一种适冷耐盐谷胱甘肽还原酶及其编码基因与应用

1.本发明属于酶工程相关领域，尤其涉及一种适冷耐盐谷胱甘肽还原酶及其编码基因与应用。


背景技术：

2.谷胱甘肽还原酶属于黄蛋白氧化还原酶家族，通过nadph依赖催化将氧化型谷胱甘肽gssg还原为还原型谷胱甘肽gsh形式，被认为是在氧化应激期间维持细胞氧化还原状态的关键酶。谷胱甘肽还原酶通过细胞内gsh/gssg平衡在抵抗氧化应激和维持细胞还原能力方面发挥重要作用，也是生物体细胞生长、分裂、细胞信号所必需的。谷胱甘肽还原酶在应激反应中也起着至关重要的作用，包括氧化应激、低温应激、盐胁迫和金属离子耐受性。gsh在维持组织抗氧化特性和调节活性氧信号传导的过程中同样发挥关键作用，各种环境压力都会影响生物的生长代谢，使生物体内发生一系列生理生化反应，产生过量的ros，谷胱甘肽还原酶可以参与生物逆境响应，通过改变酶活性水平及基因转录水平，清除生物体内多余的ros，从而保证生物不受氧化胁迫的损害，得以在逆境中存活。
3.从动植物中提取的谷胱甘肽还原酶易受时节、气候和地域的限制，且稳定性较差，难以直接应用于工业生产等相关领域。利用重组基因工程菌诱导表达是降低成本和获得具有天然活性的谷胱甘肽还原酶的有效途径。南极由于其富有的地理及气候特征，形成了一个干燥、辐射、过度紫外线、高盐度的自然环境，孕育了丰富的极端微生物资源和新型低温酶资源。鉴于上述论述，从南极微生物psychrobactor sp.体内克隆得到适冷谷胱甘肽还原酶，且该基因在大肠杆菌中实现了表达，所述的谷胱甘肽还原酶psgr具有一定的抗氧化作用，可以抑制h2o2引起的氧化应激，可在生物医药、化妆品和食品中的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种适冷耐盐谷胱甘肽还原酶及其编码基因和应用，所述谷胱甘肽还原酶具有适冷性和耐盐性，具有良好的应用前景。
5.本发明实现目的的技术方案是：一种新型适冷谷胱甘肽还原酶编码基因，所述基因序列见seq id no.1。
6.一种新型适冷谷胱甘肽还原酶，由上述基因编码，其氨基酸序列见seq id no.2，蛋白序列共含有451个氨基酸残基，并在大肠杆菌中实现了功能表达，获得一株高产适冷谷胱甘肽还原酶的基因工程菌。
7.一种新型适冷谷胱甘肽还原酶的基因工程菌，包括上述的基因。
8.所述工程菌的宿主菌为e.colibl21。
9.所述工程菌的载体为pet-28a (+)。
10.上述基因工程菌发酵获得的适冷谷胱甘肽还原酶。
11.本发明的第二个目的在于提供上述谷胱甘肽还原酶psgr具有一定的抗氧化作用，可以抑制h2o2引起的氧化应激，可在生物医药、化妆品和食品中的应用。
12.所以，本发明主要涉及一种适冷谷胱甘肽还原酶psgr的基因序列，更具体涉及该适冷谷胱甘肽还原酶psgr的氨基酸序列、重组表达载体构建，重组蛋白制备及纯化，本发明还涉及该psgr重组蛋白能抑制h2o2引起的氧化应激，可在生物医药、化妆品和食品中的应用。
附图说明
13.图1为适冷谷胱甘肽还原酶表达纯化后的sds-page检测图。
14.图2为适冷谷胱甘肽还原酶最适温度检测图。
15.图3为不同浓度的nacl对适冷谷胱甘肽还原酶酶活影响图。
16.图4为磁盘扩散实验分析图。
具体实施方式
17.下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
18.以下实施例中未具体注明的试验方法均可按照常规方法进行，或者按照所用产品生产厂商的使用说明。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
19.实施例1：谷胱甘肽还原酶基因的克隆及测序分析。
20.南极微生物psychrobactorsp. ant206于2216e液体培养基中活化，培养至对数生长期的中后期（约4d），使用试剂盒提取菌株的总基因dna。以提取的总dna为模板，利用引物进行pcr。
21.上游引物：5
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atcggatccatgacaaaacattatg-3’下游引物：5
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taactcgagagcgcatcgtcacaaa
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扩增条件为：94 ℃变性1 min，59.1 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环30次。然后通过琼脂糖凝胶电泳检测从中寻找含有目的基因谷胱甘肽还原酶的条带并进行测序。分析测序结果，得到一个全长为1 356 bp完整阅读框序列的基因，核苷酸序列见seq id no.1，编码一个由451个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列件seq id no.2。
22.实施例2：谷胱甘肽还原酶基因的表达与纯化将适冷谷胱甘肽还原酶基因与pet-28a（+）双酶切后胶回收产物按比例利用t4连接酶连接，构建重组表达载体。将重组表达载体转化至感受态细胞e. coli bl21中，进行阳性克隆筛选及酶切验证。
23.将筛选得到的重组菌株，利用iptg诱导表达。将重组菌接种至lb培养基中，在32 ~ 40 ℃下培养至od600为0.4 ~ 0.6，培养基中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside，iptg）至终浓度为0.5 mm，23 ~ 27 ℃下诱导发酵24 h，即可高效诱导表达适冷谷胱甘肽还原酶。离心，收集菌体沉淀，冰浴中研磨和超声波破碎，提取粗蛋白。用ni柱亲和层析对适冷谷胱甘肽还原酶重组蛋白进行纯化，进行sds-page电泳分析，最终得到单一目的条带，其分子量约为53.5 kda。结果如图1所示，1，标准分子量蛋白marker；2，
空白质粒对照；3，重组菌；4，5，纯化的谷胱甘肽还原酶。ni柱亲和层析具体实施方案如下：提取粗蛋白上ni柱后，使用10 mm咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，40 ~ 60 mm咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，最后用100 ~ 500 mm咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，收集峰值处洗脱液，得到纯化后的适冷谷胱甘肽还原酶。
24.实施例3：重组适冷谷胱甘肽还原酶酶学性质的研究（1）最适反应温度的测定：在不同温度(0 ~ 45 ℃)和ph 7.5的条件下，测定适冷谷胱甘肽还原酶的酶活，将最高酶活定为100％，其他温度下的酶活与最高酶活的比值即为待测酶液在该温度下的相对酶活。结果如图2所示，结果表明：该酶的最适催化温度为25 ℃左右，0 ℃时为其最高活性的42.2%，当温度超过30 ℃时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到45 ℃时，酶活只有最高酶活的56%。
25.（2）不同浓度的nacl对酶活的影响：将酶置于不同浓度nacl （0 ~ 3.0 m）保温30 min，在25 ℃、ph 7.5的条件下测定测残余酶活，未用nacl处理的酶活作为100%。结果如图3所示，结果表明适冷谷胱甘肽还原酶在nacl浓度为1.0 m时，酶活最高，在0 ~ 3 m nacl处理下，残余酶活仍能达到62.5%以上，说明其有一定的耐盐性。
26.实施例4：磁盘扩散实验分别将正常条件培养的大肠杆菌与用iptg和低温（25 ℃）诱导的重组菌涂布在lb琼脂平板上。然后，在板上放置两个滤纸（直径3 mm）后，将1.5和3
ꢀµ
l 30%的h2o2添加到该盘上。此外，将板在35-39 ℃下培养12 h后，测量其能够反映抗氧化性的清洁区域。结果如图4所示，（a），在用h2o2氧化应激后，用bl21在平板中测量抑菌圈直径；（b），在用h2o2氧化应激后，bl21/pet-28a(+)-psgr在平板中测量抑菌圈直径；（c），bl21和bl21/pet-28a(+)-psgr的清除区直径以条形图形式显示，显示的数据为平均值（n=3）
±
sd；*，p《0.05,表示与对照的显著差异。发现用3.0 μl 30% h2o2处理后，重组菌板中的间隙区（直径 2.0 cm）明显小于对照（直径 4.0 cm）。结果表明，psgr具有一定的抗氧化作用，可以抑制h2o2引起的氧化应激。
27.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种新型适冷谷胱甘肽还原酶编码基因，其特征在于，其基因序列见seq id no.1。2.一种新型适冷谷胱甘肽还原酶，其特征在于，由权利要求1所述的编码基因，其氨基酸序列见seq id no.2。3.一种含有权利要求2所述的新型适冷谷胱甘肽还原酶基因的重组表达载体。4.一种含有权利要求3所述的重组表达载体的基因工程菌。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的工程菌为大肠杆菌e. coli bl21 （de3）。6.一种权利要求1所述的新型适冷谷胱甘肽还原酶基因的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：将转有编码新型适冷谷胱甘肽还原酶基因的重组菌，在32 ~ 40 ℃下培养至od
600
为0.4 ~ 0.6，培养基中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside，iptg）至终浓度为0.5 mm，23 ~ 27 ℃下诱导发酵24 h，即可高效诱导表达适冷谷胱甘肽还原酶。7.根据权利要求6所述的重组新型适冷谷胱甘肽还原酶的纯化方法，其特征在于，所述对表达产物新型适冷谷胱甘肽还原酶进行纯化的方法为ni柱亲和层析。8.一种产新型适冷谷胱甘肽还原酶的基因工程菌，其特征在于，包括权利要求1所述的基因，所述工程菌的宿主为e.coli bl21，所述工程菌的载体为pet-28a (+)，所述基因工程发酵菌获得适冷谷胱甘肽还原酶，所述酶最适催化温度为25 ℃，0 ℃时为其最高活性的42.2%；在当nacl浓度为3.0 m时，其有最大活性的62.5%。9.权利要求2所述的谷胱甘肽还原酶psgr具有一定的抗氧化作用，可以抑制h2o2引起的氧化应激，可在生物医药、化妆品和食品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种适冷耐盐谷胱甘肽还原酶及其编码基因与应用，本发明首先从南极海冰微生物嗜冷杆菌（Psychrobactersp.ANT206）中克隆了一段新型适冷谷胱甘肽还原酶编码基因，氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示。序列分析表明：该基因所编码的蛋白序列共含有451个氨基酸残基。其表达方式是利用质粒pET-28(+)构建含有谷胱甘肽还原酶基因的重组表达载体，并将构建的重组表达载体转入大肠杆菌宿主细胞（Escherichia coli），经诱导使谷胱甘肽还原酶基因表达。本发明的表达产物谷胱甘肽还原酶最适催化温度为25℃左右，具有耐盐性，拥有广阔的应用前景。本发明的表达产物具有突出的适冷性，稳定性较好，有一定的耐盐性，并且有较好的抗氧化性，可应用于生物医药、化妆品和食品等相关领域。相关领域。


技术研发人员：王全富 侯艳华 王亚彤
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学（威海）
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2023/9/11