一种炭疽杆菌PA-LF融合蛋白、ELISA试剂盒和应用

一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白、elisa试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白、elisa试剂盒和应用。


背景技术：

2.炭疽(anthrax)是由炭疽杆菌(bacillus anthracis)所引起的一种烈性人畜共患病。炭疽可以通过在自然条件下接触受感染的动物及其产品而传播给人类。炭疽因其广泛分布而被认为是一种具有全球公共卫生重要性的疾病。
3.炭疽杆菌的毒力归因于两个因素，即荚膜和外毒素。炭疽杆菌的荚膜是独特的，它由聚-d-γ-谷氨酸组成，由94kb质粒pxo2编码。外毒素由三种蛋白质组成，即保护性抗原(pa)、致死因子(lf)和水肿因子(ef)，均由181kb巨型质粒pxo1编码。外毒素属于a-b毒素超家族，pa充当b部分，lf/ef充当a部分。其中b部分与细胞表面受体结合并有助于a部分在细胞内的易位。同样，抗lf抗体因其免疫反应显著且比较早出现，被认为是炭疽感染的诊断标志，而ef作为炭疽毒素中的一部分，发现针对pa和ef的免疫反应存在延迟和较低两个特点。
4.目前，应对炭疽感染的方法还主要是提前接种炭疽疫苗，市场上应用于动物上的炭疽疫苗主要是ⅱ号炭疽芽孢苗和无荚膜炭疽芽孢苗。而感染炭疽的检测方法常采用特异性抗体采用夹心法或竞争法来检测抗体。该方法无法诊断患者感染炭疽所处阶段，因此即便诊断为阳性，也无法对症给药。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，是由pa结构域2-4和lf结构域1融合得到，作为抗原制备检测炭疽抗体的试剂盒，为感染病患指导用药提供了可能。
6.本发明提供了一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明提供了所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白在制备诊断炭疽或检测炭疽杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用。
8.优选的，所述炭疽杆菌抗体包括机体经人工免疫产生的抗体。
9.优选的，所述人工免疫的疫苗包括ⅱ号炭疽芽孢苗和/或无荚膜炭疽芽孢苗。
10.优选的，所述试剂盒包括以下至少一种：elisa试剂盒、免疫层析试剂盒和免疫磁珠试剂盒。
11.本发明提供了一种检测炭疽杆菌抗体的elisa试剂盒，包括以下组成：
12.包被有所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的检测板和酶标记的igg抗体。
13.优选的，所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的浓度包括3～5μg/ml。
14.优选的，所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的包被液为ph值7.3～7.5的pbs缓冲液；
15.所述包被的方法为36.8～37.2℃下孵育110～130min。
16.优选的，所述包被后，还包括对检测板进行封闭；
17.所述封闭用封闭液为含质量百分含量4％～6％脱脂奶粉的pbs缓冲液。
18.优选的，还包括以下至少一种试剂：洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液、阴性血清和阳性血清。
19.本发明提供了一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，氨基酸序列如seq id no:1所示。本发明提供的融合蛋白中pa作为自然免疫和疫苗诱导免疫的主要抗原且在炭疽毒素进入机体内发挥着重要作用，因此pa是炭疽毒素复合物的核心成分，因此pa特异性抗体在在动物模型中对炭疽杆菌的保护是十分重要的，当检测炭疽杆菌抗体时，以pa作为结合抗原的一部分有利于特异性识别机体中主要炭疽杆菌抗体。同时本发明还将lf结构域1与pa结构域2-4融合，与全长lf结构域相比，不仅不会影响pa与抗体的结合，而且不会导致融合蛋白产生毒性，具有较高的安全性，另外，lf结构域1与pa融合还能识别并结合针对lf蛋白的特异性抗体，大大增加了检测的准确性的同时还降低了检测成本提高检测效率。此外，以所述pa-lf融合蛋白作为包被抗原用于炭疽杆菌抗体的检测中，为炭疽疫苗免疫动物后的抗体消长检测提供技术支持，为炭疽疫苗的免疫程序制订提供理论依据。
具体实施方式
20.本发明提供了一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，氨基酸序列如seq id no:1(hplvaaypivhvdmeniilsknedqstqntdsqtrtiskntstsrthtsevhgnaevhasffdiggsvsagfsnsnsstvaidhslslagertwaetmglntadtarlnaniryvntgtapiynvlpttslvlgknqtlatikakenqlsqilapnnyypsknlapialnaqddfsstpitmnynqflelektkqlrldtdqvygniatynfengrvrvdtgsnwsevlpqiqettariifngkdlnlverriaavnpsdplettkpdmtlkealkiafgfnepngnlqyqgkditefdfnfdqqtsqniknqlaelnvtniytvldkiklnakmnilirdkrfhydrnniavgadesvvkeahrevinssteglllnidkdirkilsgyiveiedteglkevindrydmlnisslrqdgktfidfkkyndklplyisnpnykvnvyavtkentiinpsengdtstngikkilifskkgyeigleqgagghgdvgmhvkekeknkdenkrkdeernktqeehlkeimkhivkievkgeeavkkeaaekllekvpsdvlemykaiggkiyivdgditkhislealsedkkkikdiygkdallhehyvyakegyepvlviqssedyventekalnvyyeigkilsrdilskinqpyqkfldvlntiknasdsdgqdllftnqlkehptdfsve)所示。
21.在本发明中，所述pa-lf融合蛋白是由pa结构域2～4和lf结构域1组成。其中pa的结构域2参与pa七聚体的形成和对pa跨膜孔道的形成和转运具有重要作用，结构域3参与pa七聚体的形成，结构域4不单是受体的结合位点同时还是主要的免疫原区域。pa作为自然免疫和疫苗诱导免疫的主要抗原且在炭疽毒素进入机体内发挥着重要作用，因此pa是炭疽毒素复合物的核心成分，对pa的免疫反应在动物模型中对炭疽杆菌的保护是十分重要的。因此，检测血清中的抗paigg可作为一种确认炭疽暴露的重要工具。同样，抗lf抗体因其免疫反应显著且比较早出现，被认为是炭疽感染的诊断标志。而本发明采用lf结构域1与pa融合，形成的融合蛋白不仅能特异性识别结合抗paigg抗体，而且还能特异性识别抗lf抗体，保证了检测结果的准确性。
22.在本发明中，所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的构建方法，优选包括以下步骤：
23.分别扩增炭疽杆菌的pa基因和lf基因，将炭疽杆菌pa基因和lf基因克隆至表达载体中，经过表达系统表达，分离纯化，得到炭疽杆菌pa-lf融合蛋白。
24.在本发明中，所述扩增炭疽杆菌的pa基因的引物包括核苷酸序列如seq id no:2
所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物，所述正反向引物中包含bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点。所述扩增的反应体系优选为2
×
taqplus mastermix 10μl、10mmol/l上游引物1μl、10mmol/l下游引物1μl、dna模板2μl、ddh2o 6μl。所述扩增的反应程序优选为95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1.5min；共35个循环；72℃再延伸7min。所述扩增炭疽杆菌的lf基因的引物包括核苷酸序列如seq id no:4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的反向引物，所述正反向引物中包含xhoⅰ和salⅰ酶切位点。所述扩增的反应体系优选为2
×
taq plus master mix 10μl、10mmol/l上游引物1μl、10mmol/l下游引物1μl、dna模板2μl、ddh2o 6μl。所述扩增的反应程序优选为95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃再延伸7min。本发明对所述表达载体没有特殊限制，采用本领域所熟知的表达载体即可，例如pmd19-t。所述克隆的方法优选包括在限制性内切酶的作用下分别酶切pa基因、lf基因和表达载体。酶切后纯化回收片段，在酶的作用下连接，得到连接产物，经筛选，得到的阳性转化子转化至bl21(de3)，经诱导表达和ni sepharose 6fast flow亲和层析柱纯化，得到融合蛋白。
25.本发明提供了所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白在制备诊断炭疽或检测炭疽杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用。
26.在本发明中，所述炭疽杆菌抗体优选包括机体经人工免疫或自然免疫产生的抗体。所述人工免疫的疫苗优选包括ⅱ号炭疽芽孢苗和/或无荚膜炭疽芽孢苗。
27.在本发明中，所述试剂盒优选包括以下至少一种：elisa试剂盒、免疫层析试剂盒和免疫磁珠试剂盒。所述试剂盒的检测原理优选包括以下至少一种：间接法和竞争法等。
28.本发明提供了一种检测炭疽杆菌抗体的elisa试剂盒，包括以下组成：
29.包被有所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的检测板和酶标记的igg抗体。
30.在本发明中，所述酶标记的igg抗体的工作浓度优选为1：8000。所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的浓度优选包括3～5μg/ml，更优选为4μg/ml。所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的添加体积优选为100μl/孔。所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的包被液优选为ph值7.3～7.5的pbs缓冲液。所述包被的方法优选为36.8～37.2℃下孵育110～130min，更优选为37℃下孵育120min。实验表明，与4℃过夜包被相比，37℃包被2h，p/n值最大，包被效果最好。
31.在本发明中，所述包被后，优选还包括对检测板进行封闭。所述封闭用封闭液优选为含质量百分含量4％～6％脱脂奶粉的pbs缓冲液。所述封闭液的添加体积优选为200μl/孔。经过优化，所述封闭的方法为在37℃下封闭120min。
32.在本发明中，优选还包括以下至少一种试剂：洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液、阴性血清和阳性血清。所述洗涤液优选为含体积百分含量0.05％tween-20的pbs缓冲液。所述稀释液优选为：含质量百分含量2％脱脂奶粉的pbs缓冲液。底物液优选与酶的种类相适应，当酶为hrp时，底物液优选为tmb底物显色液。所述终止液为2m h2so4水溶液。
33.在本发明中，所述elisa试剂盒的检测方法，优选包括以下步骤：
34.1)向包被有炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的检测板中加入待检测血清，孵育，弃去溶液，洗涤；
35.2)向洗涤后的检测板中加入酶标记igg抗体，孵育，弃去溶液，洗涤；
36.3)向步骤2)中洗涤后的检测板中加入底物液，显色反应后加入终止液，读取吸光
度值；
37.4)根据所述吸光度值与标准曲线结果，得到血清中抗体浓度。
38.在本发明中，所述待检测血清的稀释度优选为1:200。所述待检测血清的添加体积优选为l00μl/孔。所述孵育的条件优选为37℃孵育30min。
39.在本发明中，所述酶标记igg抗体的稀释度优选为1:8000。所述酶标记igg抗体的添加体积优选为l00μl/孔。所述孵育的条件优选为37℃孵育45min。所述底物液的添加体积优选为l00μl/孔。所述显色反应的时间优选为10min。所述终止液的添加体积优选为l00μl/孔。
40.在本发明中，elisa检测试剂盒的阴阳性临界值判断方法优选如下：根据2020年11月实施的《炭疽诊断标准》(ws283-2020)中的炭疽阳性血清的判定标准：被检孔血清的od
450
值大于阴性血清od
450
值2.5倍即为阳性血清，故阳性临界值为：被检血清/阴性血清》2.5时，判定为阳性，被检血清/阴性血清≤2.5时，判定为阴性。
41.该检测方法适用于动物免疫炭疽疫苗后的抗体检测。
42.下面结合实施例对本发明提供的一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白、elisa试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1
44.一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的重组表达方法
45.1.目标蛋白的扩增
46.在ncbi数据库中查找炭疽芽孢杆菌pa的基因序列(登录号：af306782.1)和lf的基因序列(登录号：m30210.1)，并利用软件设计pa和lf的基因引物，分别在这两对引物的上下游添加酶切位点，其中pa的下游酶切位点和lf的上游酶切位点一致。其中pa、lf基因的扩增引物如下：
[0047][0048][0049]
在上述设计的两对引物参与下，分别pcr扩增pa基因片段和lf基因片段。其中，pcr扩增的反应体系为：2
×
taqplus mastermix 10μl、10mmol/l上游引物1μl、10mmol/l下游引物1μl，dna模板2μl，ddh2o 6μl。所述pcr扩增的反应程序如下：
[0050][0051]
将两种pcr产物经过切胶回收，得到纯化的pa基因片段和lf基因片段在经xhoⅰ酶切后，通过xhoⅰ酶切位点连接。
[0052]
2.重组载体的构建
[0053]
将纯化的pa-lf融合基因片段以pmd19-t载体分别在bamhⅰ和salⅰ作用下进行酶切，酶切产物经过切胶回收，得到纯化的酶切产物和线性化质粒。
[0054]
将纯化的酶切产物和线性化质粒在soultionⅰ连接酶作用下进行连接，得到的连接产物。将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中，经菌落pcr和双酶切筛选验证，得到阳性转化子，送至上海生工生物公司测序，测序结果得到预期的pa-lf融合基因片段，说明得到表达pa-lf融合基因的大肠杆菌。
[0055]
3.重组表达方法
[0056]
将表达pa-lf融合基因的大肠杆菌经过培养和诱导培养，得到菌液，采用ni sepharose 6 fast flow亲和层析柱(杂蛋白洗脱液：20mm tris-hcl(ph:8.0)、0.5m nacl、30mm咪唑和8m尿素，目的蛋白洗脱液：20mm tris-hcl(ph:8.0)、0.5m nacl、500mm咪唑和8m尿素)来纯化蛋白，经免疫印迹方法检测纯化蛋白与预期的pa-lf融合蛋白片段一致，说明本发明成功重组表达得到pa-lf融合蛋白。
[0057]
实施例2
[0058]
间接elisa检测试剂盒的优化
[0059]
1重组蛋白最佳包被浓度与二抗最佳工作浓度的优化
[0060]
用包被液(ph 7.4pbs缓冲液)将重组pa-lf蛋白依次稀释至32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、lμg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml 7个稀释度，每个稀释度包被elisa板的1个竖行，包被两块，37℃包被2h。加入阳性血清孵育洗涤后，用抗体稀释液将hrp标记的兔抗绵羊igg抗体依次进行1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000和1：32000倍比稀释，每个稀释度加在同一个横行，l00μl/孔，形成方阵。37℃孵育45min。洗涤，加入底物液，显色反应10min，加入终止液，酶标仪读取od
450
值。选择阳性血清od
450
值与阴性血清od
450
值的比值(p/n值)最大的抗原浓度和二抗稀释度作为最佳抗原包被浓度及最佳二抗反应浓度。
[0061]
结果表明抗原包被浓度为4μg/ml，酶标二抗浓度为1：8000时，p/n值最大(见表1)。
[0062]
表1最佳抗原包被浓度和最佳二抗稀释倍数的优化
[0063][0064][0065]
2抗原包被条件的确定
[0066]
以上述项1中得到的最适抗原包被浓度包被酶标板，l00μl/孔；实验分成三个组，第一组以4℃包被过夜；第二组4℃包被过夜加37℃包被2h；第三组37℃包被2h。每组设3个重复，分别进行elisa酶标仪测定阴阳性血清的od
450
值，计算出p/n值。选取p/n值大的作为最佳抗原包被条件。
[0067]
结果表明，37℃包被2h为最佳包被条件，此时p/n值最大(见表2)。
[0068]
表2最佳包被条件的优化
[0069][0070]
3最佳封闭时间的确定
[0071]
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，l00μl/孔。将酶标板分成四组。第一组37℃封闭30min，第二组37℃封闭60mi n，第三组37℃封闭120min。洗涤后进行eli sa反应。分别测定各组的阴阳性血清od
450
值，并计算出p/n值，确定最佳封闭时间。
[0072]
结果表明，37℃封闭120min为最佳封闭条件，此时p/n值最大(表3)。
[0073]
表3最佳封闭时间的确定
[0074][0075]
4最佳血清稀释度及血清孵育时间的确定
[0076]
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，l00μl/孔。封闭后分成三组。第一组从上到下分别加入1：100、1：200、1：400、1：800和1：1600倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应30min；第二组从上到下分别加入1：100、1：200、1：400、1：800和1：
1600倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应60min；第三组上到下分别加入1：100、1:200、1：400、1：800和1：1600倍稀释的阴阳性血清，各两个重复，37℃反应120min。分别进行elisa反应，反应结束后分别测定各组各个稀释度的阴阳性血清平均od
450
值，并计算出p/n值，从而确定最佳血清稀释度和最佳血清反应时间。结果表明，血清以1：200倍稀释，孵育30min时，p/n值最大(见表4)。
[0077]
表4最佳血清稀释倍数和作用时间的优化
[0078][0079]
5最佳二抗反应时间的确定
[0080]
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，l00μl/孔。洗涤后37℃封闭2h，加入1：200稀释的阴阳性血清，l00μl/孔，37℃反应30min。洗涤后加入1：8000倍稀释的hrp标记兔抗绵羊igg抗体，l00μl/孔。再分成四组，第一组37℃反应15min，第二组37℃反应30min，第三组37℃反应45min，第四组37℃反应60min，每组3个重复。洗涤后显色，在酶标仪上测定各组阴阳性血清的od
450
值，并计算出p/n值，以确定二抗最佳反应时间。
[0081]
结果表明，二抗反应时间为45min时，p/n值最大(表5)。
[0082]
表5最佳二抗反应时间的优化
[0083]
[0084][0085]
6底物显色时间及稀释液的确定
[0086]
以最佳重组蛋白抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板，l00μl/孔。洗涤后37℃封闭2h，第一组以pbst为稀释液每组4个平行加入1:200稀释的阴阳性血清，l00μl/孔，第二组以pbst+1％脱脂奶粉为稀释液每组4个平行加入1:200稀释的阴阳性血清，l00μl/孔，第三组以pbst+2％脱脂奶粉为稀释液每组4个平行加入1:200稀释的阴阳性血清，l00μl/孔，37℃反应30min。洗涤后加入1:8000倍稀释的hrp标记兔抗绵羊igg抗体，l00μl/孔，37℃反应45min。洗涤后分成四组，每组分别包含一组以pbst、pbst+1％脱脂奶粉和pbst+2％脱脂奶粉为稀释液的酶标孔。第一组加入l00μl/孔底物溶液，室温显色5min，第二组加入l00μl/孔底物溶液，室温显色l0min；第三组加入100μl/孔底物溶液，室温显色15min；第四组加入l00μl/孔底物溶液，室温显色20min。每组3个重复，显色完成后加入100μl/孔的终止液终止显色，分别测量每组的阴阳性血清的od
450
值，并计算出p/n值，以确定最佳底物显色时间。结果表明，显色5min时，p/n值最大(见表6)。
[0087]
表6最佳底物显色时间的优化
[0088]
[0089][0090]
实施例3
[0091]
一种间接elisa试剂盒的制备和使用方法
[0092]
包被抗原：将重组pa-lf融合蛋白用包被液稀释至4μg/ml，加入酶标板中37℃包被2h(，100μl/孔，得包被酶标板；
[0093]
洗涤：弃去包被液并用洗涤液洗涤；
[0094]
封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h，弃去封闭液洗涤；
[0095]
孵育一抗：按稀释度为1：200将绵羊血清与稀释液混匀，l00μl/孔，37℃孵育30min，弃去并洗涤；
[0096]
孵育二抗：按稀释度为1：8000将hrp标记的兔抗绵羊igg抗体与稀释液混匀，100μl/孔，37℃孵育45min，弃去并洗涤；
[0097]
显色读数：以l00μl/孔加入底物液，室温显色反应5min后加入终止液，酶标仪读取od
450
值。
[0098]
间接eli sa阴阳性临界值的判断：
[0099]
根据2020年11月实施的《炭疽诊断标准》(ws283-2020)中的炭疽阳性血清的判定标准：被检孔血清的od
450
值大于阴性血清od
450
值2.5倍即为阳性血清，故阳性临界值为：被检血清/阴性血清》2.5时，判定为阳性，被检血清/阴性血清≤2.5时，判定为阴性。
[0100]
实施例4
[0101]
elisa试剂盒的重复性试验
[0102]
在第1、3、5天分别包被三个批次的炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，并在第6天对阴阳性血清进行elisa检测，批次内设4个重复，测定od
450
值，计算出平均值、标准差和变异系数。
[0103]
1.批内重复性：计算出各个批次内4个重复间的变异系数，根据变异系数的大小来确定批内的重复性。批内阳性血清的od
450
值变异系数在1.5％～4.8％之间，阴性血清od
450
值变异系数在1.2％～7.5％之间(见表7)。
[0104]
2批间重复性试验
[0105]
1)批间重复性：计算出三个批次间的变异系数，并根据变异系数大小来确定批间的重复性。批间阳性血清的od
450
值变异系数为3.9％，阴性血清的od
450
值变异系数为4.0％(见表7)。
[0106]
表7炭疽杆菌pa-lf融合蛋白间接elisa重复性试验结果
[0107][0108]
批内及批间试验的结果表明，本发明建立的elisa检测盒具有较好的重复性。
[0109]
实施例5
[0110]
elisa试剂盒的敏感性试验
[0111]
将3份绵羊炭疽阳性血清从1：200开始进行倍比稀释，得到6个稀释度，利用建立好的eli sa试剂盒进行检测，并设阴阳性对照。测定od
450
值，计算出s/p值，分析其敏感性。
[0112]
结果：本次试验阴阳性对照的od
450
值分别为0.0875和0.862，分别计算3份阳性血清在各稀释度下的s/p值。结果表明阳性血清1、2在1：1600时变为阴性，阳性血清3在1：3200时变为阴性，说明该试剂盒具有较好的敏感性，结果见表8。
[0113]
表8炭疽pa-lf融合间接elisa敏感性试验结果
[0114][0115]
实施例6
[0116]
利用elisa试剂盒特异性检测
[0117]
利用已建立好的间接elisa检测方法对绵羊产气荚膜梭菌病抗体、绵羊腐败梭菌α毒素抗体、绵羊蜡样芽孢杆菌肠毒素抗体进行检测，并设阴性对照，本次试验阴性对照od
450
值为0.112。结果表明，这三种血清均为阴性(见表9)，说明该间接elisa检测方法具有较好的特异性。
[0118]
表9炭疽pa-lf融合间接elisa特异性试验结果
[0119][0120]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种炭疽杆菌pa-lf融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq id no:1所示。2.权利要求1所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白在制备诊断炭疽或检测炭疽杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述炭疽杆菌抗体为机体经人工免疫产生的抗体。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述人工免疫的疫苗包括ⅱ号炭疽芽孢苗和/或无荚膜炭疽芽孢苗。5.根据权利要求2～4中任意一项所述应用，其特征在于，所述试剂盒包括以下至少一种：elisa试剂盒、免疫层析试剂盒和免疫磁珠试剂盒。6.一种检测炭疽杆菌抗体的elisa试剂盒，其特征在于，包括以下组成：包被有权利要求1所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的检测板和酶标记的igg抗体。7.根据权利要求6所述elisa试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的浓度包括3～5μg/ml。8.根据权利要求6所述elisa试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌pa-lf融合蛋白的包被液为ph值7.3～7.5的pbs缓冲液；所述包被的方法为36.8～37.2℃下孵育110～130min。9.根据权利要求8所述elisa试剂盒，其特征在于，所述包被后，还包括对检测板进行封闭；所述封闭用封闭液为含质量百分含量4％～6％脱脂奶粉的pbs缓冲液。10.根据权利要求6～9中任意一项所述elisa试剂盒，其特征在于，还包括以下至少一种试剂：洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液、阴性血清和阳性血清。

技术总结
本发明提供了一种炭疽杆菌PA-LF融合蛋白、ELISA试剂盒和应用，属于体外诊断技术领域。本发明提供了一种炭疽杆菌PA-LF融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将LF结构域1与PA结构域2-4融合，与全长LF结构域相比，不仅不会影响PA与抗体的结合，而且具有较高的安全性，另外，LF结构域1与PA融合还能识别并结合针对LF蛋白的特异性抗体，大大增加了检测的准确性的同时还降低了检测成本提高检测效率。此外，本发明还提供了以所述PA-LF融合蛋白作为包被抗原制备ELISA试剂盒，用于炭疽杆菌抗体的检测中，为炭疽疫苗免疫动物后的抗体检测提供支持，为炭疽疫苗的免疫程序提供理论依据。依据。


技术研发人员：马勋 王静 薄新文 吕双飞 刘彩霞 寇丽君 史唯地 任慧杰 钱瑞宣
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/9/11