一种能够同步检测汞离子和铅离子的DNA探针及其应用

一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针及其应用
技术领域
1.本发明属于环境分析领域，具体涉及一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针及其应用。


背景技术：

2.近年来，世界各国重点发展重工业，金属污染已经变成非常严峻的问题，许多疾病的发生都与金属离子污染有密切的关系，如癌症和遗传疾病。其中汞离子和铅离子广泛地存在于人类的日常生产生活之中，它们暴露后即使浓度很低，也会对生物体的肾脏、心脏、神经系统和其他许多器官造成极大的损害。并且重金属可在人和动物之间不断积累，进而产生更高更强的毒性，造成更大的危害。目前饮用水中hg
2+
和pb
2+
的最高耐受水平分别为0.001mg/l(5nm)和0.01mg/l(48nm)，所以找到高效便捷检测汞离子和铅离子的方法至关重要。迄今为止，人们已经开发出许多传统的汞离子和铅离子检测方法，如原子吸收光法，电感耦合等离子体质谱、冷蒸汽原子荧光光谱法，酶联免疫吸附测定等方法。虽然这些方法有较高的准确度和灵敏度，但是往往需要大型昂贵的机器，相关的专业人员且繁琐复杂的程序。另外，这些传统方法的检测灵敏度有较大的不确定性，与样本性质、样本制备方法、仪器和操作条件均有较大关系，很可能产生不稳定的结果，因此大大限制了日常生活中对汞离子和铅离子的快速检测。
3.因此，有必要开发出一个灵敏度高，成本廉价，操作简单方便的新方法实现对汞离子和铅离子的检测。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺点弊端，本发明的第一个目的是提供一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针p2.8-c，序列如下：
[0007]5’‑
gggtgggcgtttgcgtccctcgctttcgggtggg-3’。
[0008]
所述的dna探针p2.8-c与待测样品混合后，当样品中有汞离子存在时，dna链通过t-hg
2+-t配对，可同时形成发夹结构和g-四联体；当样品中有铅离子存在时，铅离子诱导dna两端富g碱基部分形成稳定的反平行g-四联体结构。
[0009]
所述dna探针在汞离子作用下形成的发夹结构与g-四联体结构之间的碱基个数为1，其中该碱基为c时，荧光强度最佳。
[0010]
本发明的第二个目的是提供上述dna探针在同步检测水样中汞离子和铅离子的应用。
[0011]
本发明的第三个目的是提供一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，利用特定序列的非荧光标记的寡核苷酸链和两种缓冲液及一种嵌入式荧光剂dapi基于荧光法实现对汞离子和铅离子的检测，具有操作简单，检测敏捷等优点。
[0012]
一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，采用如下技术方案：
[0013]
步骤(1)、将上述dna探针溶于缓冲液，然后加入待测样品混匀得到混合溶液，室温下静置4-6min；
[0014]
步骤(2)、将嵌入式荧光剂dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)加入步骤(1)所得混合溶液中并混匀，室温下静置一段时间；
[0015]
步骤(3)、测定步骤(2)静置后溶液的荧光信号强度。
[0016]
作为优选，步骤(1)中所述dna探针的浓度为100-110nm。
[0017]
作为优选，检测汞离子时，步骤(2)中所述缓冲液为由tris-hac缓冲液和tris-hcl缓冲液混合得到的混合缓冲液，其中tris-hac缓冲液和tris-hcl缓冲液的体积比为3:1；
[0018]
所述tris-hac缓冲液的浓度为25mm，ph为8.5，由三羟甲基氨基甲烷tris、醋酸hac和200mm naac配制得到；
[0019]
所述tris-hcl缓冲液的浓度为25mm，ph为8.5，由三羟甲基氨基甲烷tris、盐酸hcl和200mm nacl配制得到。
[0020]
作为优选，检测铅离子时，步骤(2)中所述缓冲液为25mm、ph为8.5的tris-hcl缓冲液，由三羟甲基氨基甲烷tris、盐酸hcl和100mm nacl配制得到。
[0021]
作为优选，检测铅离子时，步骤(2)静置后还需加入1000-1200nm汞离子，混匀并静置20-22min。
[0022]
作为优选，步骤(2)中dapi的浓度为100-125nm，静置时间为20-22min。
[0023]
步骤(2)中采用的嵌入式荧光剂dapi自身荧光微弱，当待测样品中不存在汞离子和铅离子时，几乎可忽略；存在汞离子时，dapi嵌入到t-hg
2+-t复合物中，在平行g-四联体的辅助下，dapi激发出较强的荧光信号；存在铅离子时，铅离子诱导平行g-四联体构象发生改变，形成反平行g-四联体结构，因此dapi无法嵌入t-hg
2+-t复合物中，荧光淬灭信号降低，实现荧光开关的功能。
[0024]
荧光检测可以通过荧光分光光度计来实现，操作简单，成本低，耗时短，检测范围广，通过判断荧光信号的开关和强度大小，即可对汞离子和铅离子达到定性定量检测和实时检测的目的。
[0025]
本发明的有益效果是：
[0026]
(1)本发明所提供的dna探针在应用时具有较高的灵敏度，对汞离子和铅离子的检测限分别为0.39nm和4.57nm，检测结果通过荧光数值清晰可见，检测的线性范围广，可以实现实时检测的目的。
[0027]
(2)本发明所提供的dna探针在应用时对汞离子和铅离子均有较好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生干扰。
[0028]
(3)本发明所提供的dna探针在应用时可同步实现对汞离子和铅离子的检测，溶液中同时存在汞离子和铅离子时均可实现对其中某一离子的检测。
[0029]
(4)本发明所提供的dna探针已完成对自来水样本的测试，有很好的回收率，可在实际生活中应用推广，且操作简单方便，仅需要使用简单的仪器就能够进行检测。
附图说明
[0030]
图1为本发明中检测汞离子和铅离子的原理图；
[0031]
图2为该dna传感器中发夹结构与g-四联体结构之间的不同碱基的荧光强度比较结果；
[0032]
图3为不同浓度的汞离子和铅离子的荧光强度曲线图以及汞离子和铅离子浓度与荧光强度线性关系图，其中(a)为不同浓度的汞离子的荧光强度曲线图；(b)为相对荧光强度与汞离子浓度之间的线性关系；(c)为不同浓度的铅离子的荧光强度曲线图；(d)为相对荧光强度与铅离子浓度之间的线性关系；
[0033]
图4为不同金属离子干扰下的对汞离子和铅离子特异性检测的结果图，其中其中(a)为溶于混合缓冲液的汞离子和其他金属离子单独检测时的相对荧光强度；(b)为溶于混合缓冲液的汞离子和其他金属离子混合检测时的相对荧光强度；(c)为溶于tris-hcl缓冲液的汞离子、铅离子和其他金属离子单独检测时的相对荧光强度；(d)溶于tris-hcl缓冲液的汞离子和其他金属离子混合检测时的相对荧光强度。
具体实施方式
[0034]
下面结合实例对本发明作进一步的说明，但并不仅限于此。
[0035]
本发明公开一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针，所述dna探针序列含有3个连续的t碱基，且3对t碱基两端各穿插1个c碱基和1个g碱基，在汞离子作用下形成能够发夹结构与g-四联体结构，发夹结构与g-四联体结构之间的碱基个数为1。
[0036]
在发夹结构与g-四联体结构之间插入100nm不同碱基(a/t/c/g)，形成以下四种dna探针序列：
[0037]
p2.8-a：gggtgggagtttgcgtccctcgctttcgggtggg
[0038]
p2.8-c：gggtgggcgtttgcgtccctcgctttcgggtggg
[0039]
p2.8-t：gggtgggtgtttgcgtccctcgctttcgggtggg
[0040]
p2.8-g：gggtgggggtttgcgtccctcgctttcgggtggg
[0041]
将四种dna探针序列分别溶于体积比为3:1的tris-hac缓冲液(25mm，ph 8.5)和tris-hcl缓冲液(25mm，ph 8.5)的混合缓冲液中，在hg
2+
浓度为1200nm、dapi浓度为125nm的条件下进行荧光强度比较，结果如图2所示，p2.8-c的荧光强度最佳，故后续实施例中均采用p2.8-c作为dna探针。
[0042]
本发明对汞离子的检测采用如下实施方案：
[0043]
(1)用体积比为3:1的tris-hac缓冲液(25mm，含有200mm naac，ph8.5)和tris-hcl缓冲液(25mm，含有200mm nacl，ph 8.5)的混合缓冲液溶解100nm的探针p2.8-c。
[0044]
(2)加入待测样品，混匀后于室温下放置5分钟。
[0045]
(3)加入125nm的嵌入式荧光剂dapi，混匀后于室温下放置20分钟。
[0046]
(4)采用荧光分光光度计检测荧光强度。
[0047]
本发明对铅离子的检测采用如下实施方案：
[0048]
(1)用tris-hcl缓冲液(25mm，含有100mm nacl，ph 8.5)溶解100nm的探针p2.8-c。
[0049]
(2)加入1200nm汞离子，混匀后于室温下放置5分钟。
[0050]
(3)加入待测样品，混匀后于室温下放置20分钟。
[0051]
(4)加入125nm的嵌入式荧光剂dapi，混匀后于室温下放置20分钟。
[0052]
(5)采用荧光分光光度计检测荧光强度。
[0053]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0054]
实施例1
[0055]
利用dna探针p2.8-c检测样品中的汞离子，dna探针序列p2.8-c如下：gggtgggcgtttgcgtccctcgctttcgggtggg。
[0056]
(1)按体积比为3:1的比例配制25mm tris-hac缓冲液(含有200mm naac，ph 8.5)和25mm tris-hcl缓冲液(含有200mm nacl，ph 8.5)的混合缓冲液，将探针p2.8-c溶解于混合缓冲液中，使探针p2.8-c的浓度为100nm。
[0057]
(2)加入待测样品，混匀后，于室温下放置5分钟。这一步中，若待测样品中含有汞离子，则探针序列p2.8-c的t碱基部分将与汞离子形成t-hg
2+-t复合物。
[0058]
(3)加入125nm嵌入式荧光剂dapi，混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，若待测液中含有汞离子，荧光剂嵌入到t-hg
2+-t结构中，荧光信号增强，以实现检测汞离子的目的。
[0059]
(4)若该过程待测样品中含有铅离子，由于铅离子和醋酸根离子形成醋酸铅，此时铅离子对汞离子检测无干扰。
[0060]
实施例2
[0061]
利用dna探针p2.8-c检测样品中的铅离子，dna探针序列p2.8-c如下：gggtgggcgtttgcgtccctcgctttcgggtggg。
[0062]
(1)先用tris-hcl缓冲液(25mm，含有100mm nacl，ph 8.5)溶解探针p2.8-c，使探针p2.8-c的浓度为100nm。
[0063]
(2)加入1200nm汞离子，混匀后，于室温下放置5分钟。这一步中，探针序列p2.8-c的t碱基部分将与汞离子形成t-hg
2+-t复合物。
[0064]
(3)加入待测样品，混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，若待测样品中含有铅离子，则探针序列中富g碱基部分被铅离子诱导成反平行g-四联体结构。
[0065]
(4)加入125nm嵌入式荧光剂dapi,混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，荧光剂dapi从结构中释放，荧光信号降低，以实现检测铅离子的目的。
[0066]
(5)若该过程待测样品中含有汞离子，经实验验证汞离子浓度为1200nm时，荧光信号已经达到饱和，因此即使待测样品中含有汞离子，也不会对铅离子检测产生干扰。
[0067]
实施例3：对不同浓度的汞离子和铅离子的检测
[0068]
(1)配制汞离子标准溶液，浓度分别为0，2，10，50，150，200，300，400，600，700，800和900nm。
[0069]
(2)将不同浓度的汞离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计检测其荧光信号。每个反应至少重复3次后，结果如图3(a)和(b)所示，随着汞离子浓度的增加，荧光信号的逐渐增强；汞离子浓度在0-900nm范围内，荧光信号和汞离子浓度呈线性关系。
[0070]
(3)配制铅离子标准溶液，浓度分别为0，0.01，0.1，0.5，5，10，15，20，30，40，45和50μm。
[0071]
(4)将不同浓度的铅离子溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计检测其荧光信号。每个反应至少重复3次后，结果如图3(c)和(d)所示，随着铅离子浓度的增加，荧光信号的逐渐减弱；铅离子浓度在0-30μm范围内，荧光信号和铅离子浓度呈线性关系。
[0072]
实施例4：对不同金属离子干扰的检测
[0073]
(1)对汞离子检测时常见金属离子的干扰：
[0074]
配制不同金属离子的标准溶液，分别是k
+
，mg
2+
，al
3+
，cu
2+
，co
2+
，ca
2+
，ni
2+
，fe
2+
，mn
2+
，cd
2+
，pb
2+
，ag
+
，其中铅离子浓度是25μm，银离子浓度是10μm，其他金属离子浓度是12μm。
[0075]
将上述金属离子标准溶液和1200nm汞离子标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计在450nm的最大发射波长下对溶液的荧光信号进行检测。从图4(a)和(b)的检测结果可以看出，12μm的k
+
，mg
2+
，al
3+
，cu
2+
，co
2+
，ca
2+
，ni
2+
，fe
2+
，mn
2+
，cd
2+
，25μm的pb
2+
和10μm的ag
+
对检测方法均无干扰。只有当汞离子加入时，荧光信号才会增强，证明本发明对汞离子的检测有很好的特异性。
[0076]
(2)对铅离子检测时常见金属离子的干扰：
[0077]
配制50μm的不同金属离子的标准溶液，分别是mn
2+
，ni
2+
，ca
2+
，cu
2+
，fe
2+
，al
3+
，mg
2+
，co
2+
，k
+
，ag
+
。
[0078]
将上述金属离子标准溶液和50μm铅离子标准溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计在450nm的最大发射波长下对溶液的荧光信号进行检测。从图4(c)和(d)的检测结果可以看出，50μm的mn
2+
，ni
2+
，ca
2+
，cu
2+
，fe
2+
，al
3+
，mg
2+
，co
2+
，k
+
，ag
+
对检测方法均无干扰，证明本发明对铅离子的检测有很好的特异性。
[0079]
实施例5：对汞离子和铅离子在实际样本中的检测
[0080]
分别配制浓度为50nm，200nm，400nm的汞离子自来水样品和浓度为0.5μm，5μm，10μm的铅离子自来水样品。
[0081]
设置四组实验组，配置和操作如下：
[0082]
第一组：采用实施例1方法分别对50nm，200nm，400nm的汞离子自来水样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0083]
第二组：将50nm的汞离子自来水样品与0.5μm的铅离子自来水样品混合，将200nm的汞离子自来水样品与5μm的铅离子自来水样品混合，将400nm的汞离子自来水样品与10μm的铅离子自来水样品混合，然后采用实施例1方法分别对三种混合样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0084]
第三组：采用实施例2方法分别对0.5μm，5μm，10μm的铅离子自来水样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0085]
第四组：将50nm的汞离子自来水样品与0.5μm的铅离子自来水样品混合，将200nm的汞离子自来水样品与5μm的铅离子自来水样品混合，将400nm的汞离子自来水样品与10μm的铅离子自来水样品混合，然后采用实施例2方法分别对三种混合样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0086]
结果如表1-4所示。
[0087]
表1自来水样品中hg
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0088][0089]
表2自来水样品(含有铅离子)中hg
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0090][0091]
从表1-4中所示的检测结果可以看出，无论是单独存在汞离子和单独存在铅离子，
还是同时存在汞离子和铅离子，均有较好的回收率，证明该方法对汞离子和铅离子的检测有很好的实际应用性。
[0092]
以上实施实例为介绍本发明的优选案例，本发明并非仅限于上述实施实例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针，其特征在于，所述dna探针的序列如下：5
’‑
gggtgggcgtttgcgtccctcgctttcgggtggg-3’。2.权利要求1所述的dna探针在同步检测水样中汞离子和铅离子方面的应用。3.一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤(1)、将权利要求1所述的dna探针溶于缓冲液，然后加入待测样品混匀得到混合溶液，室温下静置4-6min；步骤(2)、将嵌入式荧光剂dapi加入步骤(1)所得混合溶液中并混匀，室温下静置一段时间；步骤(3)、测定步骤(2)静置后溶液的荧光信号强度。4.根据权利要求3所述的一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，步骤(1)中所述dna探针的浓度为100-110nm。5.根据权利要求3所述的一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，检测汞离子时，步骤(2)中所述缓冲液为由tris-hac缓冲液和tris-hcl缓冲液混合得到的混合缓冲液，其中tris-hac缓冲液和tris-hcl缓冲液的体积比为3:1；所述tris-hac缓冲液的浓度为25mm，ph为8.5，由三羟甲基氨基甲烷tris、醋酸hac和200mmnaac配制得到；所述tris-hcl缓冲液的浓度为25mm，ph为8.5，由三羟甲基氨基甲烷tris、盐酸hcl和200mmnacl配制得到。6.根据权利要求2所述的一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，检测铅离子时，步骤(2)中所述缓冲液为25mm、ph为8.5的tris-hcl缓冲液，由三羟甲基氨基甲烷tris、盐酸hcl和100mmnacl配制得到。7.根据权利要求2所述的一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，步骤(2)中dapi的浓度为100-125nm，静置时间为20-22min。8.根据权利要求2所述的一种同步检测水样中汞离子和铅离子的方法，其特征在于，检测铅离子时，步骤(2)室温下静置后还需加入1000-1200nm汞离子，混匀并静置20-22min。

技术总结
本发明公开一种能够同步检测汞离子和铅离子的DNA探针及其应用，所述DNA探针含有3个连续的T碱基，可同时形成发夹结构和G-四联体；所述DNA探针还含有富G碱基部分，能够形成稳定的反平行G-四联体结构。本发明公开的DNA探针可同步实现对汞离子和铅离子的检测，对汞离子和铅离子均有较好的特异性，检测方法具有较高的灵敏度，对汞离子和铅离子的检测限分别为0.39nM和4.57nM，检测结果通过荧光数值清晰可见，检测的线性范围广，可以实现实时检测的目的。的。的。


技术研发人员：刘禹辛 徐悠扬 李翔翔 蔡雨乐 裘洁琼
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：2022.12.07
技术公布日：2023/9/11