D-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备L-正缬氨酸的方法与流程

d-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备l-正缬氨酸的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及d-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备l-正缬氨酸的方法。


背景技术：

2.l-正缬氨酸(l-norvaline)是一种非蛋白质支链氨基酸，作为许多药物合成的前体物质，其在制药行业具有非常广泛的应用。培哚普利，作为一种治疗高血压和心力衰竭的有效药物，就是通过以l-正缬氨酸为重要中间体而合成。
3.现有合成l-正缬氨酸的方法有化学法和生物酶法，化学法如专利cn202111031517.3中采用有机合成dl-正缬氨酸后进行酒石酸拆分，最终收率只有36％。还有直接采用dl-正缬氨酸为原料使用酒石酸进行拆分，收率83％，化学法普遍污染较大，且成本较高等缺点。现有技术中生物酶法包括cn202110276664.0采用戊内酰胺盐酸盐为底物，经过水解酶、消旋酶催化制备l-正缬氨酸，原料不易得，不适合工业化生产，在文献《多酶催化拆分dl-正缬氨酸生产l-正缬氨酸》中采用多酶催化，转化率可达96％，但底物浓度最高只有65g/l左右，生产效率低下。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供d-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备l-正缬氨酸的方法，以改善上述问题。
6.本发明是这样实现的：
7.第一方面，本发明提供了一种d-氨基酸氧化酶，该d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.第二方面，本发明还提供了一种核酸分子，其用于编码上述d-氨基酸氧化酶，可选地，该核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.第三方面，本发明还提供了上述d-氨基酸氧化酶在酶法制备l-正缬氨酸中的应用。
10.第四方面，本发明还提供了一种酶法制备l-正缬氨酸的方法，其包括：向底物中添加上述d-氨基酸氧化酶，以及过氧化氢酶，进行氧化反应；氧化反应后向反应体系中加入异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶以及异丙醇，用氨水调节ph，并加入醋酸锌和nad
+
，进行脱氢反应；
11.上述底物为dl-正缬氨酸。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明为了采用酶法制备l-正缬氨酸，而提供了一种优化后的d-氨基酸氧化酶序列，该酶具有较高的活性和底物耐受度。并通过优化实验条件，确定最佳转化条件，通过该方法能够提高转化率，进而提高生产效率；并且使用该方法的污染小，对环境更友好；同时
原料易得，不仅能够降低生产成本，还有利于大规模应用。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
15.图1为本发明的酶法制备l-正缬氨酸的流程图；
16.图2为实施例1中目标产物的高效液相色谱检测图。
具体实施方式
17.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
18.本发明提供了一种d-氨基酸氧化酶，该d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
19.本发明还提供了一种核酸分子，其用于编码上述d-氨基酸氧化酶，该核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。通过上述核酸分子可以通过现有基因工程的方法编码得到上述d-氨基酸氧化酶。
20.本发明还提供了上述d-氨基酸氧化酶在酶法制备l-正缬氨酸中的应用。
21.利用上述d-氨基酸氧化酶制备l-正缬氨酸的方法包括：以d l-正缬氨酸为底物，加入上述d-氨基酸氧化酶，以及过氧化氢酶，进行氧化反应；氧化反应后向反应体系中加入异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶以及异丙醇，用氨水调节ph，并加入醋酸锌和nad
+
，进行脱氢反应；在脱氢反应完成后对获得的反应液进行过滤、两次浓缩和干燥，即得到所述l-正缬氨酸。具体制备流程如图1所示。
22.上述制备方法的合成路线为：
[0023][0024]
为了获得更高的转化率，发明人对制备过程中的原料、酶及其配比、反应条件进行
优化。通过选择特定的原料、酶及其配比，以及一定范围内的反应温度、ph等，能够使反应更充分，进而获得更高的转化率以及更纯的目标产物。
[0025]
在一些实施例中，底物在反应体系中的浓度50-300g/l时均可以将d l-正缬氨酸转化为l-正缬氨酸。具体地，底物在反应体系中的浓度可以为50g/l、100g/l、150g/l、200g/l、250g/l或300g/l，也可以是50-300g/l之间的任意数值。优选地，底物在反应体系中的浓度为100-250g/l；更优选地，底物在反应体系中的浓度为125-250g/l。
[0026]
在一些实施例中，底物与d-氨基酸氧化酶质量比为1：0.2-0.4时均具有较好的转化率。具体地，底物与d-氨基酸氧化酶质量比可以为1：0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35或1:0.4，也可以是1：0.2-0.4之间的任意数值。优选地，底物与d-氨基酸氧化酶质量比＝1：0.2-0.3；更优选地，底物与d-氨基酸氧化酶质量比＝1：0.25-0.3。
[0027]
在一些实施例中，过氧化氢酶的添加量为反应体系的0.5-9vt％时具有较好的转化率。具体地，过氧化氢酶的添加量可以为0.5vt％、1vt％、2vt％、2.5vt％、3.5vt％、4vt％、5.5vt％、6vt％、8vt％或9vt％，也可以是0.5-9vt％之间的任意数值。优选地，过氧化氢酶的添加量为反应体系的1-8vt％；更优选地，过氧化氢酶的添加量为反应体系的1-6vt％。
[0028]
在一些实施例中，底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：10％-30％：5％-25％：0.2％-0.6％：0.03％-0.05％时具有较好的转化率。具体地，底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比可以为1：10：5：0.2：0.03、1：15：10：0.3：0.035、1：20：15：0.4：0.04、1：25：20：0.5：0.045或1：30：25：0.6：0.05，也可以是1：10％-30％：5％-25％：0.2％-0.6％：0.03％-0.05％之间的任意数值。优选地，底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：15％-30％：10％-25％：0.3％-0.6％：0.035％-0.05％；更优选地，底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：20％-30％：15％-25％：0.4％-0.6％：0.04％-0.05％。
[0029]
在一些实施例中，氧化反应中反应体系的ph＝7-7.5，反应温度为28-32℃。具体地，氧化反应中反应体系的ph可以为7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，也可以为7-7.5中的任意数值。反应温度可以为28℃、29℃、30℃、31℃或30℃，也可以为28-32℃之间的任意数值。
[0030]
在一些实施例中，脱氢反应中反应体系的ph＝8-8.5，反应温度为36-38℃。具体地，脱氢反应中反应体系的ph可以为8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，也可以为8-8.5中的任意数值。反应温度可以为36℃、37℃或38℃，也可以为36-38℃之间的任意数值。
[0031]
在一些实施例中，在脱氢反应完成后对获得的反应液在进行过滤前需要将其酸碱度调节至ph＝1-2。具体地，反应液的酸碱度可以调节为ph＝1、1.1、1.3、1.5、1.8或2，也可以是1-2之间的任意数值。
[0032]
在一些实施例中，过滤的滤膜孔径为45-55nm，截留分子量为800-1200d时具有更好的过滤效果。具体地，滤膜孔径可以为45nm、50nm或55nm。截留分子量可以为800d、1000d或1200d。
[0033]
在一些实施例中，两次浓缩包括将过滤后的滤液浓缩到滤液体积的0.2-0.4，过滤获得第一次结晶，加入甲醇漂洗两次，收集结晶，继续浓缩到所述过滤后的滤液体积的0.1-0.2，过滤获得第二次结晶，加入甲醇漂洗两次，收集结晶。
[0034]
在一些实施例中，干燥上述过程中收集的结晶的温度为55-60℃。具体地，干燥温
度可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，也可以是55-60℃之间的任意数值。
[0035]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0036]
以下实施例中采用的d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0037]
实施例1
[0038]
本实施例提供一种酶法制备l-正缬氨酸的方法，其步骤如下：
[0039]
(1)氧化反应
[0040]
称取200克dl-正缬氨酸加入2l反应釜中，先加入400ml水搅拌，搅拌均匀后为混悬液，加水定容到700ml，然后用氨水溶液调ph值到7.5(氨水滴加约1ml)，升温到30℃，通入空气。称取40克d-氨基酸氧化酶，加水200ml悬浮后加入反应体系，加入过氧化氢酶40ml，反应体系用氨水调ph到7.5，加入1ml消泡剂，控温在30℃，过程控制ph＝7.5左右。反应中控，根据手性检测结果，期间补加d-氨基酸氧化酶，反应7-8小时后d-正缬氨酸完全反应,共补加d-氨基酸氧化酶20g，确定反应终点，升温到80℃，保温30分钟后，降温到37℃。
[0041]
(2)脱氢反应
[0042]
称取异丙醇脱氢酶40g，亮氨酸脱氢酶20g，加入80ml自来水悬浮，加入反应体系；量取异丙醇80ml加入反应体系，氨水调节ph＝8.5左右，称取醋酸锌0.05g，nad
+
0.05g加入反应釜中，通气控温37℃进行反应。反应中控，根据液相检测结果，脱氢反应完全后，停止反应。
[0043]
(3)产物提取
[0044]
将反应液调ph＝1-2，依次用50nm陶瓷膜过滤，1kd的超滤膜过滤,过滤完成后将滤液进行浓缩，温度为60℃，浓缩体积到300ml左右，过滤得到第一次结晶，加入20ml甲醇漂洗2次，收集结晶；继续浓缩到150ml左右，过滤得到第二次结晶，加入10ml甲醇漂洗2次，收集结晶，结晶60℃干燥，得产物186.4g，收率93.2％，手性纯度99.9％。
[0045]
如图2为本实施例的产物进行高效液相色谱检测的检测结果。其中，高效液相色谱检测的检测条件为：
[0046]
柱子：crownoak cr-i(+)(3.0*150mm，5um)；
[0047]
流速：0.2ml/min；波长：230nm；进样量：20μl；柱温：25℃；
[0048]
流动相：1000ml水用高氯酸调节ph至1.50
±
0.1，过滤并超声脱气。
[0049]
实施例2
[0050]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为50g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为0.5％。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为100g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为1％。
[0053]
实施例4
[0054]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为125g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为25％，过氧化氢酶占反应体系为2％。
[0055]
实施例5
[0056]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为150g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为25％，过氧化氢酶占反应体系为2.5％。
[0057]
实施例6
[0058]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为175g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为30％，过氧化氢酶占反应体系为3.5％。
[0059]
实施例7
[0060]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为200g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为30％，过氧化氢酶占反应体系为4％。
[0061]
实施例8
[0062]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为225g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为35％，过氧化氢酶占反应体系为5.5％。
[0063]
实施例9
[0064]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为250g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为35％，过氧化氢酶占反应体系为6％。
[0065]
实施例10
[0066]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为275g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为40％，过氧化氢酶占反应体系为8％。
[0067]
实施例11
[0068]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，dl-正缬氨酸的浓度为300g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为40％，过氧化氢酶占反应体系为9％。
[0069]
实施例12
[0070]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，异丙醇脱氢酶占底物质量为10％，亮氨酸脱氢酶占底物质量为5％，异丙醇占底物质量为0.2％，nad
+
占底物质量为0.03％。
[0071]
实施例13
[0072]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，异丙醇脱氢酶占底物质量为15％，亮氨酸脱氢酶占底物质量为10％，异丙醇占底物质量为0.3％，nad
+
占底物质量为0.035％。
[0073]
实施例14
[0074]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，异丙醇脱氢酶占底物质量为20％，亮氨酸脱氢酶占底物质量为15％，异丙醇占底物质量为0.4％，nad
+
占底物质量为0.04％。
[0075]
实施例15
[0076]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，异丙醇脱氢酶占底物质量为25％，亮氨酸脱氢酶占底物质量为20％，异丙醇占底物质量为0.5％，nad
+
占底物质量为0.045％。
[0077]
实施例16
[0078]
本实施例的制备方法同实施例1，区别在于，异丙醇脱氢酶占底物质量为30％，亮氨酸脱氢酶占底物质量为25％，异丙醇占底物质量为06％，nad
+
占底物质量为0.05％。
[0079]
对比例1
[0080]
与实施例1的区别在于，本对比例中采用的是序列优化前的d-氨基酸氧化酶，其核苷酸序列如seq id no.3所示。dl-正缬氨酸的浓度为25g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为0.25％。
[0081]
对比例2
[0082]
与实施例1的区别在于，本对比例中采用的是序列优化前的d-氨基酸氧化酶，其核
苷酸序列如seq id no.3所示。dl-正缬氨酸的浓度为50g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为0.5％。
[0083]
对比例3
[0084]
与实施例1的区别在于，本对比例中采用的是序列优化前的d-氨基酸氧化酶，其核苷酸序列如seq id no.3所示。dl-正缬氨酸的浓度为75g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为0.75％。
[0085]
对比例4
[0086]
与实施例1的区别在于，本对比例中采用的是序列优化前的d-氨基酸氧化酶，其核苷酸序列如seq id no.3所示。dl-正缬氨酸的浓度为100g/l，d-氨基酸氧化酶占底物质量为20％，过氧化氢酶占反应体系为1％。
[0087]
实验例1
[0088]
通过中控检测d-正氨基酸在实施例2-11的剩余量，检测结果如表1所示：
[0089]
表1不同底物浓度与酶的用量对氧化反应结果的影响结果
[0090][0091]
从表1的结果可以看出，采用本发明范围内的底物浓度与酶的用量均可以获得较高的转化率，其中当底物浓度在125-250g/l、d-氨基酸氧化酶占底物质量为0.25-0.35、过氧化氢酶占反应体系体积的1-6％时转化率最佳。
[0092]
实验例2
[0093]
通过中控检测实施例2-11的2-氧代戊酸的反应程度，检测结果如表2所示：
[0094]
表2不同反应条件对脱氢反应结果的影响结果
[0095][0096]
从表2的结果可以看出，采用本发明范围内的异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇以及nad
+
的用量均可以获得较高的转化率，其中当异丙醇脱氢酶占底物质量20-30％、亮氨酸脱氢酶占底物质量15-25％、异丙醇占底物质量0.4-0.6％以及nad
+
占底物质量0.04-0.05％时转化率最佳。
[0097]
实验例3
[0098]
通过中控检测d-正缬氨基酸在对比例1-4的剩余量，检测结果如表3所示：
[0099]
表3对比例1-4的d-正缬氨基酸的剩余量
[0100][0101]
从表3的检测结果来看，采用序列优化前的d-氨基酸氧化酶制备l-正缬氨酸，其在相同反应条件下，随着dl-正缬氨酸底物的浓度增加，转化效率越低，且与实施例相比，在同一dl-正缬氨酸底物浓度下，对比例的d-正缬氨基酸的剩余量更大，由此证明，采用序列优化后的-氨基酸氧化酶制备l-正缬氨酸，其转化率得到明显的提高。
[0102]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种d-氨基酸氧化酶，其特征在于，所述d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种核酸分子，其特征在于，其用于编码如权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.如权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶在酶法制备l-正缬氨酸中的应用。4.一种酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：向底物中添加权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶，以及过氧化氢酶，进行氧化反应；氧化反应后向反应体系中加入异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶以及异丙醇，用氨水调节ph，并加入醋酸锌和nad
+
，进行脱氢反应；所述底物为dl-正缬氨酸。5.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的浓度50-300g/l；优选地，所述底物在反应体系中的浓度100-250g/l；优选地，所述底物在反应体系中的浓度125-250g/l。6.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物与d-氨基酸氧化酶的质量比＝1：0.2-0.4；优选地，所述底物与d-氨基酸氧化酶的质量比＝1：0.2-0.3；优选地，所述底物与d-氨基酸氧化酶的质量比＝1：0.25-0.3。7.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述过氧化氢酶的添加量为反应体系的0.5-9vt％；优选地，所述过氧化氢酶的添加量为反应体系的1-8vt％；优选地，所述过氧化氢酶的添加量为反应体系的1-6vt％。8.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：10％-30％：5％-25％：0.2％-0.6％：0.03％-0.05％；优选地，所述底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：15％-30％：10％-25％：0.3％-0.6％：0.035％-0.05％；优选地，所述底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad
+
的质量比为1：20％-30％：15％-25％：0.4％-0.6％：0.04％-0.05％。9.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述氧化反应中反应体系的ph＝7-7.5，反应温度为28-32℃；优选地，所述脱氢反应中反应体系的ph＝8-8.5，反应温度为36-38℃。10.根据权利要求4-9任一项所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法还包括在脱氢反应完成后对获得的反应液进行过滤、两次浓缩和干燥，即得到所述l-正缬氨酸；优选地，所述反应液在进行过滤前将其酸碱度调节至ph＝1-2；优选地，所述过滤的滤膜孔径为45-55nm，截留分子量为800-1200d；优选地，所述两次浓缩包括将过滤后的滤液浓缩到滤液体积的0.2-0.4，过滤获得第一次结晶，加入漂洗液漂洗两次，收集结晶，继续浓缩到所述过滤后的滤液体积的0.1-0.2，过
滤获得第二次结晶，加入漂洗液漂洗两次，收集结晶；优选地，所述漂洗液为甲醇；优选地，所述干燥温度为55-60℃。

技术总结
本发明公开了一种D-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备L-正缬氨酸的方法，该D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为了采用酶法制备L-正缬氨酸，而提供了一种优化后的D-氨基酸氧化酶序列，该酶具有较高的活性和底物耐受度。并通过优化实验条件，确定最佳转化条件，通过该方法能够提高转化率，进而提高生产效率；并且使用该方法的污染小，对环境更友好；同时原料易得，不仅能够降低生产成本，还有利于大规模应用。还有利于大规模应用。还有利于大规模应用。


技术研发人员：褚冠武 高仰哲 吴法浩 李钢 王世磊
受保护的技术使用者：南京红杉生物科技有限公司
技术研发日：2022.12.09
技术公布日：2023/9/11