一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法与流程

1.本发明涉及一种发酵液的制备，特别是涉及一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法。


背景技术：

2.梅花(mume flos)是蔷薇科杏属植物，含有丰富的挥发油类、黄酮类以及苯丙素类，其中绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷是梅花指标性成分；梅花也是我国的传统药材，大量药理学研究表明，梅花具有抗炎、抗抑郁、抗氧化清除自由基和抑制黑色素生成的作用。在化妆品行业中，梅花提取物和梅花发酵液的功效主要围绕抗氧化、美白、抗炎等；陶宇等发明的一种青梅花的发酵提取工艺(cn109806204a)，先利用明串珠菌发酵再酶解得到的发酵液具有美白和抗氧化功效；朱月星等发明的一种蔷薇属植物发酵液及其制备方法、组合物及应用(cn114366703a)，利用曲霉和酵母发酵得到的发酵液具有显著的美白、保湿、抗氧化和抗衰老功效。
3.香橼为芸香科植物枸橼(citrus medica l.)、香圆(citrus wilsonii tanaka)的干燥成熟果实，含有丰富的挥发油类、黄酮类化合物、香豆素类化合物、生物碱类化合物、萜类化合物等；其药理活性主要是抗氧化、抗炎、抗过敏、抗菌、抗肿瘤等。
4.有鉴于此，本案发明人进行深入研究，遂有本案的产生。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于一种能显著提升皮肤屏障能力的梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法。
6.为了达成上述目的，本发明的技术方案是：
7.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)烘干研磨
9.将新鲜梅花、香橼采摘洗干净后，进行烘干，烘干后用粉碎机进行研磨成粉，得到梅花粉末和香橼粉末；
10.(2)酶解
11.使用复合酶对步骤(1)得到的梅花粉末进行酶解，得到梅花酶解液；
12.(3)离心过滤
13.将步骤(2)得到的梅花提取液进行离心，取上清液、过滤，得到梅花粗提取物，为后续的发酵备用；
14.(4)菌株种子液的制备
15.将东方伊萨酵母转接到培养基中，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转接到培养基，得到植物乳杆菌种子培养液；
16.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
17.将步骤(3)得到的梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml，
115℃灭菌20分钟；
18.(6)梅花香橼双菌发酵液的制备
19.将步骤(4)活化好的酵母种子液按1％-3％接种量添加于步骤(5)的培养基中培养进行一次发酵，得到第一发酵液，再将步骤(4)活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％-3％接种量添加于第一发酵液中培养进行二次发酵，得到第二发酵液，再将第二发酵液进行灭菌和离心，最后取离心后的上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
20.进一步地，步骤(6)中，东方伊萨酵母种子培养液的接种量为1％，植物乳杆菌种子培养液的接种量为2％。
21.进一步地，步骤(2)中，以梅花粉末的质量为参考，复合酶包括3％及以上的纤维素酶、3％及以上的果胶酶、以及1.5％及以上的中性蛋白酶。
22.进一步地，步骤(2)中，称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活，得到梅花酶解液。
23.进一步地，步骤(6)中，将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h，得到第一发酵液；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％接种量加到第一发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h，得到第二发酵也；所得第二发酵液于100℃灭菌30分钟，再于转速为9000r/min、时间为20min的条件下离心，最后取出上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
24.进一步地，步骤(4)中，将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
25.采用上述技术方案后，本发明一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，具有以下有益效果：
26.本发明利用梅花酶解液与香橼组合，先在东方伊萨酵母的一次发酵后再利用植物乳酸杆菌进行二次发酵；其优点在于与直接利用梅花发酵相比，利用梅花酶解液发酵能提高皮肤角质形成细胞的增殖率，这对皮肤屏障的提升非常重要；同时，提升皮肤屏障功效与丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1的表达水平紧密相关；通过实验发现选择东方伊萨酵母比选择酿酒酵母更能促进丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1的表达水平，且炎症因子tnf-α的含量更低；当东方伊萨酵母发酵完后再次用植物乳酸杆菌发酵，发现丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1的表达水平比只用东方伊萨酵母发酵更高，且炎症因子tnf-α的含量更低，因此选择东方伊萨酵母和植物乳酸杆菌发酵产生的发酵液具有比较显著的提升皮肤屏障的功效，而这种功效是梅花或者香橼单独发酵所没有的，同时也具有比较显著的抗炎功效。
具体实施方式
27.为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
28.一、相关制备
29.实施例1
30.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
31.(1)烘干研磨
32.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，得到梅花粉末和香橼粉末，分别装于相应的塑封袋内备用；
33.(2)酶解
34.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，以酶解体系总质量为参考，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活，得到梅花酶解液；
35.(3)离心过滤
36.将步骤(2)得到的梅花酶解液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用。
37.(4)菌株种子液的制备
38.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
39.需要说明的是，本发明中，ypd培养基和mrs培养基均为公知的培养基，在此不予详述。
40.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
41.将梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
42.(6)梅花香橼双菌发酵液的制备
43.将步骤(4)活化好的东方伊萨酵母种子液按1％(以步骤4的相应培养基体积为参考)接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h，得到第一发酵液；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按2％(以步骤4的相应培养基体积为参考)接种量加到第一发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h，得到第二发酵液；所得第二发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
44.实施例2
45.本实施例与实施例1的主要主要区别在于梅花粗提取物的处理，省略如实施例1的酶解相关步骤(步骤2、步骤3)。
46.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
47.(1)烘干研磨
48.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，得到梅花粉末和香橼粉末，分别装于相应的塑封袋内备用。
49.(2)菌株种子液的制备
50.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
51.(3)梅花香橼发酵培养基的制备
52.将梅花粉末1g，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
53.(4)梅花香橼双菌发酵液的制备
54.将步骤(2)活化好的东方伊萨酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按2％接种量加到发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
55.实施例3
56.本实施例与实施例1的主要主要区别在于梅花粗提取物的处理，省略如实施例1的酶解相关步骤(步骤2、步骤3)。
57.本实施例与实施例2的主要区别在于梅花香橼发酵培养基的配方。
58.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
59.(1)烘干研磨
60.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，得到梅花粉末和香橼粉末，分别装于相应的塑封袋内备用
61.(2)菌株种子液的制备
62.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
63.(3)梅花香橼发酵培养基的制备
64.将梅花粉末2g，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
65.(4)梅花香橼双菌发酵液的制备
66.将步骤(2)活化好的东方伊萨酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按2％接种量加到发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
67.实施例4
68.本实施例与实施例1的主要区别在于步骤(5)梅花香橼发酵培养基的配方(梅花粗提取物的用量不同)。
69.本实施例中，步骤(5)梅花香橼发酵培养基的制备方法如下：将梅花粗提取物15ml，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
70.实施例5
71.本实施例与实施例1的主要区别在于：步骤(5)梅花香橼发酵培养基的配方(梅花粗提取物含量和香橼粉末)。
72.本实施利与实施利4的主要区别在于：步骤(5)梅花香橼发酵培养基中香橼粉末的含量。
73.本实施例中，步骤(5)梅花香橼发酵培养基的制备方法如下：将梅花粗提取物15ml，香橼粉末1g和葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
74.实施例6
75.本实施例与实施例1的主要区别在于菌株种子液的相关制备(东方伊萨酵母单一菌株种子)。
76.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
77.(1)烘干研磨
78.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，得到梅花粉末和香橼粉末，分别装于相应的塑封袋内备用
79.(2)酶解
80.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活。
81.(3)离心过滤
82.将上述实验得到的梅花提取液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用。
83.(4)菌株种子液的制备
84.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨种子培养液。
85.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
86.梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g，葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
87.(6)梅花香橼发酵液的制备
88.将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼发酵液。
89.实施例7
90.本实施例与实施例1的主要区别在于菌株种子液的相关制备(植物乳杆菌单一菌株种子)。
91.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
92.(1)烘干研磨
93.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，分别装于相应的塑封袋内备用
94.(2)酶解
95.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活。
96.(3)离心过滤
97.将上述得到的梅花提取液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用。
98.(4)菌株种子液的制备
99.将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
100.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
101.梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g，葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
102.(6)梅花香橼发酵液的制备
103.将活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％接种量加到上述培养基中，于37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼发酵液。
104.实施例8
105.本实施例与实施例1的主要区别在于梅花香橼双菌发酵液的菌株接种量的区别。
106.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
107.(1)采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，分别装于相应塑封袋内备用。
108.(2)酶解
109.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活。
110.(3)离心过滤
111.将上述实验得到的梅花提取液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用。
112.(4)菌株种子液的制备
113.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。
114.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
115.梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g，葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
116.(6)梅花香橼双菌发酵液的制备
117.将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％接种量加到发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
118.实施例9
119.本实施例与实施例1的主要区别在于菌种种子液中菌株的区别(添加酿酒酵母替换东方伊萨酵母作为对比)。
120.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
121.(1)烘干研磨
122.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后分别用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，分别装于相应的塑封袋内备用；
123.(2)酶解
124.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下
10min灭酶活；
125.(3)离心过滤
126.将上述实验得到的梅花提取液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用；
127.(4)菌株种子液的制备
128.将酿酒酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到酿酒种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液；
129.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
130.梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g，葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟；
131.(6)梅花香橼双菌发酵液的制备
132.将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％接种量加到发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
133.实施例10
134.本实施例与实施例1的主要区别在于菌种种子液中菌株的区别(添加类干酪乳酪杆菌替换植物乳杆菌作为对比)。
135.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：
136.(1)烘干研磨
137.采摘新鲜梅花、香橼洗干净后置于鼓风干燥箱中，干燥条件为40℃，时间为72h，烘干后用粉碎机进行研磨成粉，再过60目筛，分别装于塑封袋内备用
138.(2)酶解
139.精准称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活。
140.(3)离心过滤
141.将上述实验得到的梅花提取液进行离心，转速为9000转每分、时间为20min，取上清液，用八层纱布进行过滤，得到更为澄清的的提取液，即为梅花粗提取物，为后续的发酵备用。
142.(4)菌株种子液的制备
143.将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨种子培养液；将类干酪乳酪杆菌转接到到mrs培养基，转接两次，得到类干酪乳酪杆菌种子培养液。
144.(5)梅花香橼发酵培养基的制备
145.梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g，葡萄糖1g，加水定容到100ml,115℃灭菌20分钟。
146.(6)梅花香橼双菌发酵液的制备
147.将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h；再将活化好的类干酪乳酪杆菌种子培养液按1％接种量加到发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h；所得发酵液于100℃灭菌30分
钟，再转速为9000转每分、时间为20min条件下离心，最后取上清液即为梅花香橼双菌发酵液。
148.二、相关发酵液对皮肤屏障能力提升的研究测试
149.测试方法：
150.1.发酵液对细胞增殖活力影响的测定
151.cck8法测试细胞增殖活力具有重复性好，对细胞毒性小等优点。取传代4-5代的处于对数生长期的hacat细胞，细胞密度为4x104个/ml，接种于96孔板中，在37℃5％ co2条件下培养12h左右，再加入10％培养液体积的已配好浓度的发酵液，等样品与细胞作用24h后，再加入10％的cck8试剂，细胞培养箱中孵育2小时左右，最后在酶标仪上测定450nm下的吸光值，每个浓度重复5次。细胞增殖率计算方法按如下公式：
[0152][0153]
2.荧光定量pcr检测filaggrin、tnf-α、lor、claudin-1的mrna表达水平利用rnaiso提取细胞六孔板中的角质形成细胞的总rna，然后采用primescript
tm
rt reagent kit把总rna逆转成cdna，加入sybr试剂、基因引物以及基因模板后，进行实时荧光定量pcr反应，反应程序为两步法，具体程序如下：预变性95℃30s；pcr反应95℃5s，60℃30s 40次循环。
[0154]
引物序列如下：
[0155]
actin-f:gttggacctgacagactacctca；
[0156]
actin-r:gttgccaatagtgatgacct；
[0157]
filaggrin-f:ggacaggaacaatcatcgggg；
[0158]
filaggrin-r:caacctctcggagtcgtctg；
[0159]
tnf-α-f:gaggccaagccctggtatg；
[0160]
tnf-α-r:cgggccgattgatctcagc.
[0161]
lor-f:caggtcactcagacctcgt；
[0162]
lor-r:fcctccagaggaaccacct；
[0163]
claudin-1-f:ccatctttgtggccaccgtt；
[0164]
claudin-1-r:ccattcgcatcttctgtgcc。
[0165]
实验结果：
[0166][0167][0168]
注：百分数代表与空白对照组(不加任何发酵液的细胞培养组)的比较，超过百分百代表发酵液能促进该基因的表达，低于百分百代表发酵液抑制该基因的表达。
[0169]
由上表可知：梅花酶解复配香橼先经过东方伊萨酵母发酵再经过植物乳酸杆菌发酵得到的发酵液能明显提高角质形成细胞的增殖率，对丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1基因的表达水平有明显的促进作用，同时也能明显降低细胞上清液中炎症因子tnf-α的含量。如果没有对梅花先进行酶解，而直接进行发酵，得到的发酵液对细胞增殖率有较大的影响，推测对皮肤会有较大的刺激性。如果仅采用东方伊萨酵母或植物乳酸杆菌单一菌株发酵、用酿酒酵母替换东方伊萨酵母或者类干酪乳酪杆菌替换植物乳酸杆菌进行双菌株发酵得到的发酵液对丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1基因的表达水平的促进作用都有比较大的减弱，同时抗炎效果也比较差。因此，梅花酶解后与香橼复配先经过东方伊萨酵母发酵再经过植物乳酸杆菌发酵得到的发酵液能明显提高角质形成细胞的增殖率，明显促进丝聚合蛋白、兜甲蛋白、封闭蛋白1基因的表达水平，同时也明显降低细胞上清液中炎症因子tnf-α的含量，从而提升皮肤的屏障功效和抗炎功效。
[0170]
从实施例4与实施例1的对比数据可知，当梅花粗提取物的添加量达到10ml时，对hacat细胞增殖率具有明显的促进作用；当梅花粗提取物的添加量达到15ml时，对hacat细胞增殖率具有明显的抑制作用，可见梅花粗提取物的添加量并非越多越好。
[0171]
上述实施例并非限定本发明的方法，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

技术特征：
1.一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)烘干研磨将新鲜梅花、香橼采摘洗干净后，进行烘干，烘干后用粉碎机进行研磨成粉，得到梅花粉末和香橼粉末；(2)酶解使用复合酶对步骤(1)得到的梅花粉末进行酶解，得到梅花酶解液；(3)离心过滤将步骤(2)得到的梅花提取液进行离心，取上清液、过滤，得到梅花粗提取物，为后续的发酵备用；(4)菌株种子液的制备将东方伊萨酵母转接到培养基中，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转接到培养基，得到植物乳杆菌种子培养液；(5)梅花香橼发酵培养基的制备将步骤(3)得到的梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml，115℃灭菌20分钟；(6)梅花香橼双菌发酵液的制备以步骤(4)的相应培养基体积为参考，将步骤(4)活化好的酵母种子液按1％-3％接种量添加于步骤(5)的培养基中培养进行一次发酵，得到第一发酵液，再将步骤(4)活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％-3％接种量添加于第一发酵液中培养进行二次发酵，得到第二发酵液，再将第二发酵液进行灭菌和离心，最后取离心后的上清液即为梅花香橼双菌发酵液。2.如权利要求1所述的一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，东方伊萨酵母种子培养液的接种量为1％，植物乳杆菌种子培养液的接种量为2％。3.如权利要求1所述的一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，以酶解体系的总质量为参考，复合酶包括3％及以上的纤维素酶、3％及以上的果胶酶、以及1.5％及以上的中性蛋白酶。4.如权利要求1所述的一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，称取10g梅花粉末于烧杯中，加入100ml蒸馏水，调节ph值到5.5，以酶解体系总质量为参考，再加入质量分数为4％的纤维素酶、4％果胶酶、2％中性蛋白酶，酶解时间为2h，接下来在100℃条件下10min灭酶活，得到梅花酶解液。5.如权利要求1所述的一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，将活化好的酵母种子液按1％接种量加到上述培养基中，于28℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养24h，得到第一发酵液；再将活化好的植物乳杆菌种子培养液按1％接种量加到第一发酵液中，在37℃、转速180r/min条件下，恒温摇床中培养12h，得到第二发酵也；所得第二发酵液于100℃灭菌30分钟，再于转速为9000r/min、时间为20min的条件下离心，最后取出上清液即为梅花香橼双菌发酵液。6.如权利要求1所述的一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，将东方伊萨酵母转接到ypd培养基中，转接两次，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转到到mrs培养基，转接两次，得到植物乳杆菌种子培养液。

技术总结
本发明公开了一种梅花香橼双菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：将新鲜梅花、香橼采摘清洗、烘干后用粉碎机进行研磨成粉，使用复合酶对梅花粉末进行酶解，得到梅花酶解液；将梅花提取液进行离心，取上清液、过滤，得到梅花粗提取物；将东方伊萨酵母转接到培养基中，得到东方伊萨酵母种子培养液；将植物乳杆菌转接到培养基，得到植物乳杆菌种子培养液；取梅花粗提取物10ml，香橼粉末2g和葡萄糖1g，加水定容到100ml，灭菌；酵母种子液添加于培养基中培养进行一次发酵，再将植物乳杆菌种子培养液添加于第一发酵液中培养进行二次发酵，再将第二发酵液进行灭菌和离心，最后取离心后的上清液即为梅花香橼双菌发酵液。制得的梅花香橼双菌发酵液能显著提升皮肤屏障能力。发酵液能显著提升皮肤屏障能力。


技术研发人员：陈志雄 曹平 王云婷 王雨彤
受保护的技术使用者：湖州嘉亨实业有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/9/11