基于CRISPR-CAS13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用

基于crispr-cas13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用
技术领域
1.本发明属于病毒学领域以及基因技术领域，更具体地，本发明涉及基于crispr-cas13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用。


背景技术：

2.寨卡病毒(zika virus，zikv)是通过蚊虫传播的单股正链rna病毒，属于黄病毒科的黄病毒属(alam a等:recent trends in zikv research:390 a step away from cure.biomed pharmacother 2017，91:1152-1159)。寨卡病毒与黄热病毒(yfv)、登革热病毒(denv)、日本脑炎病毒(jev)和西尼罗病毒(wnv)特征相似，在人类中引起轻度乃至严重危害生命的感染。2007年之前，在太平洋地区出现寨卡病毒感染暴发时，出现少数人感染病例(gourinat ac等，detection of zika virus in urine[j].emerg infect dis，2015，21(1):84-6)。然而，从2015年，寨卡病毒横贯太平洋，在巴西引起100多万感染病例(zanluca c等，first report of autochthonous transmission of zika virus in brazil[j].mem inst oswaldo cruz，2015，110(4):569-72)。截至2019年5月，该病毒迅速传播到84个国家和地区，已经成为世界范围内的公共卫生问题(hamelin me等，oseltamivir-resistant pandemic a/h1n1 virus is as virulent as its wild-type counterpart in mice and ferrets[j].plos pathog，2010，6(7):e1001015)。针对zikv感染的方法包括开发疫苗和筛选抑制病毒生命周期(batista mn等:natural products isolated from oriental medicinal herbs inactivate zika virus.viruses 2019，11)不同阶段的抗病毒药物。目前文献报道的大多数抗zikv活性先导化合物都进行了体外抗病毒活性测试，部分化合物也在动物模型上进行了体内抗病毒活性测试，仅有极少的候选化合物进入临床试验。尽管在过去几年中，研究人员在开发防治寨卡病毒感染的疫苗和抗病毒药物方面付出了艰苦的努力，但是仍没有疫苗或药物批准上市。
[0003]
寨卡病毒是正义单链rna病毒，感染宿主细胞，利用宿主细胞复制rna基因组，进行组装再成为成熟的子代病毒，最后释放到细胞外。寨卡病毒作为一种rna病毒，其具有高度的变异性，故针对其的药物设计是困难的，包括疫苗的设计、靶向试剂如基因编辑试剂的设计等，均会遭遇到因其高变性而导致的效果不理想的问题。
[0004]
因此，确定适于进行寨卡病毒抑制的靶点是本领域的技术难题，本领域亟待找到合理合适的方式来解决这一问题。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于利用crispr的cas13(如cas13b)家族工具，提供一种基于crispr-cas13干预抑制寨卡病毒(zikv)在哺乳动物细胞中的复制的方法。
[0006]
在本发明的第一方面，提供crrna在制备抑制寨卡病毒的组合物中的应用，所述crrna针对寨卡病毒基因组，包括：(1)dr序列；以及，(2)选自seq id no:1～11任一所示序列(spacer)或序列组合。
[0007]
在一种或多种实施方式中，(2)中，为选自seq id no:1～9任一所示序列或序列组合。
[0008]
在一种或多种实施方式中，(2)中，为选自seq id no:1～5任一所示序列或序列组合。
[0009]
在一种或多种实施方式中，所述的寨卡病毒包括表1和表2中所列举的任一病毒。
[0010]
在一种或多种实施方式中，(2)的序列由引物退火形成。
[0011]
在一种或多种实施方式中，(2)的序列由seq id no:17～38所示的引物退火形成。
[0012]
在本发明的另一方面，提供一种crrna，包括：(1)dr序列；以及(2)选自seq id no:1～11任一所示序列或序列组合。
[0013]
在一种或多种实施方式中，(2)的序列由引物退火形成。
[0014]
在一种或多种实施方式中，(2)的序列由seq id no:17～38所示的引物退火形成。
[0015]
在本发明的另一方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒含有所述crrna。
[0016]
在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞含有所述crrna或所述重组质粒。
[0017]
在一种或多种实施方式中，所述的重组细胞包括真核细胞或原核细胞。
[0018]
在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括(但不限于)：哺乳动物细胞(非人类哺乳动物细胞、人类细胞)、酵母、真菌细胞、昆虫细胞。
[0019]
在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括：293t-dc-sign细胞。
[0020]
在本发明的另一方面，提供一种crispr-cas复合物，其包括：cas核酸酶；以及，所述的crrna。
[0021]
在一种或多种实施方式中，较佳地，所述cas核酸酶包括cas13核酸酶；较佳地，所述cas13核酸酶包括cas13a核酸酶或cas13b核酸酶。
[0022]
在一种或多种实施方式中，所述cas核酸酶由质粒系统编码。
[0023]
在一种或多种实施方式中，所述crrna由质粒系统表达。
[0024]
在一种或多种实施方式中，编码cas核酸酶的质粒系统以pc0046-ef1a-pspcas13b-nes-hiv为骨架质粒；更佳地，所述骨架质粒中引入报告基因。
[0025]
在一种或多种实施方式中，表达crrna的质粒系统以pc0043-pspcas13b-crrna-backbone为骨架质粒。
[0026]
在一种或多种实施方式中，所述cas核酸酶的质粒系统或所述crrna的质粒系统合并于一个质粒中或分置于不同的质粒中。
[0027]
在本发明的另一方面，提供一种递送系统，其包含：所述的crispr-cas复合物或所述的重组质粒；及，递送载体。
[0028]
在一种或多种实施方式中，所述递送载体包括选自(但不限于)：纳米颗粒、脂质体、微囊泡或基因枪。
[0029]
在本发明的另一方面，提供一种抑制寨卡病毒的方法，所述方法包括：以所述的crrna作为向导，与cas核酸酶相配合，靶向切割寨卡病毒的靶位点区域，抑制寨卡病毒。
[0030]
在一种或多种实施方式中，以所述的crispr-cas复合物或所述的递送系统处理携带病毒的对象；较佳地，所述crispr-cas复合物靠近病毒基因组的靶位点区域或与之接触，所述cas核酸酶切割靶位点区域，从而破坏寨卡病毒基因组，抑制寨卡病毒。
[0031]
在一种或多种实施方式中，所述的抑制寨卡病毒的方法为不以疾病治疗为直接目的的方法。
[0032]
在一种或多种实施方式中，所述的携带病毒的对象包括：体外细胞，细胞培养物，分离的细胞，附着所述病毒或携带病毒的细胞的物质(如容器、场所等等)、人、非人哺乳动物。
[0033]
在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中寨卡病毒的靶位点区域存在情况的方法，包括将以携带可检测标记的所述的crispr-cas复合物或所述的递送系统引入待测样品；其中当crispr-cas复合物与靶位点区域结合时，cas核酸酶切割靶位点区域，通过观测可检测标记的存在情况来分析待测样品中靶位点区域存在情况；较佳地，所述可检测标记如报告基因、荧光基团、显色剂、显影剂或放射性同位素。
[0034]
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述的组合物包括：所述的crispr-cas复合物或所述的递送系统；较佳地，所述组合物为药物组合物，较佳地所述组合物中还包括：生理学或药学上可接受的药学载体。
[0035]
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，其中包括所述的crispr-cas复合物、所述的递送系统或所述的组合物。
[0036]
以上内容即为对本发明的总体描述，以下单独部分将对本发明的各个方面进行更详细的描述。然而，对本发明的描述应作如下理解：为了简化和减少冗余，本发明的某些实施方案仅在一个部分进行描述，或仅在权利要求或实施例中描述。因此，还应作如下理解：除非特别声明否认或组合形式不当，本发明的任何一个实施方案，包括仅在一个方面、一个部分或仅在权利要求或实施例中描述的实施方案，都可以与本发明中所述任何其它实施方案进行组合。
附图说明
[0037]
图1、pc0046-pspcas13b-gfp-nes质粒构建流程图。
[0038]
图2、pc0043-(pspcas13b)-crrna-zikv质粒构建流程图。
[0039]
图3、针对经筛选后获得的zikv基因组特定区域的crrna的设计。
[0040]
图4、检测crispr-cas13b靶向抑制zikv感染的实验方法流程图。
[0041]
图5、一种基于crispr-cas13b靶向zikv rna的技术，抑制效率流式统计。
具体实施方式
[0042]
寨卡病毒(zika)作为一种rna病毒，其具有高度的变异性，故针对其的药物设计是困难的。本发明人致力于找到适于进行zika病毒抑制的靶点，对zika病毒基因组进行了广泛且大量(1137种zikv基因组序列)的分析工作，在此基础上揭示了基于crispr-cas13(优选地为cas13b)系统干预或抑制寨卡病毒的方法及靶向抑制的试剂。
[0043]
crispr-cas系统
[0044]
crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。vi型crispr系统的发现及研究为rna操作工具的开发提供了巨大的可能。crispr-cas13是最近发现的ii类vi型crispr-cas系统，具有rna引导和rna靶向rnase蛋白，包括cas13a、cas13b、cas13c
和cas13d。crispr-cas13具有与rna结合的先天能力，并具有由crrna(crispr rna)引导下介导rna切割的能力。
[0045]
尽管crispr-cas系统已经被较多地由本领域技术人员进行各种应用，然而对于高变的rna病毒，在寻找适合的靶向编辑靶点方面，这一系统存在技术瓶颈。
[0046]
本发明则针对寨卡病毒，提出了解决方案，经过大量的筛选和实验，本发明人确定了若干个可以有效抑制病毒的spacer序列，选自seq id no:1～11所示。基于此，本发明也提供了一系列crrna，其包括所述spacer以及dr序列(直接重复序列)。所述dr序列可以来自于商业的基于crispr技术涉及的质粒。
[0047]
因此，在一些实施方案中，本发明所述的crispr-cas系统至少含有一crrna。
[0048]
在一些实施方案中，本文描述的crispr系统包括多个crrna，例如1、2、3、4、5、6、7、8或更多个crrna。
[0049]
在经典的crispr系统中，向导序列与其对应的靶序列之间的互补程度可以是约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或100％。在一些实施方案中，这种互补程度是90-100％。因此，本发明中也涵盖了上述基于seq id no:1～11所设计的crrna的变体，只要所述变体也能够发挥互补的左右，引导cas核酸酶(cas13，优选cas13b)到达靶位点，并发挥切割/修饰靶基因的作用。
[0050]
在一些实施方案中，所述crrna被包含在骨架序列中，例如该骨架序列具有茎环(发夹)结构。
[0051]
在一些实施方案中，编码所述crrna的dna被包含在表达载体中。
[0052]
在一些实施方案中，所述crrna靶向(靶向杂交或靶向互补)的靶核酸序列的相应序列区段的前面或后面包括pam序列，其本身序列不与pam序列杂交或互补。
[0053]
为减少脱靶相互作用，如为了减少crrna与低互补性靶序列的相互作用，可以在crispr系统引入突变，使crispr系统能够区分靶序列和脱靶序列，这些靶序列和脱靶序列有大于80％、85％、90％或95％的互补性。在一些实施方案中，这种互补程度是80％-95％，如约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％(例如，可以区分一个有18个核苷酸的靶标与一个有1、2或3个错配的18个核苷酸的脱靶标)。因此，在一些实施方案中，一个crrna与其对应的靶序列的互补程度大于94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.9％。在一些实施方案中，互补程度为100％。
[0054]
在本领域中已知，有足够的互补性能够发挥作用则不需要完全互补性。可以通过引入错配来调节切割效率，例如引入一种或多种错配，如在间隔区序列和靶序列之间(包括沿着间隔区/靶标的错配的位置)引入1或2个错配。若一个错配(如双错配)位于越靠近中心的位置(即不在3’或5’末端)，对切割效率的影响越大。因此，可以将错配引入沿着该间隔区序列的位置来调节切割效率。例如，如果期望实现少于100％的靶标切割(如在细胞群体中)，则可以将1或2个间隔区与靶序列之间的错配引入间隔序列中。
[0055]
在一些实施方式中，crispr-cas系统可使用多个crrna，使得其中的效应蛋白、包括效应蛋白的系统能够靶向多种核酸。在一些实施方案中，本发明所述的crispr系统包含多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或更多个)crrna。
[0056]
crrna的表达也可设置为包含诱导系统的方式。由于系统的可诱导性，可实现对基
因编辑或基因表达的时空控制。在一些实施方案中，对可诱导系统使用电磁辐射、声能、化学能和/或热能等方式刺激。
[0057]
在一些实施方案中，可通过以下方式对crrna的转录进行调节：诱导型启动子如四环素或强力霉素控制的转录激活(tet-on和tet-off表达系统)、激素诱导型基因表达系统(例如蜕皮激素)或阿拉伯糖诱导型基因表达系统。一些其它诱导系统的实施例包括：小分子双杂交转录激活系统(fkbp、aba等)、光诱导系统(植物色素、lov结构域或隐花色素)或光诱导转录效应子(lite)。
[0058]
化学修饰可应用于所述crrna。骨干修饰(如硫代磷酸酯)修饰磷酸主链上的电荷，并帮助寡核苷酸的递送和核酸酶抗性(参见如eckstein的《硫代磷酸酯、治疗性寡核苷酸的基本成分》，nucl.acid ther.,24,pp.374-387,2014)；糖的修饰，例如2
’‑
o-甲基(2
’‑
ome)、2
’‑
f、锁核酸(lna)的修饰，可增强碱基配对和核酸酶抗性(参见如allerson等人的《与未修饰的小干扰rna相比，2
’‑
全修饰的寡核苷酸双链体具有更好的体外效能和稳定性》，j.med.chem.48.4:901-904,2005)。经化学修饰的碱基，例如2-硫尿苷或n6-甲基腺苷，可以使得碱基配对变强或变弱(参见如，bramsen等人《通过化学工程开发治疗级小分子干扰rna》，front.genet.,2012aug.20；3:154)。此外，rna可以在5’和3’末端与各种功能部分缀合，包括荧光染料、聚乙二醇或蛋白质。
[0059]
在一些实施方案中，所述crrna包含一种或多种硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，为增强碱基配对和/或增加核酸酶抗性，所述crrna包括一种或多种被锁定的核酸。
[0060]
在一些实施方案中，可对所述crrna进行化学修饰。crrna化学修饰的实施例包括但不限于在一个或多个末端核苷酸处掺入2
’‑
o-甲基(m)、2
’‑
o-甲基3
’‑
硫代磷酸酯(ms)或2
’‑
o-甲基3
’‑
thiopace(msp)。与未经修饰的crrna相比，经过化学修饰的crrna可具有更高稳定性和活性，靶上特异性与脱靶特异性无法预测。参见，hendel所著nat biotechnol.33(9):985-9,2015，此处引用全文并入本文。化学修饰的crrna还可以包括但不限于一种rna，它含有硫代磷酸酯键以及锁核酸(lna)核苷酸，这种核苷酸在2’和4’碳之间有一个亚甲基桥。
[0061]
本发明的crrna与所述cas13酶相配合，构成所述的crispr-cas系统。
[0062]
本发明中，所述的cas13较佳地为cas13b，较佳地为pspcas13b，本发明中也包括其变体，其衍生物，其经修饰的产物等。
[0063]
本发明中还提供了一种递送系统，包含：本发明所述的crispr-cas复合物或重组质粒；及递送载体。所述递送系统有助于将本发明的包含cas核酸酶以及适当crrna的crispr-cas复合物引入到靶基因附近。较佳地，所述递送载体包括选自(但不限于)：纳米颗粒、脂质体、微囊泡或基因枪。
[0064]
本发明还提供了组合物，包括：本发明所述的crispr-cas复合物或所述的递送系统；较佳地，所述组合物为药物组合物，较佳地所述组合物中还包括：生理学或药学上可接受的药学载体。
[0065]
本发明还提供了试剂盒或药盒，其中包括所述的crispr-cas复合物、所述的递送系统或所述的组合物。在一些实施方案中，试剂盒可能还包括一份说明书，关于如何使用试剂盒的组分，和/或如何将附加组分与试剂盒的组分一起使用。所述试剂盒的任何组分都可以存储在任意合适的容器中。
dc-sign细胞，发现与293t细胞和veroe6细胞相比，293t-dc-sign细胞中zikv-mcherry感染的易感性增加。
[0075]
本发明生成了crispr-cas13b系统表达的细胞系。使用lipofectaminetm3000试剂盒转染pspcas13b-gfp-nes质粒到veroe6、293t和293t-dc-sign细胞中。
[0076]
本发明生成pspcas13b-crrna系统表达的细胞系。使用lipofectamine
tm
3000试剂盒转染pc0043-pspcas13b-crrna质粒到veroe6、293t和293t-dc-sign细胞中。
[0077]
在本发明的具体实施例中，进一步地，通过上述设计的crrna和crispr-cas13b抑制zikv rna复制。将cas13b-gfp蛋白和crrna复合物干扰抑制293t-dc-sign细胞中感染的zikv rna复制。293t-dc-sign细胞同时转染crispr载体(pspcas13b-gfp和pc0043-pspcas13b-crrna)，在培养皿上培养24小时。然后将转染后的293t-dc-sign细胞感染zikv-mcherry，moi为0.1。感染48小时后进行流式细胞术分析。
[0078]
本领域中，尚未有利用crispr-cas13b干预抑制的zikv rna复制。本发明的基于crispr-cas13b的rna编辑技术抑制了哺乳动物细胞zikv rna复制。该技术还可以用来进行操作和干扰蚊子细胞或蚊子中zikv，为干预防止寨卡病毒提供了一个有效的手段。
[0079]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0080]
实施例1、高效的zikv-mcherry感染系统的构建
[0081]
zikv-mcherry感染系统的主要的构建方法如下：
[0082]
1.构建稳定表达mcherry报告基因的zikv icdna(infectious cdna)的质粒pfk-zikv-mcherry
[0083]
设计pfk-zikv-mcherry质粒图谱，该质粒中，zikv是病毒全长基因组其基因组序列的genbank登录号为ku321639。启动子为t7，mcherry和衣壳蛋白capsid之间通过2a tag连接，2a tag可以在蛋白翻译后，自我切割，最终成熟的蛋白mcherry和capsid会分离开。
[0084]
委托基因合成公司合成质粒。
[0085]
2.pfk-zikv-mcherry质粒在细菌e.coli中表达稳定
[0086]
以pfk-zikv-mcherry质粒为模板，在t7启动子下转录rna，获得zikv-mcherry rna。具体如下：
[0087]
a.抽提质粒pfk-zikv-mcherry
[0088]
挑取少许含有合成好的质粒的pfk-zikv-mcherry的菌株，转接到加有抗生素的lb液体培养基试管中。将试管放入37℃、220rpm的摇床，过夜培养。
[0089]
(1)将培养好的试管中的菌液，加入1.5ml离心管中，室温10000
×
g离心1min。
[0090]
(2)除去上清液，使用质粒小提试剂盒(omega)开始抽提质粒，加入250μl溶液ⅰ(含rnase a)，颠倒ep管至菌体完全悬浮。
[0091]
(3)在ep管中加入250μl溶液ⅱ，温和地上下摇晃离心管4～6次，能够得到澄清的裂解液。室温孵育2min左右，不可剧烈混合，否则会使染色体dna破碎，降低质粒纯度。
[0092]
(4)继而加入350μl溶液ⅲ，温和地混匀，会看到有白色絮状沉淀出现，然后13000
×
g离心10min。
[0093]
(5)将上清吸取出来，移至装配好的吸收柱中，不要吸入沉淀和细胞碎片。10000
×
g离心1min。
[0094]
(6)弃掉离心液，在离心管中加入500μl buffer hb，然后10000
×
g离心1min。
[0095]
(7)弃掉离心液，在离心管中加入700μlwash buffer清洗，10000
×
g离心1min，重复2次此过程。
[0096]
(8)最后，13000
×
g离心2min，除去乙醇，乙醇会影响实验数据。
[0097]
(9)将吸收柱放入新的1.5ml离心管中，加40μl无菌水在滤膜上，10000
×
g离心2min。
[0098]
(10)检测：取1μl质粒液，用nanodrop2000仪器测od260/280的值，获得质粒溶液浓度(μg/μl)
[0099]
b.以pfk-zikv-mcherry质粒为模板，在t7启动子下转录rna，获得zikv-mcherry rna；使用t7 rna polymerase(neb)进行scrrna体外转录；转录体系(50μl)：
[0100][0101]
混匀后，37℃反应5h或过夜(12h)。
[0102]
c.消化模板dna
[0103]
(1)乙醇沉淀
[0104]
向转录体系中加1/10体积的醋酸钠(ph＝5.2)，再加入2倍体积的无水乙醇(例如，50μl转录体系加5μl醋酸钠，再加100μl无水乙醇)，-20℃静置30min沉淀核酸。
[0105]
4℃下15000g离心10min，弃上清。
[0106]
加入500μl的75％乙醇，洗涤沉淀(枪头吹打15-20次)，4℃下15000g离心10min，弃上清。
[0107]
再加入500μl的75％乙醇洗涤一次，4℃下15000g离心10min，弃上清(此次弃上清最好用枪吸，这样去除得彻底些)
[0108]
室温放置15min，使酒精充分挥发，加rnase-free水溶解沉淀。
[0109]
(2)dnaseⅰ消化模板dna
[0110]
接上一步，dna消化一般用100μl体系，所以加90μl rnase-free水溶解沉淀，然后加10μl的10
×
dnaseⅰbuffer，2μl dnaseⅰ(takara)，混匀后37℃反应1-2h，消化dna模板。
[0111]
d.回收zikv-mcherry rna
[0112]
使用rna clean&concentrator-5kit(zymo)对体外转录的rna进行回收。操作如下：
[0113]
加入2倍体积的rna binding buffer，之后加入等体积的无水乙醇(例如：100μl的样品，加入200μl rna binding buffer，之后加300μl无水乙醇)。混匀后上至zymoⅰc柱，室温放置1min。12000g离心1min，弃下管液体。
[0114]
加入400μl rna prep buffer，12000g离心1min，弃下管液体。
[0115]
加入700μl rna wash buffer，12000g离心30s，弃下管液体。
[0116]
加入500μl rna wash buffer，12000g离心30s，弃下管液体。
[0117]
将柱子放回套管，12000g离心2min(空甩，进一步去除rna wash buffer)。
[0118]
将柱子置于一新的1.5ml ep管中，室温放置5min，使酒精充分挥发。加50-100μl rnase-free水(50-60℃预热)，放置1-2min。10000g离心30s，得到回收好的crrna样品。nanodrop定量后，-80℃保存。
[0119]
3.用电穿孔方法将zikv-mcherry rna转染至vero e6细胞。将大约5μg的zikv-mcherry rna电转至5
×
106vero e6细胞中，利用bio-rad的电转仪，在4mm的电转杯中，设置0.45kv and 25μf，脉冲3次，每次3s间隔。然后继续在细胞培养箱中培养。在培养感染zikv后的第5天和第8天收集病毒上清，冻在-80℃冰箱储存。
[0120]
zikv基因组、mcherry的插入以及zikv-mcherry的元件构成情况如图3。
[0121]
实施例2、构建pc0046-pspcas13b-gfp-nes系统
[0122]
利用pc0046-ef1a-pspcas13b-nes-hiv基因编辑慢病毒质粒载体(addgene#103862)。
[0123]
1.设计构建带有荧光标记的crispr-pspcas13b系统
[0124]
为了方便检测pspcas13b蛋白的表达，本发明人在pspcas13b蛋白后融合了绿色荧光蛋白gfp。
[0125]
a.构建表达gfp的载体pc0046-pspcas13b-gfp-nes，具体操作如下：
[0126]
pc0056-lwcas13a-msfgfp-nes质粒模板获自addgene。
[0127]
设计扩增gfp序列片段的引物，序列如下：
[0128]
cas13b-gfp-p5：atgaagggatcccttcaaggaggaggtggaagcggaggaggaggaagcggaggaggaggtagcgtgagtaaaggtga；
[0129]
gfp-p3：tgattatcgataagcttgatatcg。
[0130]
pcr扩增gfp片段，反应体系如下：
[0131][0132]
pcr反应程序如下：
[0133]
94℃，2min；
[0134]
98℃，10s，58℃30s，72℃1min，72℃5min，30个循环；
[0135]
胶回收pcr片段。
[0136]
b.nhei/ecori双酶切pc0046-ef1a-pspcas13b-nes-hiv质粒
[0137][0138]
37℃，30min，胶回收大片段。
[0139]
c.使用一步克隆试剂盒(c112-02，vazyme)，制备pc0046-pspcas13b-gfp-nes质粒
[0140][0141]
37℃反应1小时。
[0142]
d.转化pc0046-pspcas13b-gfp-nes质粒至细菌e.coli.中；将质粒在大肠杆菌dh10β感受态细胞热激转化，42℃水浴锅热激90sec；涂布在lb培养基上生长，37℃过夜生长。
[0143]
2.将构建好的质粒pc0046-pspcas13b-gfp-nes摇菌抽质粒，建立过程及所获得的重组质粒如图1。
[0144]
实施例3、构建crispr-cas13b切割zikv rna的crrna质粒
[0145]
鉴于zikv为一种rna病毒，具有高度变异性，使得本领域中一直难以制备获得可有效针对zika及其变异型的、具有稳定的抑制作用的基于crispr技术的靶向抑制靶点。为了找到适合的靶点，本发明人针对zika病毒的基因组进行了广泛且大量的分析工作，从ncbi基因库中获得了1137种zikv基因组序列(表1和表2)，对这些序列进行了反复比对以及实验分析。
[0146]
表1
[0147]
[0148][0149]
表2
[0150]
[0151][0152]
经过广泛研究筛选后，本发明人确定了多个靶区域，针对这些靶区域设计crrna时，初步分析具有一定的抑制作用。进一步的筛选中，本发明人确定了10个zikv基因的变异稳定区域，设计了15个crrna。其中，gnt(non target)负对照。gmc(gmcherry)是靶向红色荧光蛋白基因mcherry。
[0153]
本实施例中，构建crispr-cas13b切割zikv rna的crrna质粒。
[0154]
1、用于制备靶向zikv rna的crrna的引物
[0155]
设计用于制备靶向zikv rna的crrna的引物，共14对靶向zika的crrna的引物，一对靶向mcherry的crrna的引物以及一对用于形成非靶标对照的引物，序列如表3。
[0156]
表3
[0157][0158]
2、构建质粒pc0043-(pspcas13b)-crrna(zikv-mcherry)
[0159]
具体操作方法如下：
[0160]
a.引物准备
[0161]
将zikv-crrna-p5和zikv-crrna-p3引物用水溶解成10μm的母液，各取10μl加入80μl 0.5
×
te(ph8.0)，使其终浓度为1μm；将其放置于pcr仪中98℃处理3min，自然冷却至室温。
[0162]
b.bbsi酶切pc0043-pspcas13b-crrna-backbone骨架载体
[0163]
pc0043-pspcas13b-crrna-backbone骨架载体获自addgene。
[0164][0165]
37℃，30min，胶回收片段。
[0166]
c.连接反应
[0167][0168]
25℃连接30min，转化产生pc0043-(pspcas13b)-crrna(zikv-mcherry)质粒(图2)。
[0169]
pc0046-pspcas13b-gfp-nes与pc0043-(pspcas13b)-crrna(zikv-mcherry)两个重组质粒，简称为pspcas13b-gfp-nes:crrna-(zikv)双质粒系统。
[0170]
实施例4、在动物细胞内crispr-cas13b干扰抑制zikv-mcherry rna复制效果
[0171]
本实施例中，检测动物细胞内crispr-cas13b干扰抑制zikv-mcherry rna复制的效果。
[0172]
1.在dmem+10％胎牛血清培养基中培养293t-dc-sign细胞，37℃，5％二氧化碳细胞培养箱。
[0173]
2.转染前一天，将293t-dc-sign细胞以每孔1.5
×
105个细胞的量接种于24孔板中。待细胞长到80％汇合度时，对细胞进行转染。转染前将24孔板中的培养基换成新鲜培养基(含血清，不含双抗)。
[0174]
3.转染试剂用的是赛默飞世尔科技公司的转染试剂lipofectamine
tm
3000transfection reagent，转染步骤(图4)如下：
[0175]
(1)使用opti-mem
tm
培养基稀释lipofectamine3000试剂(opti-mem
tm
培养基23.5μl/孔，lipofectamine3000试剂1.5μl/孔)，充分混匀。
[0176]
(2)使用opti-mem
tm
培养基稀释dna，制备dna预混液，pspcas13b-gfp-nes:crrna-(zikv)双质粒系统按照每一质粒500ng的量加入，然后补充p3000
tm
试剂达到25μl/孔，充分混匀。
[0177]
(3)在已稀释的lipofectamin3000试剂中加入稀释的dna预混液(1:1比例)，各25μl/孔。
[0178]
均匀混合，室温孵育10-15分钟。
[0179]
(4)加入pspcas13b-gfp-nes:crrna-(zikv)双质粒系统-脂质复合物全部加入24孔板(50μl/孔)，轻轻摇晃混匀。同时设置对照组，即只加转染试剂，不加pspcas13b-gfp-nes:crrna-(zikv)双质粒系统。
[0180]
(5)转染6小时后更换为新鲜的含血清含双抗的培养基。
[0181]
(6)继续培养48小时后，在荧光显微镜下进行拍照观察。
[0182]
2.将转染pspcas13b-gfp-nes和crrna-(zikv)的293t-dc-sign细胞感染zikv-mcherry rna病毒。
[0183]
(1)转染pspcas13b-gfp-nes和crrna-(zikv)的293t-dc-sign细胞24小时后，开始感染zikv-mcherry rna；
[0184]
(2)将收集到的zikv-mcherry rna病毒上清加入polybrene，使其终浓度为1μg/ml，室温孵育10-15min，24孔板每孔中添加1ml病毒液，在37℃、5％co2培养箱培养吸附1小
时，每15min晃动培养板1次，使病毒吸附均匀；
[0185]
(3)继续培养24、48、72小时后，在荧光显微镜下进行拍照观察。
[0186]
3.流式细胞术检测细胞中不同荧光细胞数量
[0187]
(1)将24孔板中需要进行流式检测的细胞，从培养箱中取出，开始进行样品制备。
[0188]
(2)用废液抽吸器将24孔板中原有的培养基弃掉，用1
×
pbs清洗一遍。
[0189]
(3)加入胰酶消化1min，在倒置显微镜下观察细胞，见细胞稍变圆时，立即加入流式稀释液终止消化，收集细胞，离心后去上清。
[0190]
(4)流式稀释液再清洗一次，离心后去掉上清液，约留0.5ml的细胞悬液，使用200目尼龙网过滤使细胞分散，分装在流式样品试管中，并在1小时内上机检测。
[0191]
结果如图5，可见本发明人筛选获得了一些抑制效果非常显著的crrna。
[0192]
针对zika的多种变异型病毒，包括本发明后续实施例表1和表2中所列举的，本发明人也进行了如上的抑制实验，结果发现，gns1-2的抑制各种病毒的抑制均具有显著性。
[0193]
共表达cas13b和mcherry靶向crrna(即阳性对照，gmc)细胞中zikv感染细胞的比例显著降低(～降低50％，p＝0.00022，双侧t检验)。在14个靶向zikv的crrna中，靶向ge-2、gns1-1、gns1-2、gns3-1和gns4b-1的crrna细胞数比明显低于非靶向crrna(gnt)(～降低50％，p值分别为0.00028、0.00011、0.00022、0.00018和0.00017(p《0.001；双侧t检验)。因此，这些crrna可以有效地抑制zikv-mcherry在哺乳动物细胞中的复制(图5)。对于rna病毒这类高变异性病毒，这种抑制效果是非常理想的。
[0194]
利用上述同样的实验方法，本发明人选取表1和表2中的一系列病毒(多种变异型病毒)作为抑制对象，以表3中seq id no:1-5任一所示序列构成crrna，结果发现，seq id no:1-5任一所示序列构成的crrna对于一系列病毒均具有显著的抑制作用。
[0195]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

技术特征：
1.crrna在制备抑制寨卡病毒的组合物中的应用，所述crrna针对寨卡病毒基因组，包括：(1)dr序列；以及(2)选自seq id no:1～11任一所示序列或序列组合。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，(2)中，为选自seq id no:1～9任一所示序列或序列组合；更佳地，为选自seq id no:1～5任一所示序列或序列组合。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的寨卡病毒包括表1和表2中所列举的任一病毒。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，(2)的序列由引物退火形成；较佳地，(2)的序列由seq id no:17～38所示的引物退火形成。5.一种crrna，其特征在于，包括：(1)dr序列；以及(2)选自seq id no:1～11任一所示序列或序列组合；较佳地，(2)的序列由引物退火形成；较佳地，(2)的序列由seq id no:17～38所示的引物退火形成。6.一种重组质粒或重组细胞，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求5所述的crrna；或，所述重组细胞含有权利要求5所述的crrna或所述重组质粒。7.一种crispr-cas复合物，其特征在于，其包括：cas核酸酶；以及，权利要求5所述的crrna；较佳地，所述cas核酸酶包括cas13核酸酶；较佳地，所述cas13核酸酶包括cas13a核酸酶或cas13b核酸酶。8.如权利要求7所述的crispr-cas复合物，其特征在于，所述cas核酸酶由质粒系统编码，所述crrna由质粒系统表达。9.一种递送系统，其特征在于，其包含：权利要求7或8所述的crispr-cas复合物或权利要求6所述的重组质粒；及，递送载体；较佳地，所述递送载体包括选自：纳米颗粒、脂质体、微囊泡或基因枪。10.一种抑制寨卡病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求5所述的crrna作为向导，与cas核酸酶相配合，靶向切割寨卡病毒的靶位点区域，抑制寨卡病毒。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，以权利要求7或8所述的crispr-cas复合物或权利要求9所述的递送系统处理携带病毒的对象；较佳地，所述crispr-cas复合物靠近病毒基因组的靶位点区域或与之接触，所述cas核酸酶切割靶位点区域，从而破坏寨卡病毒基因组，抑制寨卡病毒。12.一种检测待测样品中寨卡病毒的靶位点区域存在情况的方法，其特征在于，包括将以携带可检测标记的权利要求7或8所述的crispr-cas复合物或权利要求9所述的递送系统引入待测样品；其中当crispr-cas复合物与靶位点区域结合时，cas核酸酶切割靶位点区域，通过观测可检测标记的存在情况来分析待测样品中靶位点区域存在情况；较佳地，所述可检测标记如报告基因、荧光基团、显色剂、显影剂或放射性同位素。13.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括：权利要求7或8所述的crispr-cas复合物或权利要求9所述的递送系统；较佳地，所述组合物为药物组合物，较佳地所述组合物中还包括：生理学或药学上可接受的药学载体。
14.一种试剂盒或药盒，其特征在于，其中包括权利要求7或8所述的crispr-cas复合物、权利要求9所述的递送系统或权利要求13所述的组合物。

技术总结
本发明提供了一种基于CRISPR-CAS13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用。寨卡病毒(ZIKA)作为一种RNA病毒具有高度的变异性，故针对其的药物设计在本领域中是困难的。本发明人致力于找到适于进行ZIKA病毒抑制的靶点，对ZIKA病毒基因组进行了广泛且大量的分析工作，在此基础上揭示了基于CRISPR-Cas13(优选地为Cas13b)系统干预或抑制寨卡病毒的方法及靶向抑制的试剂。抑制的试剂。


技术研发人员：权利要求书2页说明书16页序列表8页附图3页
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：2022.03.01
技术公布日：2023/9/11