上，但几乎没有注意到其生物相互作用。作为一种蛋白酶体抑制剂，btz能够抑制cav-1，这是一种调节钙内流的关键蛋白。研究发现，减少cav-1的表达有助于维持msc的低分化状态并抑制破骨细胞，从而反向增强成骨活性。然而，除了细胞分化外，钙代谢也是骨骼修复不可或缺的一部分。在cav-1抑制后，et-1介导细胞内钙浓度降低，这表明btz诱导的成骨作用可能受到ca
2+
代谢而不是细胞分化的限制。因此，持续的ca
2+
供应可以通过缓解cav-1抑制引起的钙代谢瓶颈来提高btz诱导的成骨活性。本实验中通过羟基磷灰石提供ca
2+
，与btz药物协同作用支架表现出了超出我们预期的优异成骨性能。

技术特征：
1.一种负载硼替佐米的凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海藻酸盐和羟基磷灰石分散在水中获得第一混合体系；(2)将硼替佐米加入所述第一混合液中并混匀获得第二混合体系；(3)将葡萄糖酸内酯加入所述第二混合体系中混匀，交联获得所述负载硼替佐米的凝胶支架，其中，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度不低于0.02μg/ml。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度为0.02～0.12μg/ml。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述负载硼替佐米的凝胶支架中硼替佐米的药物浓度为0.1～0.12μg/ml。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐为以下至少一种：海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙、海藻酸丙二醇脂。5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述负载硼替佐米的凝胶支架中海藻酸盐的浓度为0.02g/ml；羟基磷灰石的浓度为0.06g/ml；葡萄糖酸内酯的浓度为0.0072g/ml。6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中将第一混合体系经过冷冻干燥获得羟基磷灰石/海藻酸钠支架，然后再进行步骤(2)加入硼替佐米；步骤(3)中交联完成后，再经过冷冻干燥获得所述负载硼替佐米的凝胶支架。7.权利要求1～6任一所述制备方法制备的负载硼替佐米的凝胶支架。8.权利要求7所述负载硼替佐米的凝胶支架在制备用于骨组织再生的药物中的应用。9.权利要求7所述负载硼替佐米的凝胶支架在制备治疗骨肿瘤的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种负载硼替佐米的凝胶支架及其制备方法和应用。本发明制备方法通过将海藻酸盐和羟基磷灰石制成凝胶，负载药物硼替佐米，其中加入葡萄糖酸内酯控制Ca


技术研发人员：傅译可 李翔 陈佳菲
受保护的技术使用者：浙江大学杭州国际科创中心
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/9/11