一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法

1.本发明属于微生物体外发酵技术领域，具体涉及一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法。


背景技术：

2.肠道作为人体最大的“微生物发酵池”，能通过营养消化和微生物代谢提供机体所需能量，是人体营养研究的重点。粪菌悬液体外模拟发酵是利用离体方法研究肠道微生物生长与代谢以及评定肠道菌群对营养物质利用效率的一门技术，具有试验周期短、重复率高、不依赖于活体动物、不存在伦理学负担等优点，是评价肠道菌群发酵代谢利用营养物质的重要技术手段，在营养学、微生物学等领域应用十分广泛。
3.目前，很多人在进行粪菌悬液体外发酵实验时，发现现有的体外发酵模拟装置(包括国外进口和国内生产)是以三角瓶或玻璃试管作为培养瓶，盖上橡胶塞使之密闭，直接将带有针头的注射器穿透橡胶塞从而连通注射器和培养瓶，通过产生气体推动注射器推拉塞来测量气体体积，此方法虽简便，但存在如下不足：
4.1.注射器管壁与推拉塞之间存在较大摩擦力，发酵所产气体往往难以推动拉塞，且在具体使用的过程中，即使涂抹润滑油也很难准确测量真实产气量，造成明显的试验结果误差；
5.2.发酵瓶处于静置状态，发酵液未搅拌很难发酵彻底；
6.3.传统装置作用单一，只能测定产气体积，未考虑设计产气收集装置。
7.这种设备及产气量测定方法在国内外使用的很多，针对这些问题，目前尚未提出一种较好的解决方式，因此本发明设计一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法。


技术实现要素：

8.【要解决的技术问题】
9.本发明专利要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种结构简单、操作方便、封闭性好、测定准确、便于气体测量和收集的粪菌悬液体外发酵装置及其使用方法。
10.【技术方案】
11.本发明是通过下述技术方案实现的。
12.一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法，包括带有磁力搅拌的恒温水浴锅1及其上部放置的用于给肠道微生物生长的发酵瓶2，所述的发酵瓶顶部安装了插入导气玻璃管4的硅胶塞3，所述的硅胶塞上方连有开关阀5和连接胶管6，并通过连接胶管6连接至三通阀7。
13.优选的，所述的三通阀7上端通大气，右端则通过玻璃导管与三通阀8相连接。
14.优选的，所述的三通阀8左边通过玻璃导管连接至三通阀7，上端连接注射器9和下端连接收集瓶11，所述的注射器带有推拉塞和刻度，其推拉塞移动的体积可反应气体产生
体积量的具体数值。
15.优选的，所述的收集瓶上端和下端分别装有控制开关10和12，其底部则通过连接胶管呈u形连接至水准缓冲瓶13，所述的收集瓶便于发酵结束时控制开关进行气体收集。
16.优选的，所述的水准缓冲瓶13连通外界大气，可用作管路中溶液的加入口。
17.优选的，所述的体外发酵产气组分一般为氢气(h2)、二氧化碳(co2)、硫化氢(h2s)和甲烷(ch4)，h2和ch4不能被水吸收，co2在常温常压条件下也难以被水吸收，但是h2s较易溶于水，因此如果水准缓冲瓶与收集瓶中装入水，发酵产生的气体就会有一部分被其吸收，从而无法精确测量气体的产生量。
18.优选的，所述的水准缓冲瓶与收集瓶中的置换溶液采用惰性液体甲基硅油，能有效避免体外发酵所产气体被置换溶液吸收。
19.优选的，所述的测量装置工作过程中，恒温水浴锅的温度为37℃，也即发酵瓶内的发酵温度为37℃，其外部连接的测量装置和收集装置则为常温。
20.【有益效果】
21.1.本发明是基于大气压原理设计的产气测量和收集装置，具体实施时，体外发酵产气使管路产生正压后，通过调节三通阀连通注射器和管路，管路中的正向压力随即在大气压力下流至注射器中，使得收集瓶一侧的液面回到初始位置，从而保证此刻水准瓶一侧液面所受压力与发酵前管路液面所受大气压力相等，此时注射器中推拉塞移动的体积即为产气体积，这一特征可确保产气测量的准确性，且管路气密性好，测量准确方便，有效避免实验误差。
22.2.本发明的设计产气测量收集装置在发酵结束时，能通过调节三通阀连通注射器和收集瓶，推动注射器中的气体几乎全部进入收集瓶中而实现产气收集，这一特征优于传统装置测定产气体积的单一作用，非常便于进一步将收集到的气体开展进一步深入研究，且产气收集的无缝衔接能大大提高产气收集的效率。
附图说明
23.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
24.图1是本发明实施例提供的一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置的结构示意图；
25.图2是某国外进口的体外发酵实验装置中发酵瓶上插注射器的传统方法实物图；
26.图3是利用传统法和本发明设计法所测粪菌悬液体外发酵产气量的比较，control表示某国外进口的体外发酵实验装置中发酵瓶上插注射器的传统方法组，design表示本发明设计的产气量测定装置组；
27.附图标记：恒温水浴锅1、发酵瓶2、硅胶塞3、导气管4、开关阀5、10和12、连接胶管6、三通阀7和8、注射器9、收集瓶11、水准缓冲瓶13。
具体实施方式
28.通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
29.实施例1：粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置
30.如图1所示，一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法，包括带有磁力搅拌的恒温水浴锅1及其上部放置的用于给肠道微生物生长的发酵瓶2，所述的发酵瓶顶部安装了插入导气玻璃管4的硅胶塞3，所述的硅胶塞上方连有开关阀5和连接胶管6，并通过连接胶管6连接至三通阀7。
31.进一步的，所述的三通阀7上端通外界大气，右端则通过玻璃导管与三通阀8相连接，调节三通阀7可使管路装置通外界大气，从而调节收集瓶一侧的液面与水准缓冲瓶一侧的液面等高，从而形成一条水平基准线(见图1)。
32.进一步的，所述的三通阀8左边通过玻璃导管连接至三通阀7，上端连接注射器9和下端连接收集瓶11，所述的注射器带有推拉塞和刻度，其推拉塞移动的体积可反应气体产生体积量。
33.进一步的，所述的收集瓶上端和下端皆装有控制开关10和12，其底部则通过连接胶管呈u形连接至水准缓冲瓶13，所述的收集瓶便于发酵结束时控制开关进行气体收集。
34.进一步的，所述的水准缓冲瓶13连通外界大气，可用作管路中置换溶液的加入口。
35.进一步的，所述的体外发酵产气的组分一般为氢气、二氧化碳、硫化氢和甲烷，氢气和甲烷不能被水吸收，二氧化碳在常温常压条件下也难以被水吸收，但是硫化氢较容易溶于水，导致水准缓冲瓶与收集瓶中装入水无法准确反应气体产生量。
36.进一步的，所述的水准缓冲瓶与收集瓶中的置换溶液采用惰性液体硅油，能有效避免体外发酵所产气体被置换溶液吸收。
37.进一步的，所述的测量装置过程中，恒温水浴锅的温度为37℃，也即发酵瓶内的发酵温度为37℃，其外部连接的测量装置和收集装置则为常温。
38.本技术实施例一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法的实施原理为：在粪菌悬液体外发酵试验时，将配置好的液体培养基放入到发酵瓶2中，进行高压蒸汽灭菌，条件为121℃下灭菌20min，待其冷却后放入无菌磁力转子，在厌氧工作站内按10％(v/v)的量接种粪菌悬液，盖上橡胶塞3并关闭开关阀5使发酵瓶2内处于厌氧环境，然后将发酵瓶2放入预热至37℃的恒温水浴锅1内，并连接管路各个位置，旋转三通阀7使装置通外界大气，将甲基硅油从水准缓冲瓶13处注入，使得收集瓶一侧的甲基硅油溶液液面与水准缓冲瓶一侧的液面等高并记录其初始液面位置，同时将注射器推拉塞移动至0刻度并记录位置。随后旋转三通阀7和三通阀8使管路密闭，然后打开开关阀5，使得粪菌微生物在磁力搅拌情况下模拟人体大肠环境进行发酵，持续时间为24～48h，每3h为一个测量时间点。测量时，调节三通阀8连通上部注射器和下部收集瓶，使注射器中的推拉塞在大气压力或人为拉力下上移，直至收集瓶一侧的液面达到初始水准液面，此时两端又回到发酵初始时期的压力下，此时注射器中推拉塞移动所增加空间的体积则为发酵所产气体量。待一个取样点测完时，调节三通阀8连通发酵瓶端导气管和收集瓶端，等下一个测量时间点再进行上述相同操作即可。最后，在发酵结束时控制三通阀8连通上部注射器和下部收集瓶，将注射器中的气体尽可能多的推入收集瓶内，并关闭收集瓶上下部的开关阀达到密闭状态，取下收集瓶，实现气体计量、收集、化验的无缝衔接。
39.实施例2：粪菌悬液体外发酵产气测定及气体的收集
40.步骤1：将磷酸盐缓冲液在121℃下灭菌20min，然后加入l-半胱氨酸盐酸盐(0.5g/l)作为还原剂，并注入氮气以驱除氧气。在厌氧工作站中，将冻存的粪便样品解冻并与无菌
的磷酸盐缓冲液按10％(w/v)混合均匀，随后将混合液倒入4层无菌纱布进行过滤，收集过滤液作为粪菌悬液接种液备用。
41.步骤2：配制好基础营养培养基，将其加入发酵瓶中，在121℃下灭菌20min，待其冷却后放进厌氧工作站，将接种液按10％(v/v)的比例接种进发酵瓶中，盖上橡胶塞并关闭开关阀5，将发酵瓶放入预热至37℃的恒温水浴锅中。
42.步骤3：连接管路，先调节三通阀7通大气，将甲基硅油从水准缓冲瓶13处注入，使收集瓶一侧和水准瓶一侧的液面等高并记录初始液面位置，同时将注射器推拉塞移动至0刻度并记录位置。随后旋转三通阀7和三通阀8使管路密闭，然后打开开关阀5，使得粪菌微生物在磁力搅拌情况下模拟人体大肠环境进行发酵。3h后，明显产气，打开三通阀8，注射器与收集瓶连通，注射器推拉塞上移的体积即为体外发酵3h所产气体体积量。测量好后再次调节三通阀8连通发酵瓶和收集瓶，继续测量后续时间的产气量。厌氧发酵实验在37℃条件下进行48h，分别在3/6/9/12/24/36/48小时处测量产气体积，每组三个重复，称为设计组(design)。同时，采用某国外进口的体外发酵实验装置中发酵瓶上插注射器的传统方法设置对照实验(control)，具体为采用等体积发酵液的玻璃瓶，瓶口通气口处用橡胶塞按压密封，并在橡胶塞中插入注射器，产生气体推动注射器变化的体积即为产气量(见图2)。
43.步骤4：待发酵结束时将注射器内的气体尽可能多的推入收集瓶中，关闭收集瓶上下端的开关，收集所产气体。
44.实验结果如图3所示，使用本发明装置测得48h体外发酵累积产气平均值为22.9ml，而对照组则因为注射器管壁摩擦力过大导致测量失败，无法准确有效的在不同体外发酵时段或者整个体外发酵周期进行产气体积测量，表明本装置与传统的厌氧发酵装置相比，能有效避免因装置造成的测量误差，获得了更准确的产气测定结果。
45.以上显示和描述了本发明专利的基本原理、主要特征、使用方法和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明专利不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明专利的原理，在不脱离本发明专利精神和范围的前提下，本发明专利还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明专利范围内。本发明专利要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置，其特征在于，所述的装置包括：带有磁力搅拌的恒温水浴锅1及其上部的发酵瓶2，所述的发酵瓶顶部安装了插入导气玻璃管4的硅胶塞3，所述的硅胶塞上方连有开关阀5和连接胶管6，通过连接胶管6连接至三通阀7，所述的三通阀7上端通大气，右端则通过玻璃导管与三通阀8相连接，所述的三通阀8上端连接注射器9和下端连接收集瓶11，所述的收集瓶上端和下端皆装有开关阀10和12，其底部则通过连接胶管呈u形连接至水平基准缓冲瓶13。2.根据权利要求1所述的粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置在产气体积测量及产气收集方面的使用方法。

技术总结
本发明公开一种粪菌悬液体外发酵产气测量收集装置及其使用方法，属于微生物发酵工程领域，包括恒温水浴锅、发酵瓶、三通阀、注射器、控制开关、收集瓶和水准缓冲瓶，所述的恒温水浴锅带有磁力搅拌，所述的发酵瓶上端通过玻璃导管和胶管连接至两个三通阀，所述的左侧三通阀连通管路和外界大气，所述的右侧三通阀上端连接注射器、下端连接收集瓶，所述的收集瓶上、下两端皆有控制开关，所述的水准缓冲瓶通过胶管呈U形连接至收集瓶，本发明装置可用于微生物体外发酵实验时产气量的准确测定及所产气体的收集，其产气测量能有效避免测量装置造成的实验误差，并大大提高待测气体样本的收集效率。率。率。


技术研发人员：李全阳 张钦任 周玉盼 宋瑶
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/9/11