寡核酸缀合物的制作方法

1.本发明涉及寡核酸缀合物。


背景技术：

2.可直接控制细胞内表达的各种各样的基因产物的表达的核酸药物能够作为针对用以往的药品无法适应的疾病的治疗药，因此其医疗应用被强烈地期待。但是，核酸药物由于核酸分子自身的分子量大，具有许多负电荷，并且亲水性高，因此无法自发地透过细胞膜。作为将核酸分子输送至作为表达其作用的场所的细胞质内的手法，已知在核酸分子中修饰疏水性分子、糖等细胞内化促进剂的手法，以及核酸分子内包在功能性纳米粒子中的手法。
3.例如，在专利文献1和非专利文献1中，公开了通过将核酸分子和细胞内化促进剂共价键至聚合物来调制纳米结构体，将核酸分子输送至细胞质内的方法。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：国际公开第2013/062982号
7.非专利文献
8.非专利文献1：charles l.mccormick等人，biomacromolecules,第11卷,第505-514页(2010)


技术实现要素：

9.发明所要解决的课题
10.在专利文献1和非专利文献1的技术中，在使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用这一点上，有改善的余地。本发明的主要目的在于使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用，提高输送至细胞质内的寡核酸的量。
11.用于解决课题的手段
12.本发明人进行反复深入研究的结果，开发了可有效率地将寡核酸输送至细胞内的技术。本发明提供了作为含有细胞内化促进剂的功能性纳米粒子的寡核酸缀合物及其制造方法。
13.换言之，本发明的一个方案提供了寡核酸缀合物，其为以单分子构成的纳米粒子的寡核酸缀合物，含有树状聚合物的核心和配置于核心周围的多个寡核酸、一个或多个亲水性接头以及一个或多个细胞内化促进剂，寡核酸和亲水性接头优选与核心通过共价键结合，细胞内化促进剂优选与亲水性接头通过共价键结合。在本发明另一个方案中，形成核心的树状聚合物所具有的反应性官能团，除了寡核酸和亲水性接头之外，还可用于与加帽剂(capping agent，盖帽剂)的结合。在本发明又一个方案中，由于亲水性接头的直线长度比寡核酸的分子长度更长，或者亲水性接头的空间扩展(旋转半径)没有完全被寡核酸的空间扩展包围，因此细胞内化促进剂易于呈现在功能性纳米粒子的最外层，容易与靶细胞相互
作用。
14.换言之，本发明如下。
15.[1]寡核酸缀合物，其含有树状聚合物、多个寡核酸、一个或多个细胞内化促进剂以及一个或多个亲水性接头，
[0016]
各寡核酸直接地或借由接头结合至前述树状聚合物，
[0017]
各细胞内化促进剂借由前述亲水性接头结合至前述树状聚合物。
[0018]
[2][1]中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键、金属配位或主客体相互作用。
[0019]
[3][1]中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键或金属配位。
[0020]
[4][1]中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键。
[0021]
[5][1]～[4]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物的反应性官能团的至少一部分通过加帽剂而被加帽。
[0022]
[6][5]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自亲水性分子和疏水性分子的分子。
[0023]
[7][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为亲水性分子。
[0024]
[8][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自电中性的亲水性分子、在酸性条件下质子化的极性分子、阴离子性分子和阳离子性分子的亲水性分子。
[0025]
[9][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自电中性的亲水性分子、在酸性条件下质子化的极性分子和阴离子性分子的亲水性分子。
[0026]
[10][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为疏水性分子。
[0027]
[11][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自脂肪族化合物、芳香族化合物、三烷基胺和类固醇(steroid，甾体)的分子。
[0028]
[12][6]中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为脂肪族化合物。
[0029]
[13][1]～[12]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物为树形接枝物(dentri-graft)或树形高分子(dentrimer)。
[0030]
[14][1]～[12]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物中的单体彼此通过酰胺键、酯键或糖苷键结合。
[0031]
[15][1]～[9]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物中的单体彼此通过酰胺键或酯键结合。
[0032]
[16][1]～[12]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物为聚-l-赖氨酸树形接枝物或聚酰胺胺树形高分子或2,2-双(羟基-甲基)丙酸树形高分子。
[0033]
[17][1]～[16]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述寡核酸为基因表达控制剂。
[0034]
[18][17]中所述的寡核酸缀合物，其中前述基因表达控制剂为抑制mrna表达的分子。
[0035]
[19][17]中所述的寡核酸缀合物，其中前述基因表达控制剂为rna干扰诱导核酸或反义核酸。
[0036]
[20][1]～[19]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的五分之一以上。
[0037]
[21][1]～[19]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的四分之一以上。
[0038]
[22][1]～[19]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的三分之一以上。
[0039]
[23][1]～[19]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的五分之二以上。
[0040]
[24][1]～[19]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的一半以上。
[0041]
[25][1]～[24]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述亲水性接头为1种以上的选自聚乙二醇、聚(2-烷基-2-噁唑啉)、多肽和聚类肽(polypeptoid)的亲水性接头。
[0042]
[26][1]～[24]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述亲水性接头为1种以上的选自聚乙二醇、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、ek肽和聚肌氨酸的亲水性接头。
[0043]
[27][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为1种以上的选自低分子配体、多肽、适体、抗体或其片段、糖链和脂质的细胞内化促进剂。
[0044]
[28][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为低分子配体。
[0045]
[29][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为多肽。
[0046]
[30][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为适体。
[0047]
[31][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为抗体或其片段。
[0048]
[32][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为糖链。
[0049]
[33][1]～[26]的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为脂质。
[0050]
[34]药物组合物，其含有[1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物作为有效成分。
[0051]
[35]针对下述疾病的治疗剂或预防剂，其含有[1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物作为有效成分，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0052]
[36]用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括给予治疗有效量的[1]～[33]的任一
项中所述的寡核酸缀合物，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0053]
[37][1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物在用于制造针对下述疾病的治疗剂和/或预防剂中的应用，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0054]
[38]用于治疗和/或预防疾病的[1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0055]
[39]一种药物，其含有[1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物与针对疾病的1种以上的治疗剂和/或1种以上的预防剂的组合，前述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0056]
[40]寡核酸缀合物，其是用于与针对疾病的1种以上的治疗剂和/或1种以上的预防剂并用来治疗疾病的[1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物，前述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。
[0057]
[41][1]～[33]的任一项中所述的寡核酸缀合物的制造方法，其包括：使多个寡核酸和一个或多个亲水性接头结合至树状聚合物的工序；以及使细胞内化促进剂结合至各亲水性接头的工序。
[0058]
[42][41]中所述的寡核酸缀合物的制造方法，其进一步包括：使加帽剂结合至前述树状聚合物的工序。
[0059]
发明效果
[0060]
根据本发明，由于细胞内化促进剂可与靶细胞效率良好地相互作用，因而可将寡核酸有效率地输送至细胞内，由此可提高输送至细胞质内的寡核酸的量。此外，根据本发明，可避免作为以往功能性纳米粒子代表的自缔合型纳米粒子的结构缺陷。例如，利用脂质体或胶束的功能性纳米粒子的结构不稳定，可被有机溶剂、表面活性剂、稀释、剪切应力或与生物体成分的相互作用等破坏。此外，这些粒子难以控制小于50nm的严格尺寸。与此相对，本发明所涉及的寡核酸缀合物具有稳定的结构，并且可容易地控制其尺寸。
附图说明
[0061]
[图1]图1的(a)和图1的(b)为寡核酸缀合物的一个方案的示意图，在图1的(b)中显示了在亲水性接头的周围形成的水合层。
[0062]
[图2]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0063]
[图3]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减(knock-down，击倒)的图，所述寡核
酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0064]
[图4]图示在体外的寡核酸缀合物的核酸序列特异性基因敲减的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0065]
[图5]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含ge11。
[0066]
[图6]图示寡核酸缀合物在体外的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含ge11。
[0067]
[图7]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用pamam，包含crgd。
[0068]
[图8]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用pamam，包含crgd。
[0069]
[图9]图示在体外的寡核酸缀合物的crgd修饰数与细胞内摄取量的比较的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0070]
[图10]图示在体外的寡核酸缀合物的crgd修饰数与基因敲减的比较的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0071]
[图11]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含c(avb6)。
[0072]
[图12]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含c(avb6)。
[0073]
[图13]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含叶酸。
[0074]
[图14]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含核仁素(nucleolin)适体。
[0075]
[图15]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含核仁素适体。
[0076]
[图16]图示在体外的寡核酸缀合物细胞内摄取比较的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用不同世代数的聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0077]
[图17]图示在体外的寡核酸缀合物基因敲减比较的图，所述寡核酸缀合物在核心处使用不同世代数的聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0078]
[图18]图示在体外的寡核酸缀合物细胞内摄取比较的图，所述寡核酸缀合物作为亲水性接头的peg的分子量为2k、3.4k或5k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0079]
[图19]图示在体外的寡核酸缀合物细胞内摄取比较的图，所述寡核酸缀合物作为亲水性接头的peg的分子量为5k或10k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0080]
[图20]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物具有作为亲水性接头的pmeox10k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0081]
[图21]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物具有作为亲水性接头的pmeox10k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0082]
[图22]图示在体外的寡核酸缀合物的细胞内摄取的图，所述寡核酸缀合物具有作为亲水性接头的psar10k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0083]
[图23]图示在体外的寡核酸缀合物的基因敲减的图，所述寡核酸缀合物具有作为亲水性接头的psar10k，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0084]
[图24]图示在体外的寡核酸缀合物细胞内摄取比较的图，所述寡核酸缀合物修饰有不同加帽剂，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0085]
[图25]图示在体外的寡核酸缀合物基因敲减比较的图，所述寡核酸缀合物修饰有不同加帽剂，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0086]
[图26]图示在体外的寡核酸缀合物细胞内摄取比较的图，所述寡核酸缀合物修饰有具有质子化能力的加帽剂，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0087]
[图27]图示在体外的寡核酸缀合物基因敲减比较的图，所述寡核酸缀合物修饰有具有质子化能力的加帽剂，在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物，包含crgd。
[0088]
[图28]图示修饰有具有质子化能力的加帽剂的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的ph敏感性比较的图。
具体实施方式
[0089]
以下，对于本发明的适合的实施方式详细地进行说明。
[0090]
本发明的一个方面所涉及的寡核酸缀合物含有树状聚合物、多个寡核酸、一个或多个细胞内化促进剂以及一个或多个亲水性接头，各寡核酸直接地或借由接头结合至树状聚合物，各细胞内化促进剂借由亲水性接头结合至树状聚合物。在本说明书中，寡核酸缀合物意指通过寡核酸与其他分子结合而形成的单个分子。
[0091]
在本说明书中，树状聚合物意指这样的聚合物，其为从中心开始树状分支的聚合物，分支具有规则性。树状聚合物可为树形高分子、树状物(dendron)或树形接枝物。树形高分子一般具有树状结构，为三维高度分枝的分子，具有几乎球状的形状。树状物具有树形高分子的中心部至少一个官能团不分支的结构。树形高分子和树状物具有规则的分支结构，将其重复单元称为“世代”。在树形接枝物中，通过分子链与作为主链的分子链上的侧链梳状地结合，进而分子链与梳状分子链的侧链梳状地结合，形成放射状扩展的结构。在树形接枝物的情况下，将梳状的重复单元称为“世代”。
[0092]
树状聚合物的世代优选为第3世代～第20世代。例如在具有乙二胺核心的聚酰胺胺(pamam)树形高分子的情况下，世代优选为第5世代～第20世代，更优选为第5世代～第10世代。在聚赖氨酸树形接枝物的情况下，世代优选为第3世代～第6世代，更优选为第3世代～第5世代。在2,2-双(羟基-甲基)丙酸(bis-mpa)树形高分子的情况下，世代优选为第4世代～第20世代，更优选为第4世代～第10世代。
[0093]
树状聚合物的平均直径(换句话说，平均粒径)优选为5nm以上，更优选为5nm～25nm，进一步优选为5nm～15nm。在本说明书中，树状聚合物的平均粒径意指通过动态光散射得到的粒度分布中的平均粒径。
[0094]
前述树状聚合物中的单体彼此可通过例如单键、双键、三键、碳-硅键、酰胺键、糖苷键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、缩醛键、磷酸酯键、硫醚键、硫酯键、二硫键、三唑键、腙键、酰肼键、亚胺或肟键、脲或硫脲键、脒键、磺酰胺键等结合方式结合，但结合方式不限于这
些。可使用这些结合方式中任一项的结合方式，但出于安全性的观点，优选的是通过酶切断结合、在酸性条件下或还原环境等生物体内的环境下中切断结合。优选的结合方式的实例为酰胺键、酯键或糖苷键，但不限于这些。
[0095]
作为适合的树状聚合物的实例，可列举聚赖氨酸树形高分子、聚赖氨酸树形接枝物、pamam树形高分子、bis-mpa树形高分子或葡萄糖树形高分子，但不限于这些。树状聚合物例如可为聚-l-赖氨酸树形高分子，也可为聚-l-赖氨酸树形接枝物。
[0096]
在本说明书中，寡核酸是指以由碱基、糖和磷酸组成的核苷酸作为重复单元的聚合物。对寡核酸的种类没有特别限定，寡核酸缀合物可包含1种或2种以上的寡核酸。作为寡核酸，可列举例如由rna、dna或它们的组合组成的单链或双链，还包含rna与dna混合在同一链上的寡核酸。寡核酸中所含有的核苷酸可为天然型核苷酸，也可为经化学修饰的非天然型核苷酸，此外还可为加入了氨基、硫醇基或荧光化合物等分子的核苷酸。寡核酸可为非天然型寡核酸，非天然型寡核酸的范围中还包含主链中带有肽结构的肽核酸(pna)、主链中带有吗啉环的吗啉代核酸等与天然型寡核酸一样具有控制基因表达的作用的人工分子。
[0097]
对寡核酸的功能或作用没有限定，但作为寡核酸可列举例如反义核酸、sgrna、rna编辑核酸、mirna、sirna、sarna、shrna或切丁酶(dicer)底物rna。
[0098]
寡核酸可为例如基因表达控制剂。基因表达控制剂是指使特定的基因产物的合成增加或减少的化合物。作为基因产物，可列举例如mrna或其前体、mirna或其前体、ncrna、酶、抗体或其他蛋白质。作为基因表达控制剂，可列举例如正或负调控mrna表达(即促进或抑制表达)的分子或者编辑rna或dna的分子。作为这样的基因表达控制剂，可列举例如mirna、sirna等诱导rna干扰(rnai)的核酸(rnai诱导核酸)、反义核酸、mirna抑制剂、rna活化核酸、rna编辑诱导核酸或基因组编辑诱导核酸，但基因表达控制剂不限于这些。
[0099]
寡核酸的长度可为例如4～200碱基(对)、7～100碱基(对)或12～30碱基(对)。
[0100]
对寡核酸缀合物中的寡核酸的数目没有特别限定，例如可为1个以上、2个以上、6个以上、10个以上、18个以上、20个以上、21个以上、25个以上、26个以上、28个以上、35个以上或50个以上，也可为400个以下、200个以下或100个以下。在寡核酸通过共价键与树状聚合物结合的情况下，寡核酸的数目可为例如1以上，或者为树状聚合物所具有的反应性官能团的0.5％以上、1％以上或2％以上，优选为树状聚合物所具有的反应性官能团的3％以上或5％以上。寡核酸缀合物中的寡核酸的数目可通过例如以下求得：测定包含寡核酸缀合物的溶液中的树状聚合物的浓度和寡核酸的浓度，从这些值算出寡核酸相对于树状聚合物的比例。包含寡核酸缀合物的溶液中的树状聚合物的浓度可通过例如高效液相色谱法(hplc)来测定。寡核酸的浓度可通过例如从使用紫外-可见分光光度计测定的260nm处的吸收来求得。
[0101]
寡核酸可通过已知方法来制造。寡核酸可例如通过基于亚磷酰胺法或三酯法的固相合成法或液相合成法，以核酸自动合成机或手动来制造。
[0102]
各寡核酸直接地或借由接头结合至树状聚合物。对连接树状聚合物和寡核酸的接头没有特别限定，可为聚乙二醇(peg)等已知的接头。寡核酸缀合物可包含1种或2种以上的接头作为该接头。出于使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用、提高寡核酸缀合物向细胞内的输送效率的观点，优选连接树状聚合物和寡核酸的接头的末端间的直线距离的平均值小于连接树状聚合物和细胞内化促进剂的亲水性接头的末端间的直线距离的平
均值。作为一个实例，在连接树状聚合物和寡核酸的接头为peg的情况下，其数均分子量可为1000以下、800以下、600以下或300以下。
[0103]
在本说明书中，亲水性接头为用于连接树状聚合物和细胞内化促进剂的亲水性分子。亲水性分子意指具有易于与水之间形成氢键、易于溶解于水中或易于混于水中的性质的分子。亲水性分子可为带电分子或非带电的高极性分子。带电分子的带电基团可为带正电基团(阳离子)、带负电基团(阴离子)或它们的组合。若用于连接树状聚合物和细胞内化促进剂的接头为亲水性，则在抑制寡核酸缀合物凝集、提高溶解性、避免被网状内皮系统吞噬、避免与生物体成分的非特异性相互作用以及提高药代动力学(即延长血中滞留时间)的方面上可为有利的。作为亲水性接头，可列举例如peg、聚(2-烷基-2-噁唑啉)、多肽、聚类肽或聚甜菜碱，但本发明中的亲水性接头不限于这些。寡核酸缀合物可包含1种或2种以上的亲水性接头。亲水性接头优选为选自peg、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(pmeox)、聚肌氨酸(psar)和ek肽中的1种或2种以上。ek肽为谷氨酸和赖氨酸交替排列的肽。
[0104]
1个亲水性接头可具有多个区段(segment)。作为具有多个区段的亲水性接头，可列举例如ek肽与peg结合而成的聚合物，但不限于此。亲水性接头可具有线状结构或分支结构。
[0105]
作为一个实例，在长度为12～30碱基(对)的寡核酸直接结合至树状聚合物或借由数均分子量800以下的peg与树状聚合物结合，并且在亲水性接头为peg的情况下，出于使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用、提高寡核酸缀合物向细胞内的输送效率的观点，亲水性接头的数均分子量可为2000以上、3400以上、5000以上、6000以上、8000以上或10000以上。此外，在亲水性接头为pmeox或psar的情况下，亲水性接头的数均分子量可为4000以上、7000以上、10000以上、15000以上或20000以上。此外，在亲水性接头为ek肽的情况下，ek肽可为包含5个以上、7个以上、10个以上、15个以上或20个以上的谷氨酸和赖氨酸的交替序列的ek肽。在本说明书中，数均分子量为通过使用核磁共振(nmr)的端基定量法或尺寸排阻色谱(sec)求得的值。
[0106]
亲水性接头的数目可根据细胞内化促进剂的种类和数目来确定。亲水性接头的数目可少于、多于或等于细胞内化促进剂的数目。在亲水性接头通过共价键与树状聚合物结合的情况下，亲水性接头的数目可为例如1以上、2以上或树状聚合物所具有的反应性官能团的1％以上，树状聚合物所具有的反应性官能团的优选为2％以上，更优选为3％以上或5％以上。
[0107]
在本说明书中，细胞内化促进剂为通过与作为靶标的细胞特异性地或非特异性地相互作用来诱导该细胞内化促进剂所结合的物质向靶细胞内化的分子种类。在本方面所涉及的寡核酸缀合物中，细胞内化促进剂通过借由亲水性接头结合至树状聚合物，与不含该细胞内化促进剂的情况(例如单独使用寡核酸的情况)相比较，可将寡核酸有效率地输送至靶细胞内。作为细胞内化促进剂，可列举与细胞表面受体相互作用的物质、与膜转运蛋白相互作用的物质、与细胞粘附因子相互作用的物质或与细胞膜表面相互作用的其他物质，但不限于这些。细胞内化促进剂可为例如与作为存在于细胞膜表面的细胞粘附因子的整联蛋白相互作用的物质，与上皮细胞粘附分子相互作用的物质，与核仁素相互作用的物质，与作为细胞骨架分子的波形蛋白相互作用的物质，与前列腺特异性膜抗原相互作用的物质，与上皮生长因子受体、生长抑素受体、甘露糖受体、去唾液酸糖蛋白受体、叶酸受体等细胞表
面受体相互作用的物质，或者与葡萄糖转运蛋白、非选择性单胺转运蛋白等转运体相互作用的物质。
[0108]
作为细胞内化促进剂，可列举例如疏水性分子、聚阳离子、低分子配体、多肽、适体、抗体或其片段、糖或糖链、或者脂质，但细胞内化促进剂不限于这些。寡核酸缀合物可包含1种或2种以上的细胞内化促进剂。细胞内化促进剂优选为选自低分子配体、多肽、适体和糖或糖链的1种或2种以上。细胞内化促进剂更优选为多肽、低分子配体或适体。
[0109]
多肽的分子量可为例如50kda以下、15kda以下、6kda以下、2kda以下或1kda以下，但不限于这些。多肽的分子量可例如通过质谱法求得。
[0110]
在本说明书中，抗体或其片段是指具有与特定因子特异性结合的功能的支架蛋白，包含iga、igd、ige、igg、igm等免疫球蛋白，f(ab)’2、fab’、fab、scfv等片段化抗体，鲨鱼vnar、骆驼vhh等单域抗体，以及亲和体(affibody)、affilin、单体抗体(monobody)、α体(alphabody)等抗体模拟物，但不限于这些。
[0111]
作为细胞内化促进剂的具体实例，可列举下述式(i)～(iv)所示的多肽。式(i)中所示的多肽为crgdek(分子量：603.7da，pharmaceutics，2018，10，2)，其是包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列的环状肽配体(crgd)的一种。crgdek与整联蛋白αvβ3相互作用。crgdek以外的crgd也可作为细胞内化促进剂使用。式(ii)中所示的多肽为与整联蛋白αvβ6相互作用的c(avb6)(分子量：1046.2，acs omega，2018，3，2428-2436)。式(iii)中所示的多肽为与上皮生长因子受体相互作用的ge11(分子量：1539.7da)。式(iv)中所示的多肽为与生长抑素受体相互作用的奥曲肽(octreotide)衍生物(oct；分子量：1577.8da)。作为crgd可使用市售品。式(ii)～(iv)中所示肽可通过周知的合成方法容易地获取。
[0112]
[化学式1]
[0113][0114]
[化学式2]
[0115][0116]
作为其他细胞内化促进剂的具体实例，可列举下述式(v)～(vii)中所示的低分子。式(v)中所示的低分子为与叶酸受体相互作用的叶酸。式(vi)中所示的低分子为与前列腺特异性膜抗原相互作用的dupa。式(vii)中所示的低分子为与非选择性单胺转运蛋白相互作用的茚达曲林(indatraline，ind)。
[0117]
[化学式3]
[0118][0119]
作为其他细胞内化促进剂的具体实例，可列举下述式(viii)～(xii)中所示的糖。式(viii)中所示的糖为与葡萄糖转运蛋白相互作用的葡萄糖(glu)。式(ix)中所示的糖为
与甘露糖受体相互作用的甘露糖(man)。式(x)和式(xi)中所示的糖为与去唾液酸糖蛋白受体相互作用的n-乙酰半乳糖胺(galnac)和半乳糖(gal)。式(xii)中所示的糖为与作为细胞骨架分子的波形蛋白相互作用的n-乙酰葡糖胺(glcnac)。
[0120]
[化学式4]
[0121][0122]
作为其他细胞内化促进剂，可列举例如具有下述表中所示的以序列号1～6显示的碱基序列的适体。作为与核仁素相互作用的dna适体，可列举序列号1中所示的as1411(oncotarget，2015，6(26)，22270-22281)和序列号2中所示的fan-1524di(scientieic reports，2016，6，1-12)。作为与上皮细胞粘附分子相互作用的适体，可列举序列号3中所示的epcam适体(molecular cancer therapeutics，2015，14(10)，2279-2291)和序列号4中所
示epcam适体(theranostics，2015，5(10)，1083-1097)。作为与转铁蛋白受体相互作用的适体，可列举序列号5中所示的fb4(proc natl acad sci usa.，2008，105(41)，15908-15913)和序列号6中所示的gs24(mol ther nucleic acids，2014，3(1)，e144)。
[0123]
[表1]
[0124][0125]
表中，小写字母＝dna，大写字母＝rna，(f)＝2
′‑
f取代
[0126]
关于寡核酸缀合物中的细胞内化促进剂的数目，出于使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用、提高寡核酸缀合物向细胞内的输送效率的观点，可为例如1个以上、2个以上、6个以上、12个以上、18个以上、25个以上或26个以上，也可为400个以下、200个以下或100个以下。寡核酸缀合物中的细胞内化促进剂的数目可通过例如以下求得：测定包含寡核酸缀合物的溶液中的树状聚合物的浓度和细胞内化促进剂的浓度，从这些值算出细胞内化促进剂相对于树状聚合物的比例。树状聚合物的浓度和细胞内化促进剂的浓度可通过例如hplc或紫外-可见分光光度计来测定。
[0127]
如上所述，树状聚合物，更具体地说树状聚合物的反应性官能团(这些为末端官能团)的至少一部分上结合有寡核酸或亲水性接头。在一个实施方式中，未与寡核酸和亲水性接头结合的未反应的反应性官能团的至少一部分或全部可由加帽剂进行加帽。反应性官能团的加帽，换句话说，是指通过结合使反应性官能团的反应性降低。加帽剂通过与树状聚合物的反应性官能团结合而保护树状聚合物免于各种各样的相互作用或化学反应。例如，加帽剂保护树状聚合物免于静电相互作用、分解反应、缩合反应、加成反应等。
[0128]
此外，加帽剂可通过与树状聚合物结合将树状聚合物本来没有的功能或活性附加至树状聚合物。作为这样的加帽剂，可列举例如提高隐形性(stealth)的分子、与脂质双层膜相互作用的分子、具有质子缓冲能力的分子等，但加帽剂不限于这些。
[0129]
加帽剂也可为例如选自a)亲水性分子和b)疏水性分子的1种或2种分子。
[0130]
上述a)亲水性分子可为a-1)电中性的亲水性分子，a-2)在酸性条件下质子化的极性分子，a-3)阴离子性分子或a-4)阳离子性分子。a)亲水性分子可为与亲水性接头相同种类的分子，也可为与亲水性接头不同种类的分子。在本说明书中，“电中性”是指阳离子和阴离子的数目相等或者阳离子和阴离子的数目之差以较多一方的带电基团的数目为基准在10％以内的情况。
[0131]
作为上述a-1)电中性的亲水性分子，可列举例如具有羟基、烷氧基、肟基、酯基、酰胺基、酰亚胺基、烷氧酰胺基、羰基、磺酰基、硝基、吡咯烷酮基等亲水性基团的分子，甜菜碱
等两性离子，peg或甲氧基聚乙二醇等烷氧基聚乙二醇，但亲水性分子不限于这些。
[0132]
上述a-2)在酸性条件下质子化的极性分子为在内体内等酸性环境下和血液中、细胞间质液中等生理条件下拥有的电荷不同的分子。在酸性条件下质子化的极性分子是指具有7.4以下、优选为5.0～7.4的酸解离常数(pka)的分子。作为在酸性条件下质子化的极性分子，可列举例如叔氨基、二乙基三胺(det)基(-nh-ch
2-ch
2-nh-ch
2-ch
2-nh2)、吗啉代基、硫代吗啉代基、咪唑基、吡啶基、羧基等具有极性基团的分子，但在酸性条件下质子化的极性分子不限于这些。
[0133]
上述a-3)阴离子性分子为在生理条件下离子价数为负的分子。可列举例如羧基、磺基、磷酸基、磷酸酯基等具有官能团的分子，但阴离子性分子不限于这些。
[0134]
上述a-4)阳离子性分子为在生理条件下离子价数为正的分子。可列举例如伯氨基、仲氨基、叔氨基、胍基等具有官能团的分子，但阳离子性分子不限于这些。
[0135]
上述b)疏水性分子意指难以与水之间形成氢键、对水的亲和性低的分子。疏水性分子可为非极性分子或分配系数为2.0以上的分子。作为疏水性分子，可列举例如脂肪族化合物、三烷基胺芳香族基等具有疏水性基团的分子、胆固醇或类固醇，但疏水性分子不限于这些。
[0136]
在本说明书中，“结合”是指直接或间接地且不可逆的结合。不可逆的结合是指反应不可逆地进行的结合，换言之，一旦形成之后不会通过逆反应解离的结合或者通过逆反应的解离可被忽略的程度的结合。树状聚合物与寡核酸或与和寡核酸结合的接头的结合、寡核酸与接头的结合、树状聚合物与亲水性接头的结合以及细胞内化促进剂与亲水性接头的结合，可为例如由官能团间的亲核加成反应、亲核置换反应、亲电子置换反应等化学反应产生的共价键，金属配位键如胺与铂之间的结合，或主客体相互作用如生物素与亲和素之间的结合。出于达成高结构稳定性的观点和控制寡核酸缀合物尺寸的观点，结合优选为共价键。
[0137]
作为共价键，可列举例如单键、双键、三键、酰胺键、糖苷键、酯键、醚键、氨基甲酸酯键、缩醛键、磷酸酯键、硫醚键、硫酯键、二硫键、三唑键、腙键、酰肼键、亚胺或肟键、脲或硫脲键、脒键、磺酰胺键或由逆电子要求型diels-alder反应形成的结合，但共价键不限于这些。
[0138]
酰胺键在羧基与氨基之间形成。酰胺键例如使用在受适当保护的氨基与活化羧酸(用n-羟基琥珀酰亚胺活化的酯等)之间发生的常规的酰胺键形成反应来形成。
[0139]
二硫键(-s-s-)例如通过含有硫醇基(thiol group)(也被称为硫醇基(mercaptan group))(-sh)的成分与其他成分的活化硫醇基的硫醇交换来形成。
[0140]
硫醚键(-s-)例如使用在硫醇基与马来酰亚胺基之间发生的常规的硫醚键形成反应来形成。
[0141]
三唑键在叠氮基与碳碳三键之间形成。三唑键例如通过使用金属催化剂的huisgen环化、不使用金属催化剂的应变促进型叠氮化物-炔不可环化反应(strain-promoted alkyne-azide cycloaddition)等所谓的点击反应来形成。
[0142]
金属配位为通过金属离子和配体形成络合物而结合的结合方式。作为金属离子，可列举铂族元素、锰、钴、铜、钆等金属元素的离子，但不限于这些。此外，作为配体，可列举胺、吡啶、联吡啶、乙二胺、乙二胺四乙酸、乙酰丙酮或它们的衍生物等，但不限于这些。
[0143]
主客体相互作用为提供可选择性识别特定分子的空间的分子的主体分子和作为可接受于其中的分子的客体分子之间的相互作用。作为主体分子，可列举环糊精、分子监狱(carcerand)、分子杯(cavitands)、冠醚、穴状配体(cryptand)、葫芦脲(cucurbituril)、杯芳烃(calixarene)、亲和素、链霉亲和素等，但不限于这些。此外，作为客体分子，可列举金刚烷、双金刚烷、胆固醇、萘、生物素等，但不限于这些。
[0144]
接下来，关于寡核酸缀合物的结构，参照着图1进行说明。图1的(a)为显示寡核酸缀合物的一个方案的示意图。寡核酸缀合物100包含树状聚合物的核心10、配置于核心10周围的多个寡核酸1、细胞内化促进剂2和亲水性接头3。寡核酸1借由接头5结合至核心10。亲水性接头3结合至核心10、细胞内化促进剂2结合至亲水性接头3。此外，核心10上还结合有加帽剂4。如此，寡核酸缀合物100的树状聚合物以外的构成要素全部结合至树状聚合物，因此树状聚合物构成“核心”10、即寡核酸缀合物100的中心部分。此外，在水溶液中，寡核酸1和亲水性接头3从核心10处大致放射状地延伸，因此寡核酸缀合物100呈大致球状的纳米粒子的形状。因此，寡核酸缀合物100显示出纳米粒子的行为。本领域中，关于纳米粒子在生物体内的行为的见识是丰富的。需要说明的是，在图1中，寡核酸1借由接头5结合至核心10，但如上所述，寡核酸1也可直接结合至核心10。
[0145]
寡核酸缀合物100的平均粒径优选为10～100nm，更优选为15～45nm，进一步优选为15～35nm。在本说明书中，寡核酸缀合物的平均粒径意指通过动态光散射获得的粒度分布中的平均粒径。寡核酸缀合物100由于具有树状聚合物作为核心10，因此容易控制尺寸，可进行精密的设计。
[0146]
为了将寡核酸缀合物100输送至细胞内，细胞内化促进剂2需要与细胞相互作用。出于提高寡核酸缀合物向细胞内的输送效率的观点，优选细胞内化促进剂2的密度高。根据寡核酸缀合物100，高度分支的树状聚合物的核心10上结合有细胞内化促进剂2，因此可达成细胞内化促进剂2的高密度，由此可使细胞内化促进剂2与靶细胞效率良好地相互作用。
[0147]
此外，为了使细胞内化促进剂2与细胞相互作用，优选细胞内化促进剂2存在于寡核酸缀合物100的纳米粒子的外侧部分。在一个实施方案中，更优选地，如图1的(a)所示，细胞内化促进剂2存在于近似寡核酸缀合物100的结构的圆球的最外侧部分、即寡核酸缀合物100的纳米粒子的表面。在另一个实施方式中，优选的是，即使在细胞内化促进剂2不是存在于近似寡核酸缀合物100的结构的圆球的最外侧部分的情况下，亲水性接头3的空间扩展(旋转半径)也没有完全被核酸1的空间扩展包围，亲水性接头3实质上露出于外侧。在本发明的本方面所涉及的寡核酸缀合物100中，用于连接树状聚合物和细胞内化促进剂的接头为亲水性的，因此非特异性相互作用被抑制，细胞内化促进剂2易于存在于寡核酸缀合物100的纳米粒子的外侧部分。细胞内化促进剂2在寡核酸缀合物100的纳米粒子中的位置可通过亲水性接头3的种类和长度来调整。出于使细胞内化促进剂2与靶细胞效率良好地相互作用、提高寡核酸缀合物向细胞内的输送效率的观点，各亲水性接头3的末端间的直线距离的平均值可为寡核酸1长度的五分之一以上、四分之一以上、三分之一以上、五分之二以上或一半以上。在此，各亲水性接头3的末端间的直线距离是指各亲水性接头3的与核心10结合的末端和与细胞内化促进剂2结合的末端之间的直线距离。更严密地说，各亲水性接头3的末端间的直线距离的平均值优选可为从核心10的表面到寡核酸1的游离末端的直线距离的平均值的五分之一以上、四分之一以上、三分之一以上、五分之二以上或一半以上。在此，
从核心10的表面到寡核酸1的游离末端的直线距离是指接头5的与核心10结合的末端(然而，在寡核酸1直接结合至核心10的情况下，为寡核酸1的与核心10结合的末端)和寡核酸1的不与接头5或核心10结合的末端之间的直线距离。例如，在寡核酸1为5nm的核酸且寡核酸1直接结合至核心10的情况下，各亲水性接头3的末端间的直线距离的平均值可为1nm以上、1.25nm以上、1.67nm、2nm以上或2.5nm以上。
[0148]
各亲水性接头3的末端间的直线距离的平均值有时可通过测定由亲水性接头3的存在而形成的水合层的厚度而求得。在此，参照着图1的(b)，对于上述水合层进行说明。亲水性接头3为亲水性的，因此在水溶液中，在亲水性接头3彼此之间固定了水分子(即寡核酸缀合物100被水合)，由此在亲水性接头3的周围形成水分子层即水合层20。虽然也取决于亲水性接头的种类，但在某亲水性接头3的周围形成的水合层20的厚度h有时可与该亲水性接头3的末端间的直线距离相等或几乎相等。因此，在这样的情况下(例如，在亲水性接头3为peg的情况下)，可将各亲水性接头3的末端间的直线距离的平均值定义为水合层20的厚度h的平均值。水合层20的厚度h的平均值可例如通过多角度动态光散射求得。更具体地，首先，准备多个纳米粒子化合物，其为各自包含树状聚合物的核心10和结合至核心10的多个亲水性接头3的多个纳米粒子化合物，各纳米粒子化合物的亲水性接头3的分子量与另外的纳米粒子化合物的亲水性接头3不同。接下来，通过多角度动态光散射测定各纳米粒子化合物的平均粒径，由平均粒径之差和亲水性接头3的分子量之差求得亲水性接头3的分子量与水合层的厚度的相关函数。然后，可基于该相关函数，由寡核酸缀合物100中的亲水性接头3的分子量算出寡核酸缀合物100中的水合层20的厚度h。
[0149]
寡核酸缀合物可为游离体，也可为药学上可接受的盐。寡核酸缀合物可为溶剂合物(例如水合物、乙醇溶剂合物、丙二醇溶剂合物)或非溶剂合物的任一种。药学上可接受的盐可为酸加成盐，也可为碱加成盐。作为酸加成盐，可列举例如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸(tfa)、丙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、己二酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐等与有机酸的盐；盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等与无机酸的盐等。作为碱加成盐，可列举例如钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐；三甲胺盐；三乙胺盐；二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、布鲁卡因(brocaine)盐等脂肪族胺盐；n,n-二苄基乙二胺等芳烷基胺盐；吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等杂环芳香族胺盐；四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等季铵盐；精氨酸盐、赖氨酸盐等碱性氨基酸盐等。
[0150]
本发明还提供制造上述方面所涉及的寡核酸缀合物的方法。换言之，本发明的一个方面为制造寡核酸缀合物的方法，其包括：在树状聚合物上结合多个寡核酸和一个或多个亲水性接头的工序；以及在各亲水性接头上结合细胞内化促进剂的工序。寡核酸可直接地或借由接头结合至树状聚合物。在一个实施方案中，制造寡核酸缀合物的方法可进一步包括在树状聚合物上结合加帽剂的工序。由此，可制造树状聚合物的反应性官能团的至少一部分通过加帽剂进行加帽的寡核酸缀合物。
[0151]
上述任一工序都可采用已知的方法来进行。作为已知的方法，可列举例如使用活化基团使氨基与羧基反应而形成酰胺键的方法；使用活化基团使硫醇基彼此反应而形成二硫键的方法；使硫醇基与马来酰亚胺基反应而形成硫醚键的方法；利用使用催化剂或活化
基团的点击化学从叠氮基和炔基形成三唑键的方法；利用逆电子要求型diels-alder反应从四嗪、三嗪等极度缺电子的杂环和降冰片烯、反式环辛烯、环辛炔等具有应变碳多重键的化合物形成键的方法等。
[0152]
上述方面所涉及的寡核酸缀合物还可用上述方面所涉及的方法以外的已知方法制造。
[0153]
本发明的一个方面为含有上述方面所涉及的寡核酸缀合物作为有效成分的药物组合物。药物组合物中含有药学上可接受的添加剂。在本说明书中，“药学上可接受的”是指出于药理学上或毒性学上的观点，在哺乳动物中可接受的。换言之，“药学上可接受的”物质是指生理学上可接受的，并且在给予哺乳动物的情况下通常不产生过敏性反应或其他有害或毒性反应的物质。“药学上可接受的”物质意指用于在哺乳动物(更具体地为人)中使用，被普遍公认的监管机关认可或在普遍公认的药典中列举的物质。“药学上可接受的添加剂”意指为了将药物组合物制剂化而与寡核酸缀合物一起使用的药理学上惰性的材料。
[0154]
添加剂可为液体或固体。考虑所计划的给予方法，以得到所期望的用量(剂量)、软度等的药物组合物来选择添加剂。添加剂没有特别限定，但可列举例如水、生理盐水、其他水性溶剂、水性或油性基材等各种载体、赋形剂、粘合剂、ph调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等。添加剂的调配比例可基于药品领域中通常采用的范围而适当设定。
[0155]
药物组合物可为例如用于注射的无菌组合物。用于注射的无菌组合物可根据通常的制剂工艺(例如将有效成分溶解或悬浮在注射用水、天然植物油等溶剂中等)进行调制。作为注射用水性液体，可使用例如包含生理盐水、葡萄糖或其他辅助液(例如d-山梨糖醇、d-甘露醇、乳糖、蔗糖、氯化钠等)的等渗液等。注射用水性液体可进一步包含例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酯80tm或hco-50)等适当的溶解辅助剂。此外，注射用水性液体还可含有缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液)、无痛化剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人类血清白蛋白或聚乙二醇)、保存剂(例如苯甲醇、苯酚等)、抗菌剂、分散剂、抗氧化剂等该技术领域中已知的各种材料。注射剂可为例如冷冻干燥制剂。
[0156]
本发明的上述方面所涉及的寡核酸缀合物或药物组合物可用于特定基因产物所参与的疾病的治疗和/或预防。作为特定基因产物所参与的疾病，可列举例如先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病或感染性疾病，但疾病不限于这些。因此，本发明的一个方面为含有寡核酸缀合物作为有效成分的针对上述疾病的治疗剂或预防剂。
[0157]
本发明的另一个方面为用于治疗和/或预防上述疾病的方法，其包括将治疗有效量的寡核酸缀合物给予人类或人类以外的动物。人类可为需要治疗的人类，即患者。人类以外的动物意指包含以下的动物：灵长类等温血哺乳动物；鸟类；猫、犬、绵羊、山羊、牛、马、猪等家庭用动物或家畜；小鼠、大鼠、豚鼠等实验动物；鱼类；爬虫类；动物园的动物：和野生动物等。给予方法可为口服、舌下、静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹腔内、肌内、髄腔内、脑室内、鼻腔内、经粘膜、直肠、滴眼、眼内、经肺、经皮、关节内、局部(皮肤)、毛囊内、阴道内、子宫内、肿瘤内或淋巴内给予或它们的组合，但不限于这些。
[0158]
本发明的另一个方面为用于上述疾病的治疗和/或预防的寡核酸缀合物。本发明的另一个方面为寡核酸缀合物在用于制造针对上述疾病的治疗剂和/或预防剂中的应用。
[0159]
本发明的上述方面所涉及的寡核酸缀合物或药物组合物可与1种以上的其他药剂并用。其他药剂可为针对上述的特定基因产物所参与的疾病的1种以上的治疗剂和/或预防剂。例如，在对象疾病为恶性肿瘤的情况下，作为其他药剂的实例，可列举化学疗法中可使用的药品。换言之，本发明的一个方面为用于与针对上述疾病的1种以上的治疗剂和/或预防剂并用来治疗疾病的寡核酸缀合物。本发明的另一个方面为包含寡核酸缀合物或药物组合物与针对上述疾病的1种以上的治疗剂和/或预防剂的组合的药物。但是，本发明为可将寡核酸有效率地输送至细胞内的平台技术，只要是可将寡核酸作为治疗剂或预防剂适用的疾病，就可在任何疾病中使用，因此其他药剂并不限于特定的药剂。
[0160]
对寡核酸缀合物或药物组合物以及与他们组合使用的上述其他药剂的给予时期没有限定，可同时将这些给予至人类或人类以外的动物，也可相隔适当的间隔进行给予。或者，可在上述方面所涉及的药物组合物中调配上述其他药剂，来调制合剂。上述其他药剂的给予量和调配量以临床上所使用的用量为基准，可适当地确定。此外，寡核酸缀合物或药物组合物与上述其他药剂的调配比可根据给予对象、给予途径、对象疾病、症状、其他药剂的组合等而适当地确定。
[0161]
实施例
[0162]
在以下中列举实施例和试验例来详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，在下文中，只要没有另外规定，“％”全部意指重量％。
[0163]
《寡核酸的合成》
[0164]
准备表2中所示的sirna和反义核酸。借由spacer18(六甘醇)将硫醇基结合至sirna的有义链rna的3’末端和反义核酸的5’末端。这些核酸由株式会社genedesign制造。
[0165]
[表2]
[0166][0167]
表中，大写字母＝rna，小写字母＝dna，mc＝甲基胞嘧啶，(m)＝2
′‑
o-ch3取代，(f)＝2
′‑
f取代，(l)＝锁核酸，^＝硫代磷酸酯连接，p＝po4，18＝spacer18
[0168]
将sirna和乙二胺四乙酸
·
3钠盐(edta 3na)溶解于ph7.4的10mm磷酸缓冲生理盐
水(pbs)中，进一步地添加了二硫苏糖醇(dtt)(终浓度：edta 0.5mm，dtt 40mm)。将该溶液在25℃下加热6小时后，使用pbs通过超滤(截留分子量10kda)纯化6次。使用紫外-可见分光光度计(tecan公司制造，ineinite m200 pro)，由260nm处的吸收的测定值求得所得溶液的核酸浓度。
[0169]
《实施例1.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0170]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的合成
[0171]
作为树状聚合物，使用colcom公司制造的表面具有氨基的第4世代聚赖氨酸树形接枝物(dgl g4)。向10μl dgl g4的50mg/ml二甲亚砜(dmso)溶液中添加1.53μl peg12-spdp(thermo fisher scientific公司制造)的300mm dmso溶液、1.17μl三乙胺(tea)的50v/v％二甲基甲酰胺(dmf)溶液和1.28μl alexa fluor(注册商标)546nhs酯(thermo fisher scientific公司制造)的30mm dmso溶液，在室温下搅拌4.5小时。随后，向该反应液中添加68.9μl叠氮化物-peg5k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：5000)的20mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌18小时。随后，添加15.3μl甲基-peg12-nhs(thermo fisher scientific公司制造)的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，通过使dgl g4的氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、peg12-spdp、作为阴离子性荧光色素的alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)基反应，得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4。向反应液中添加400μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至100μl。
[0172]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0173]
对于20μl的(a)中所示叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加12μl的3m的氯化钠水溶液、72.1μl sirna的5.1mm pbs溶液，在25℃下搅拌15小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基(pyridyl disulfide group)与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr(ge healthcare公司制造)，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至170μl。
[0174]
(c)crgd-dbco的合成
[0175]
对于33.1μl环(-rgdek)(chemscene公司制造)的100mm dmso溶液，添加33.1μl dbco-nhco-peg4-nhs(broadpharm公司制造)的300mm dmso溶液和1.39μl tea，在25℃下搅拌16小时，由此使环(-rgdek)所具有的氨基和dbco-nhco-peg4-nhs所具有的nhs酯反应。将反应液在45℃下加热，同时减压除去溶剂而浓缩，使用反相hplc(柱：waters公司制造的xbridge peptide beh c18，4.6
×
100mm，洗脱液a：0.1v/v％tfa，洗脱液b：0.1v/v％tfa/乙腈(10/90；v/v))进行纯化。将回收的溶液在45℃下加热同时减压除去溶剂后，添加dmso调整至50mm的浓度。
[0176]
(d)crgd-peg5k sirna af5 dgl g4的合成
[0177]
对于30μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4水溶液，添加4.1μl(c)中得到的crgd-dbco的dmso溶液，在25℃下搅拌20小时，由此将叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基(二苯并环辛炔基)反应。随后，添加65
μl pbs后，使用nap-5柱(ge healthcare公司制造)进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至95μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5dgl g4的溶液。
[0178]
《实施例2.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化ge11结合型寡核酸缀合物的制造》
[0179]
对于30μl实施例1的(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5dgl g4水溶液，添加4.1μl ge11-dbco(由株式会社genedesign制造)的50mm dmso溶液和32.8μl dmso，在25℃下搅拌20小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基与ge11-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加130μl pbs则得到沉淀，因此将其离心沉降并除去上清液。将所得的沉淀溶解于100μl的dmso后，添加400μl的2-丙醇则得到沉淀，因此再次将其离心沉降并除去上清液。将所得的沉淀溶解于500μl的pbs后，使用nap-5柱(ge healthcare公司制造)进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至95μl，得到寡核酸缀合物ge11-peg5k sirnaaf5 dgl g4的溶液。
[0180]
《实施例3.在核心处使用pamam g5的tf7标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0181]
(a)叠氮化物-peg5k spdp tf7 pamam g5的合成
[0182]
作为树状聚合物，使用sigma-aldrich公司制造的表面具有氨基的第5世代pamam树形高分子(pamam g5)。向3.0μl pamam g5的5wt％甲醇溶液中添加1.24μlpeg12-spdp的100mm dmso溶液、1.66μl tide fluor(商标)7ws琥珀酰亚胺酯(aat bioquest公司制造)的10mm dmso溶液和1.48μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌5小时。随后，向该反应液中添加12.4μl叠氮化物-peg5k-nhs的30mm dmso溶液、1.03μlnhs(富士胶片和光纯药株式会公司制造)的400mm dmso溶液和1.03μl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl，nacalai tesque株式会公司制造)的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌18.5小时。随后，添加2.65μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使pamam g5的氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、peg12-spdp、tide fluor 7ws琥珀酰亚胺酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp tf7pamam g5。向反应液中添加400μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至80μl。
[0183]
(b)叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g5的合成
[0184]
对于10.0μl的(a)中所示叠氮化物-peg5k spdp tf7 pamam g5的水溶液，添加3.2μl 3m的氯化钠水溶液和12.4μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌15小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp tf7pamam g5所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的pamam g5的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0185]
(c)crgd-peg5k sirna tf7 pamam g5的合成
[0186]
对于500μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g5水溶液，添加3.70μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的dmso溶液，在25℃下搅拌16小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g5所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加
pbs将液量调整至100μl后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna tf7pamam g5的溶液。
[0187]
《实施例4.在核心处使用pamam g6的tf7标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0188]
(a)叠氮化物-peg5k spdp tf7 pamam g6的合成
[0189]
作为树状聚合物，使用sigma-aldrich公司制造的表面具有氨基的第6世代pamam树形高分子(pamam g6)。向5.0μl pamam g6的5wt％甲醇溶液中添加1.39μlpeg12-spdp的100mm dmso溶液、2.78μl tide fluor 7ws琥珀酰亚胺酯的10mm dmso溶液和2.48μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌5小时。随后，向该反应液中添加12.4μl叠氮化物-peg5k-nhs的30mm dmso溶液、1.72μl nhs的400mm dmso溶液和1.72μl edc-hcl的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌18.5小时。随后，添加4.44μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使pamam g6的氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、peg12-spdp、tide fluor 7ws琥珀酰亚胺酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp tf7pamam g6。向反应液中添加400μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至80μl。
[0190]
(b)叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g6的合成
[0191]
对于9.0μl(a)中所示叠氮化物-peg5k spdp tf7 pamam g6的水溶液，添加3.1μl 3m的氯化钠水溶液和12.5μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌15小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp tf7pamam g6所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的pamam g6的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0192]
(c)crgd-peg5k sirna tf7 pamam g6的合成
[0193]
对于500μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g6水溶液，添加4.51μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的dmso溶液，在25℃下搅拌16小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna tf7 pamam g6所具有的叠氮基和crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加pbs将液量调整至100μl后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna tf7pamam g6的溶液。
[0194]
《实施例5.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的tf7标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0195]
依照实施例1的crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna tf7 dgl g4。然而，使用tide fluor 7ws琥珀酰亚胺酯代替alexafluor 546nhs酯。
[0196]
《实施例6.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd肽结合型寡核酸缀合物2的制造》
[0197]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的合成
[0198]
依照实施例1的(a)，合成叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4。
[0199]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0200]
对于20μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加12μl 3m的氯化钠水溶液和76.7μl sirna的6.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep16/60sephacryl s-200hr(ge healthcare公司制造)，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至200μl。
[0201]
(c)crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0202]
对于30μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4水溶液，添加5.8μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的5mm dmso溶液，在25℃下搅拌20小时，由此使叠氮化物-peg5k sirnaaf5 dgl g4所具有的叠氮基和crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加65μl pbs后，使用nap-5柱(ge healthcare公司制造)进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至95μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 dgl g4的溶液。
[0203]
《实施例7.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd肽结合型寡核酸缀合物3的制造》
[0204]
依照实施例6的合成，合成与实施例6相同的寡核酸缀合物。然而，添加1.4μl crgd-dbco的5mm dmso溶液和4.3μl dmso来代替添加5.8μl crgd-dbco的5mm dmso溶液。
[0205]
《实施例8.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd肽结合型寡核酸缀合物4的制造》
[0206]
依照实施例6的合成，合成与实施例6相同的寡核酸缀合物。然而，添加1.2μl crgd-dbco的5mm dmso溶液和4.6μl dmso来代替添加5.8μl crgd-dbco的5mm dmso溶液。
[0207]
《实施例9.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd肽结合型寡核酸缀合物5的制造》
[0208]
依照实施例6的合成，合成与实施例6相同的寡核酸缀合物。然而，添加0.9μl crgd-dbco的5mm dmso溶液和4.9μl dmso来代替添加5.8μl crgd-dbco的5mm dmso溶液。
[0209]
《实施例10.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd肽结合型寡核酸缀合物6的制造》
[0210]
依照实施例6的合成，合成与实施例6相同的寡核酸缀合物。然而，添加0.6μl crgd-dbco的5mm dmso溶液和5.2μl dmso来代替添加5.8μl crgd-dbco的5mm dmso溶液。
[0211]
《实施例11.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化c(avb6)肽结合型寡核酸缀合物的制造》
[0212]
依照实施例1的合成，合成寡核酸缀合物c(avb6)-peg5k sirna af5 dgl g4。然而，使用使c(avb6)的赖氨酸侧链的氨基与dbco-nhco-peg4-nhs所具有的nhs酯反应而得到的c(avb6)-dbco(由株式会社genedesign制造)来代替crgd-dbco。
[0213]
《实施例12.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化叶酸结合型寡核酸缀合物的制造》
[0214]
依照实施例1的合成，合成寡核酸缀合物fa-peg5k sirna af5 dgl g4。然而，使用叶酸-peg2 dbco(nanocs公司制造)来代替crgd-dbco。
[0215]
《实施例13.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af6标签化茚达曲林结合型寡核酸缀合物的制造》
[0216]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4的合成
[0217]
向18μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加13.8μl peg12-spdp的60mm dmso溶液、8.9μl作为阴离子性荧光色素的alexa fluor(注册商标)647nhs酯(thermo fisher scientific公司制造)的8mm dmso溶液和14.0μl tea的10v/v％dmso溶液，在室温下搅拌11小时。随后，向该反应液中添加1417.6μl n3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：5000)的1.8mm dmso溶液、24.8μl edc-hcl的200mm dmso溶液和24.8μl nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌13小时。随后，添加37.8μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与n3-peg-nhs、peg12-spdp、alexafluor 647nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至420μl。
[0218]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf6 dgl g4的合成
[0219]
对于410.0μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4的水溶液，添加127.1μl 3m的氯化钠水溶液、465.0μl sirna的5.0mm pbs溶液和111.3μl dmso，在25℃下搅拌13小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至700μl。
[0220]
(c)ind-dbco的合成
[0221]
对于15.5μl茚达曲林盐酸盐(sigma-aldrich公司制造)的800mm dmso溶液，添加16.5μldbco-nhco-peg4-nhs的300mm dmso溶液、3.62μl tea和20μl乙腈，在25℃下搅拌18小时，由此使茚达曲林所具有的氨基与dbco-nhco-peg4-nhs所具有的nhs酯反应。使用sephadex(注册商标)lh-20(cytiva公司制造)，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：乙醇/乙腈(50/50；v/v))。回收包含作为目标物的ind-dbco的级分，在45℃下加热同时减压除去溶剂后，添加dmso调整至20mm的浓度。
[0222]
(d)ind-peg5k sirnaaf6 dgl g4的合成
[0223]
将370μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af6 dgl g4的pbs溶液、42.7μl(c)中得到的ind-dbco的20mm dmso溶液和49.8μl dmso混合，在25℃下搅拌22小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af6 dgl g4所具有的叠氮基与ind-dbco所具有的dbco基反应。随后，将反应液使用nap-10柱(ge healthcare公司制造)进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量10kda)进行浓缩，将溶液体积调整至95μl，得到寡核酸缀合物ind-peg5k sirnaaf6 dgl g4的溶液。
[0224]
《实施例14.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af6标签化适体结合型寡核酸缀合物1的制造》
[0225]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4的合成
[0226]
向8μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加6.1μl peg12-spdp的60mm dmso溶液、
3.8μl alexa fluor 647nhs酯的8mm dmso溶液和6.5μl tea的10v/v％dmso溶液，在室温下搅拌7小时。随后，向该反应液中添加700.1μln3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：5000)的1.8mm dmso溶液、12.3μl edc-hcl的200mm dmso溶液和12.3μl nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌16小时。随后，添加16.8μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与n3-peg-nhs、peg12-spdp、alexafluor 647nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至190μl。
[0227]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf6 dgl g4的合成
[0228]
对于120μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4的水溶液，添加33.9μl 3m的氯化钠水溶液、108.3μl sirna的6.0mm pbs溶液和29.4μldmso，在25℃下搅拌14小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af6 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至800μl。
[0229]
(c)nu1-peg5k sirna af6 dgl g4的合成
[0230]
在具有序列号1所示碱基序列的适体as1411的3’末端，借由氨基c6接头使dbco-nhco-peg4-nhs反应，得到nu1-dbco(由株式会社genedesign制造)。将22.7μlnu1-dbco的2.3mm pbs溶液、95μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirnaaf6 dgl g4的pbs溶液和14.1μl dmso混合，在25℃下搅拌15小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af6 dgl g4所具有的叠氮基与nu1-dbco所具有的dbco基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含目标物的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩。进一步地，使用2根串联的superose 6increase(cytiva公司制造，洗脱液：pbs)，通过凝胶过滤进行纯化。回收含有目标物的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩。将液体体积调整至194μl，得到寡核酸缀合物nu1-peg5k sirnaaf6 dgl g4的溶液。
[0231]
《实施例15.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af6标签化适体结合型寡核酸缀合物2的制造》
[0232]
依照实施例14的合成，合成nu2-peg5k sirna af6 dgl g4。然而，使用在具有序列号2所示碱基序列的适体fan-1524di的3’末端，借由氨基c6接头使dbco-nhco-peg4-nhs反应而得到的nu2-dbco(由株式会社genedesign制造)来代替nu1-dbco。
[0233]
《实施例16.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af6标签化适体结合型寡核酸缀合物3的制造》
[0234]
依照实施例14的合成，合成ep1-peg5k sirna af6 dgl g4。然而，使用在具有序列号3所示碱基序列的适体的3’末端，借由氨基c6接头使dbco-nhco-peg4-nhs反应而得到的ep1-dbco(由株式会社genedesign制造)来代替nu1-dbco。
[0235]
《实施例17.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的af6标签化适体结合型寡核酸缀合物4的制造》
[0236]
依照实施例14的合成，合成ep2-peg5k sirna af6 dgl g4。然而，使用在具有序列号4所示碱基序列的适体的5’末端，借由氨基c6接头使dbco-nhco-peg4-nhs反应而得到的ep2-dbco(由株式会社genedesign制造)来代替nu1-dbco。
[0237]
《实施例18.在核心处使用第3世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0238]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g3的合成
[0239]
作为树状聚合物，使用colcom公司制造的表面具有氨基的第3世代聚赖氨酸树形接枝物(dgl g3)。向10μl dgl g3的50mg/ml dmso溶液中添加1.5μl peg12-spdp的300mm dmso溶液、3.8μl alexa fluor 546nhs酯的10mm dmso溶液和tea的1.0μl 20v/v％dmf溶液，在室温下搅拌7小时。随后，向该反应液中添加45.9μl叠氮化物-peg5k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：5000)的30mm dmso溶液、6.9μl edc-hcl的400mm dmso溶液和6.9μl nhs的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌16小时。随后，添加4.7μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌8小时。如上所述，使dgl g3的氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、peg12-spdp、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g3。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至100μl。
[0240]
(b)叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g3的合成
[0241]
对于4.0μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g3的水溶液，添加2.4μl 3m的氯化钠水溶液和14.8μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g3所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g3的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0242]
(c)crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g3的合成
[0243]
对于40μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g3的pbs溶液，添加3.1μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的5mm dmso溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g3所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加pbs并将液量调整至100μl后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g3的溶液。
[0244]
《实施例19.在核心处使用第5世代聚赖氨酸树形接枝物的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0245]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g5的合成
[0246]
作为树状聚合物，使用colcom公司制造的表面具有氨基的第5世代聚赖氨酸树形接枝物(dgl g5)。向3.0μl dgl g5的50mg/ml dmso溶液中添加0.46μlpeg12-spdp的300mm dmso溶液、1.1μl alexa fluor 546nhs酯的10mm dmso溶液和2.3μl tea的20v/v％dmf溶液，在室温下搅拌7小时。随后，向该反应液中添加13.8μl叠氮化物-peg5k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：5000)的30mm dmso溶液、2.1μl edc-hcl的400mm dmso溶液和2.1μ
l nhs的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌16小时。随后，添加11.1μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌8小时。如上所述，使dgl g5氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、peg12-spdp、alexafluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g5。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至100μl。
[0247]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf5 dgl g5的合成
[0248]
对于13.0μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g5的水溶液，添加4.0μl 3m的氯化钠水溶液和14.8μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af5dgl g5所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g5的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0249]
(c)crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g5的合成
[0250]
对于40μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g5的pbs溶液，添加3.0μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的5mm dmso溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g5所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加pbs并将液量调整至100μl后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g5的溶液。
[0251]
《实施例20.在核心处使用第6世代bis-mpa树形高分子的af6标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0252]
(a)pfd-g6-tmp-nh2的合成
[0253]
将5.25mg pfd-g6-tmp-nhboc(polymer factory公司制造)溶解于200μl的tfa，在室温下搅拌3小时。随后，向该反应液中添加二乙醚，将析出的固体离心沉降。除去上清，使用二乙醚将固体洗涤3次。除去上清后，添加300μl dmso溶解固体。
[0254]
(b)叠氮化物-peg5k spdp af6 mpa g6的合成
[0255]
对于20μl(a)中得到的pfd-g6-tmp-nh2的dmso溶液，添加6.4μl peg12-spdp的60mm dmso溶液、3.4μl alexafluor 647nhs酯的8mm dmso溶液、384.0μln3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：5000)的2.5mm dmso溶液、9.6μl edc-hcl的200mm dmso溶液、9.6μlnhs的200mm dmso溶液、6.1μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液和6.1μl tea的10v/v％dmso溶液，在室温下搅拌12小时。如上所述，使pfd-g6-tmp-nh2的氨基与n3-peg-nhs、peg12-spdp、alexa fluor 647nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af6 mpa g6。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(sartorius公司制造，vivaspin，截留分子量50kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，液体体积调整至310μl。
[0256]
(c)叠氮化物-peg5k sirnaaf6 mpa g6的合成
[0257]
对于6.0μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af6 mpa g6的水溶液，添加1.9μl 3m的氯化钠水溶液、7.4μl sirna的6.0mm pbs溶液和3.8μldmso，在25℃下搅拌16小时，由
aso af6dgl g4所具有的叠氮基与c(avb6)-dbco所具有的dbco基反应。使用zeba(注册商标)旋转脱盐柱来纯化反应液。随后，使用pbs通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量50kda)进行3次纯化，将液体体积调整至100μl，得到寡核酸缀合物c(avb6)-peg5kaso af6 dgl g4的溶液。
[0272]
《实施例23.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有peg2k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0273]
(a)叠氮化物-peg2k spdp af5 dgl g4的合成
[0274]
向2.0μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加0.9μl peg12-spdp的100mm dmso溶液、1.5μl alexafluor 546nhs酯的5mm dmso溶液和2.5μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌6小时。随后，向该反应液中添加6.1μl叠氮化物-peg2k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：2000)的100mm dmso溶液、3.1μl edc-hcl的400mm dmso溶液和3.1μlnhs的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌14小时。随后，添加2.8μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与叠氮化物-peg2k-nhs、peg12-spdp、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg2k spdp af5 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至230μl。
[0275]
(b)叠氮化物-peg2k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0276]
对于50μl(a)中得到的叠氮化物-peg2k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加7.3μl 3m的氯化钠水溶液和12.0μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg2k spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至185μl。
[0277]
(c)crgd-peg2k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0278]
对于90μl(b)中得到的叠氮化物-peg2k sirna af5 dgl g4的pbs溶液，添加4.0μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的5.0mm dmso溶液、6.0μldmso，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg2k sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，使用nap-5柱来纯化反应液。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg2k sirna af5 dgl g4的溶液。
[0279]
《实施例24.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有peg3.4k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0280]
依照实施例23的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg3.4k sirna af5 dgl g4。然而，使用叠氮化物-peg3.4k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：3400)来代替叠氮化物-peg2k-nhs。
[0281]
《实施例25.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有peg5k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0282]
(a)叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的合成
[0283]
向2μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加3.1μl peg12-spdp的30mm dmso溶液、1.5μl alexa fluor 546nhs酯的4mm dmso溶液和1.6μl tea的10v/v％dmso溶液，在室温下搅拌8小时。随后，向该反应液中添加306.3μln3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：5000)的1.0mm dmso溶液、3.1μl edc-hcl的200mm dmso溶液和3.1μlnhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌15小时。随后，添加4.2μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌8小时。如上所述，使dgl g4的氨基与n3-peg-nhs、peg12-spdp、alexafluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amiconultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至50μl。
[0284]
(b)叠氮化物-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0285]
对于18.0μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加4.1μl 3m的氯化钠水溶液、7.9μl sirna的6.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌14小时，由此使叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0286]
(c)crgd-peg5k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0287]
对于70μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4的pbs溶液，添加6.9μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的2.0mm dmso溶液和0.9μl dmso，在25℃下搅拌14小时，由此使叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，使用nap-5柱来纯化反应液。将回收的溶液，使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩。将溶液体积调整至70μl，进行过滤器过滤(merck公司制造ultraeree；-mc，gv，0.22μm)，由此得到寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 dgl g4的溶液。
[0288]
《实施例26.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有peg10k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0289]
依照实施例25的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg10k sirna af5 dgl g4。然而，添加1531μl n3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：10000)的0.2mm dmso溶液来代替添加306.3μl n3-peg-nhs(biochempeg公司制造，peg的数均分子量：5000)的1.0mm dmso溶液。
[0290]
《实施例27.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有pmeox10k的tf7标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0291]
(a)叠氮化物-pmeox10k spdp tf7 dgl g4的合成
[0292]
向4.0μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中，添加1.2μl peg12-spdp的150mm dmso溶液、1.5μl tide fluor 7ws琥珀酰亚胺酯的10mm dmso溶液和1.3μl tea的25v/v％dmf溶液，在室温下搅拌4小时。随后，向该反应液中添加将76.6μl羧基起始叠氮化物封端的聚(2-甲基-2-噁唑啉)(ultroxa公司制造，pmeox的数均分子量：10000)的8mm dmso溶液、4.9μl edc-hcl的500mm dmso溶液和4.9μlnhs的500mm dmso溶液在室温下搅拌0.5小时而得到的
混合液，进一步地搅拌18小时。随后，添加5.6μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与羧基起始叠氮化物封端的聚(2-甲基-2-噁唑啉)的cooh基以及peg12-spdp、tide fluor 7ws和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-pmeox10k spdp tf7 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至230μl。
[0293]
(b)叠氮化物-pmeox10k sirna tf7 dgl g4的合成
[0294]
对于8.0μl(a)中得到的叠氮化物-pmeox10k spdp tf7 dgl g4的水溶液，添加2.9μl 3m的氯化钠水溶液和13.1μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌14小时，由此使叠氮化物-pmeox10k spdp tf7 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0295]
(c)crgd-pmeox10k sirna tf7 dgl g4的合成
[0296]
对于40μl(b)中得到的叠氮化物-pmeox10k sirna tf7 dgl g4的pbs溶液，添加1.6μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的10.0mm dmso溶液，在25℃下搅拌19小时，由此使叠氮化物-pmeox10k sirna tf7 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，使用nap-5柱来纯化反应液。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-pmeox10k sirna tf7 dgl g4的溶液。
[0297]
《实施例28.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有psar10k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0298]
(a)叠氮化物-psar10k spdp af5 dgl g4的合成
[0299]
向4.0μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加1.2μl peg12-spdp的150mm dmso溶液、1.0μl alexafluor 546nhs酯的15mm dmso溶液和1.6μl tea的20v/v％dmf溶液，在室温下搅拌8小时。随后，向该反应液中，添加将61.3μln3-psar(150)-cooh(iris biotech公司制造，psar的数均分子量：11400)的10mm dmso溶液、2.5μl edc-hcl的500mm dmso溶液和2.5μlnhs的500mm dmso溶液在室温下搅拌0.5小时而得到的混合液，进一步地搅拌19小时。随后，添加5.6μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌9小时。如上所述，使dgl g4的氨基与n3-psar(150)-cooh的cooh基以及peg12-spdp、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-psar10k spdp af5 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至90μl。
[0300]
(b)叠氮化物-psar10k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0301]
对于12.0μl(a)中得到的叠氮化物-psar10k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加4.4μl 3m的氯化钠水溶液和19.7μl sirna的5.0mm pbs溶液，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-psar10k spdp af5dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)
进行浓缩，将液体体积调整至100μl。
[0302]
(c)crgd-psar10k sirnaaf5 dgl g4的合成
[0303]
对于40μl(b)中得到的叠氮化物-psar10k sirna af5 dgl g4的pbs溶液，添加1.6μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的10.0mm dmso溶液，在25℃下搅拌19小时，由此使叠氮化物-psar10k sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，使用nap-5柱来纯化反应液。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-psar10k sirnaaf5 dgl g4的溶液。
[0304]
《实施例29.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、借由二硫键修饰有peg5k的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0305]
(a)spdp af5 dgl g4的合成
[0306]
向3μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加2.8μl peg12-spdp的100mm dmso溶液、2.3μl alexafluor 546nhs酯的5mm dmso溶液和1.8μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌19小时。随后，添加4.2μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与peg12-spdp、alexafluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物spdp af5 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加乙醇，调整至100μl的40％v/v乙醇/水溶液。
[0307]
(b)叠氮化物-peg5k-ss sirnaaf5 dgl g4的合成
[0308]
对于8.0μl(a)中得到的spdp af5 dgl g4的溶液，添加10.6μl sirna的5.0mm pbs溶液和8.7μl 3m的氯化钠水溶液，在25℃下搅拌8小时。随后，向该反应液中添加79.4μl叠氮化物-peg5k-硫醇(nanocs公司制造，peg的数均分子量：5000)的25mm 30v/v％dmso/水溶液，进一步地搅拌15小时。如上所述，使spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna和叠氮化物-peg5k-硫醇所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩。使用tskgel(注册商标)g2000swxl(tosoh公司制造)，通过凝胶过滤来纯化所得溶液。将回收的溶液通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至120μl。
[0309]
(c)crgd-peg5k-ss sirnaaf5 dgl g4的合成
[0310]
对于80μl(b)中得到的叠氮化物-peg5k-ss sirna af5 dgl g4的pbs溶液，混合7.4μl实施例1的(c)中得到的crgd-dbco的5mm dmso溶液和1.5μl dmso，在25℃下搅拌19小时，由此使叠氮化物-peg5k-ss sirna af5 dgl g4所具有的叠氮基和crgd-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加pbs并将液量调整至100μl后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-peg5k-ss sirna af5 dgl g4的溶液。
[0311]
《实施例30.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有ek肽的af6标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0312]
(a)叠氮化物-peg500 spdp af6 dgl g4的合成
[0313]
向5μl的dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加1.5μl peg12-spdp的150mm dmso溶
液、1.5μl alexa fluor 647nhs酯的10mm dmso溶液、3.8μl叠氮化物-peg12-nhs的100mm dmso溶液和2.3μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌9小时。随后，添加4.2μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌15小时。如上所述，使dgl g4的氨基与peg12-spdp、alexa fluor 647nhs酯、叠氮化物-peg12-nhs和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg500 spdp af6 dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，调整至100μl的40％v/v乙醇/水溶液。
[0314]
(b)叠氮化物-peg500 sirna af6 dgl g4的合成
[0315]
对于7.0μl(a)中得到的叠氮化物-peg500 spdp af6 dgl g4的溶液，添加16.1μl sirna的5.0mm pbs溶液、2.7μl 3m的氯化钠水溶液、5.2μl dmso，在25℃下搅拌17小时。如上所述，使叠氮化物-peg500 spdp af6 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr，通过凝胶过滤来纯化该反应液(洗脱液：pbs)。回收包含结合了sirna的dgl g4的级分，通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至80μl。
[0316]
(c)crgd-ek-马来酰亚胺的合成
[0317]
对于50.0μl下式(xiii)中所示的肽crgd-ek-sh(由株式会社genedesign制造)的20mm pbs溶液，添加6.7μl dbco-马来酰亚胺(东京化成工业公司制造)的300mm 50％v/v dmso/dmf溶液和20.0μl dmf，在4℃下搅拌15小时，由此使crgd-ek-sh所具有的sh基与dbco-马来酰亚胺所具有的马来酰亚胺基反应。将该反应液在45℃下加热同时减压除去溶剂。添加10μl dmf来溶解样品，进一步加入400μl纯水，进行过滤器过滤(merck公司制造的ultraeree；-mc，gv，0.22μm)，在45℃下加热同时减压除去溶剂。将所得固体溶解在30μl的dmso中。
[0318]
[化学式5]
[0319][0320]
(d)crgd-ek sirna af6 dgl g4的合成
[0321]
对于20μl(b)中得到的叠氮化物-peg500 sirna af6 dgl g4的pbs溶液，混合4.8μl(c)中得到的crgd-ek-dbco的dmso溶液和20μl 1m氯化镁水溶液(nippon gene公司制造)，在25℃下搅拌18小时，由此使叠氮化物-peg500 sirna af6 dgl g4所具有的叠氮基与crgd-ek-dbco所具有的dbco基反应。将析出的固体离心沉降后，除去上清，添加100μl pbs，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到寡核酸缀合物crgd-ek sirna af6 dgl g4的溶液。
[0322]
《实施例31.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有mpeg4的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0323]
依照实施例1的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 mpeg4 dgl g4。然而，使用m-dpeg(注册商标)4-nhs酯(quanta biodesig公司制造)来代替甲基-peg12-nhs。
[0324]
《实施例32.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有乙醇酸的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0325]
依照实施例1的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 ga dgl g4。然而，使用乙醇酸(glicolic acid)(sigma-aldrich公司制造)代替甲基-peg12-nhs，在加入乙醇酸的同时，添加9.3μl edc-hcl的400mm dmso溶液和9.3μlnhs的400mm dmso溶液。
[0326]
《实施例33.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、修饰有磺基甜菜碱的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0327]
依照实施例1的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 sbeta dgl g4。然而，添加3-[[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基铵基]丙烷-1-磺酸盐(sigma-aldrich公司制造)，在60℃下搅拌，来代替添加甲基-peg12-nhs，在25℃下搅拌。
[0328]
《实施例34.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、导入有二甲基胺的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0329]
依照实施例32的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 tn dgl g4。然而，使用二甲基氨基丙酸盐酸盐(东京化成工业公司制造)代替乙醇酸。
[0330]
《实施例35.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、导入有丁基的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0331]
依照实施例32的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 nbu dgl g4。然而，使用正戊酸(关东化学公司制造)代替乙醇酸。
[0332]
《实施例36.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、导入有异丁基的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0333]
依照实施例32的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 ibu dgl g4。然而，使用异戊酸(东京化成工业公司制造)代替乙醇酸。
[0334]
《实施例37.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、导入有吗啉代基的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0335]
依照实施例32的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 mp dgl g4。然而，使用3-吗啉-4-基-丙酸(santa cruz biotechnology公司制造)代替乙醇酸。
[0336]
《实施例38.在核心处使用第4世代聚赖氨酸树形接枝物的、导入有硫代吗啉代基的af5标签化crgd结合型寡核酸缀合物的制造》
[0337]
依照实施例32的合成，合成寡核酸缀合物crgd-peg5k sirna af5 tp dgl g4。然而，使用4-硫代吗啉基乙酸盐酸盐(fluorochem公司制造)代替乙醇酸。
[0338]
《比较例1.细胞非识别型寡核酸缀合物的制造》
[0339]
(a)mpeg5k spdp af5 dgl g4的合成
[0340]
向10μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加1.53μl peg12-spdp的300mm dmso溶液、1.17μl tea的50v/v％dmf溶液、1.28μl alexa fluor 546nhs酯的30mm dmso溶液，在室
温下搅拌4.5小时。随后，向该反应液中添加68.9μl mpeg5k-nhs(iris biotech公司制造，peg的数均分子量：5000，批号：1217558)的20mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌18小时。随后，添加15.3μl甲基-peg12-nhs酯的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与mpeg5k-nhs、peg12-spdp、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物mpeg5k spdp af5 dgl g4。向反应液中添加400μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至100μl。
[0341]
(b)mpeg5k sirna af5 dgl g4的合成
[0342]
对于10μl(a)中所示mpeg5k spdp af5 dgl g4的水溶液，添加6.0μl 3m的氯化钠水溶液和36.0μl sirna的5.1mm pbs溶液，在25℃下搅拌15小时，由此使mpeg5k spdp af5 dgl g4所具有的二硫化吡啶基与sirna所具有的sh基反应。使用hiprep 16/60sephacryl s-200hr通过凝胶过滤来纯化反应液(洗脱液：pbs)，回收包含结合了sirna的dgl g4的级分。将回收的溶液通过超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将液体体积调整至95μl，得到寡核酸缀合物mpeg5k sirnaaf5 dgl g4的溶液。
[0343]
《参考例1.修饰有peg2000的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的制造》
[0344]
(a)叠氮化物-peg2kaf5 dgl g4的合成
[0345]
向3.5μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加2.68μl alexa fluor 546nhs酯的5mm dmso溶液和2.05μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌6.5小时。随后，向该反应液中添加12.9μl叠氮化物-peg2k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：2000，批号：190220)的75mm dmso溶液、4.82μl nhs的400mm dmso溶液和4.82μl edc-hcl的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌17.5小时。随后，添加4.9μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与叠氮化物-peg2k-nhs、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg2k af5 dgl g4。向反应液中添加3ml纯水并混合后，使用纯水通过超滤(截留分子量30kda)纯化6次。将回收的水溶液通过反相hplc(柱：waters公司制造xbridgepeptide beh c184.6
×
180mm，洗脱液a：0.1％tfa水溶液/乙腈(90/10；v/v)，洗脱液b：0.1％tfa水溶液/乙腈(10/90；v/v))进行纯化，分离出目标级分。使用超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)将分离出级分的溶剂置换为pbs，将溶液体积调整至110μl。
[0346]
(b)cy7-peg2k af5 dgl g4的合成
[0347]
向40μl(a)中得到的叠氮化物-peg2k af5 dgl g4中添加8.8μl cy7-dbco(click chemistry tools制造)的20mm水溶液和5.4μl dmso，在40℃下搅拌13.5小时，由此使叠氮化物-peg2k af5 dgl g4所具有的叠氮基与cy7-dbco所具有的dbco基反应。随后，添加47μl pbs后，使用nap-5柱进行纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量10kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到纳米粒子化合物cy7-peg2kaf5 dgl g4的溶液。使用紫外-可见分光光度计，由分别在554nm和754nm处的吸收的测定值求得所得溶液的alexa fluor 546的浓度和cy7的浓度。此外，使用下述aqc法通过氨基酸定量分析求得dgl g4的浓度。由这些浓度，算出结合至一个dgl g4的cy7的数目。由cy7的数目求得的peg2k的数目为21。因此，可以说在(a)中合成的叠氮化物-peg2k af5 dgl g4中的peg2k的数目也为21。
[0348]
《参考例2.修饰有peg5000的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的制造》
[0349]
(a)叠氮化物-peg5kaf5 dgl g4的合成
[0350]
向7.0μl dgl g4的25mg/ml dmso溶液中添加1.34μl alexa fluor 546nhs酯的10mm dmso溶液和1.03μl tea的20v/v％dmf溶液，在室温下搅拌7小时。随后，向该反应液中添加16.1μl叠氮化物-peg5k-nhs(nanocs公司制造，peg的数均分子量：5000，批号：2005ec)的30mm dmso溶液、2.41μlnhs的400mm dmso溶液和2.41μl edc-hcl的400mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌16小时。随后，添加4.9μl甲基-peg12-nhs的200mm dmso溶液，进一步在室温下搅拌6小时。如上所述，使dgl g4的氨基与叠氮化物-peg5k-nhs、alexa fluor 546nhs酯和甲基-peg12-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k af5 dgl g4。向反应液中添加3ml纯水并混合后，使用纯水通过超滤(截留分子量30kda)纯化6次。将回收的水溶液通过反相hplc(柱：waters公司制造xbridge peptide beh c184.6
×
180mm，洗脱液a：0.1％tfa水溶液/乙腈(90/10；v/v)，洗脱液b：0.1％tfa水溶液/乙腈(10/90；v/v))进行纯化，分离出目标级分。使用超滤(截留分子量10kda)将分离出级分的溶剂置换为pbs，将溶液体积调整至200μl。
[0351]
(b)af405-peg5kaf5 dgl g4的合成
[0352]
向100μl(a)中得到的叠氮化物-peg5k af5 dgl g4中添加5.12μl afdye(注册商标)405dbco(click chemistry tools制造)的1mm dmso溶液，在室温下搅拌30小时，由此使叠氮化物-peg5kaf5dgl g4所具有的叠氮基与afdye 405dbco所具有的dbco基反应。随后，使用nap-5柱来进行反应液的纯化。将回收的溶液使用超滤(截留分子量30kda)进行浓缩，将溶液体积调整至110μl，得到纳米粒子化合物af405-peg5k af5 dgl g4的溶液。使用紫外-可见分光光度计，由分别在405nm和554nm处的吸收的测定值求得所得溶液的afdye 405的浓度和alexa fluor 546的浓度。此外，使用下述aqc法通过氨基酸定量分析求得dgl g4的浓度。由这些浓度算出结合至一个dgl g4的afdye 405的数目。由afdye 405的数目求得的peg5k的数目为26。因此，可以说在(a)中合成的叠氮化物-peg5kaf5dgl g4中的peg5k的数目也为26。
[0353]
《参考例3.导入有吗啉代基的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的制造》
[0354]
向50μl dgl g4的50mg/ml dmso溶液中添加2.6μl peg12-spdp的300mm dmso溶液和0.26μl tea的50v/v％dmf溶液，在室温下搅拌2小时。添加38.3μl mpeg2k-nhs(iris biotech公司制造，peg的数均分子量：2000)的20mm dmso溶液和1.3μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌2小时。随后，将187.2μl 3-吗啉-4-基-丙酸的100mm dmso溶液、93.6μl edc-hcl的400mm dmso溶液和93.6μl nhs的400mm dmso溶液混合，并且添加31.3μl tea的10v/v％dmf溶液，在室温下搅拌过夜。如上所述，使dgl g4的氨基与3-吗啉-4-基-丙酸的cooh基以及peg12-spdp和mpeg2k-nhs的nhs基反应，由此得到纳米粒子化合物mpeg2k spdp mp dgl g4。向反应液中添加700μl纯水并混合后，使用纯水通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量10kda)纯化6次。向回收的水溶液中添加纯水，将液体体积调整至100μl。
[0355]
《参考例4.导入有硫代吗啉代基的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的制造》
[0356]
依照参考例3的合成，合成纳米粒子化合物mpeg2k spdp tp dgl g4。然而，使用4-硫代吗啉基乙酸盐酸盐代替3-吗啉-4-基-丙酸。
[0357]
《参考例5.导入有mpeg12的第4世代聚赖氨酸树形接枝物的制造》
[0358]
依照参考例3的合成，合成纳米粒子化合物mpeg2k spdp mpeg12 dgl g4。然而，使用甲基-peg12-nhs代替3-吗啉-4-基-丙酸。
[0359]
《参考例6.用于评价实施例13的寡核酸缀合物的纳米粒子化合物的制造》
[0360]
依照实施例13的合成，合成纳米粒子化合物af4-peg5k sirna af6 dgl g4。然而，使用afdye405 dbco(click chemistry tools公司制造)代替ind-dbco。所得纳米粒子化合物中荧光分子afdye405的数目可以说与实施例13中得到的寡核酸缀合物中的茚达曲林的数目相等。
[0361]
《参考例7.用于评价实施例14～17的寡核酸缀合物的纳米粒子化合物的制造》
[0362]
依照实施例14的合成，合成纳米粒子化合物af4-peg5k sirna af6 dgl g4。然而，使用afdye405 dbco(broadpharm公司制造)代替nu1-dbco。所得纳米粒子化合物中的荧光分子afdye405的数目可以说与实施例14的(b)中得到的纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k sirna af6 dgl g4中的亲水性接头(即叠氮基的数目)的数目相等。
[0363]
《参考例8.用于评价实施例14的寡核酸缀合物的寡核酸缀合物的制造》
[0364]
对于30μl实施例14中得到的寡核酸缀合物的pbs溶液，添加1.6μl afdye405 dbco的pbs溶液和3.5μl dmso，在25℃下搅拌14小时。使用zeba(注册商标)旋转脱盐柱(thermo fisher scientific公司制造，分子量截留：40kda)来纯化反应液。随后，使用pbs通过超滤(merck公司制造，amicon ultra，截留分子量30kda)纯化3次，将液体体积调整至70μl，得到寡核酸缀合物af4-nu1-peg5k sirna af6 dgl g4的溶液。所得寡核酸缀合物中的荧光分子afdye405的数目可以说与实施例14中得到的寡核酸缀合物中的未反应的亲水性接头(即未反应的叠氮基)的数目相等。因此，所得寡核酸缀合物af4-nu1-peg5k sirnaaf6 dgl g4中的适体as1411的数目可通过从参考例7中得到的纳米粒子化合物af4-peg5k sirnaaf6 dgl g4中的荧光分子afdye405的数目减去寡核酸缀合物af4-nu1-peg5k sirna af6 dgl g4中的荧光分子afdye405的数目而求得，该值可以说与实施例14中得到的寡核酸缀合物中的适体as1411的数目相等。
[0365]
《参考例9.用于评价实施例15的寡核酸缀合物的寡核酸缀合物的制造》
[0366]
依照参考例8的合成，得到寡核酸缀合物af4-nu2-peg5k sirna af6 dgl g4的溶液。然而，使用实施例15中得到的寡核酸缀合物代替实施例14中得到的寡核酸缀合物。
[0367]
《参考例10.用于评价实施例16的寡核酸缀合物的寡核酸缀合物的制造》
[0368]
依照参考例8的合成，得到寡核酸缀合物af4-ep1-peg5k sirna af6 dgl g4的溶液。然而，使用实施例16中得到的寡核酸缀合物代替实施例14中得到的寡核酸缀合物。
[0369]
《参考例11.用于评价实施例17的寡核酸缀合物的寡核酸缀合物的制造》
[0370]
依照参考例8的合成，得到寡核酸缀合物af4-ep2-peg5k sirna af6 dgl g4的溶液。然而，使用实施例17中得到的寡核酸缀合物代替实施例14中得到的寡核酸缀合物。
[0371]
《试验例1.寡核酸缀合物的评价》
[0372]
实施例和比较例的寡核酸缀合物如下进行评价。
[0373]
(a)寡核酸、细胞内化促进剂和荧光分子的数目的评价
[0374]
实施例和比较例的寡核酸缀合物样品中的寡核酸、细胞内化促进剂和荧光分子的浓度如下求得。使用紫外-可见分光光度计，由以下波长的吸收的测定值求得寡核酸、叶酸和荧光分子的浓度：寡核酸(sirna和反义核酸)为260nm，叶酸为300nm，afdye405为402nm，
alexa fluor 546为554nm，alexa fluor 647为651nm以及tide fluor 7ws为749nm。此外，通过以下中所示氨基酸定量分析(ptc法或aqc法)，定量样品中的树状聚合物与多肽类的细胞内化促进剂的浓度。实施例1和比较例1的样品使用ptc法，除此之外的实施例的样品使用aqc法。
[0375]
关于实施例13的寡核酸缀合物样品中的茚达曲林的数目，合成将实施例13的寡核酸缀合物中的茚达曲林用荧光分子afdye405置换的纳米粒子化合物(参考例6)，求得该纳米粒子化合物中的afdye405的数目，将其视作实施例13的寡核酸缀合物中的茚达曲林的数目。
[0376]
关于具有作为细胞内化促进剂的适体的实施例14～17的寡核酸缀合物样品，通过求得使适体反应前的合成中间体(纳米粒子化合物)中的寡核酸的数目，来确定样品中的寡核酸的数目。此外，关于样品中的适体的数目，如下求出。首先，合成将实施例14～17的寡核酸缀合物中的适体用荧光分子afdye405置换的纳米粒子化合物(参考例7)，求得该纳米粒子化合物中的荧光分子的数目(与使适体反应前的合成中间体中的亲水性接头的数目相等)。另外，准备使实施例14～17的寡核酸缀合物进一步与荧光分子afdye405反应的寡核酸缀合物(参考例8～11)，求得该寡核酸缀合物中的afdye405的数目(与使适体反应后所剩余的未反应亲水性接头的数目相等)。然后，求得这些afdye405的数目之差，将其视作实施例14～17的寡核酸缀合物中的适体的数目。
[0377]
由这些浓度算出结合至一个树状聚合物的寡核酸、细胞内化促进剂和荧光分子的数目。算出的结果在以下的各试验例或表3中显示。
[0378]
[表3]
[0379][0380]
(a-1)氨基酸定量分析(ptc法)
[0381]
向可密封的玻璃瓶中添加30μl寡核酸缀合物样品的水溶液和300μl恒沸点盐酸，进行密封，在105℃下24加热小时进行水解。将反应液在45℃下加热同时减压除去溶剂后，添加150μl乙腈/吡啶/tea/纯水的混合液(10/5/2/3；v/v/v/v)，进一步地在45℃下加热同时减压除去溶剂。添加150μl乙腈/吡啶/tea/纯水/pitc的混合液(10/5/2/3/1；v/v/v/v/v)，在25℃下搅拌30分钟后，在45℃下加热同时减压除去溶剂。所用pitc为富士胶片和光纯药株式会公司制造的。将所得固体通过反相hplc(柱：富士胶片和光纯药株式会公司制造的wakopakwakosil-ptc 4.0
×
250mm，洗脱液a：ptc-氨基酸流动相a，洗脱液b：ptc-氨基酸流动相b)进行分析，由赖氨酸残基峰的积分值定量dgl g4的浓度，此外，由苯丙氨酸残基峰的积分值定量crgdek的浓度。
[0382]
(a-2)氨基酸定量分析(aqc法)
[0383]
向可密封玻璃瓶中添加30μl寡核酸缀合物样品的水溶液和300μl恒沸点盐酸，进行密封，在110℃下加热24小时进行水解。水解后，将反应液在45℃下加热同时减压除去溶剂。将aqc(adipogen life sciences公司制造)用60℃的乙腈(超脱水)进行溶解，调整至
3mg/ml。对于装有干燥的寡核酸缀合物样品的玻璃瓶，添加30μl20mm盐酸、90μl 0.2m硼酸缓冲液(ph8.8)、30μl 3mg/ml aqc乙腈溶液并搅拌，在60℃下进行静置。静置10分钟后，在45℃下加热同时减压除去溶剂。将所得固体用150μl洗脱液a溶解后，进行过滤器过滤(merck公司制造的ultraeree；-mc，gv，0.22μm)。将所得滤液通过反相hplc(柱：accq-tag柱，4μm 3.9
×
150mm，洗脱液a：accq-tag洗脱液a/水(1/9；v/v)，洗脱液b：水/乙腈(1/1；v/v))进行分析，由赖氨酸残基峰的积分值定量dgl g3、dgl g4和dgl g5的浓度，此外，由分别的固有峰的积分值定量pamam g5、pamam g6、bis-mpa树形高分子、crgdek、c(avb6)和ge11的浓度。accq-tag柱和accq-tag洗脱液a从waters corporation公司购入。
[0384]
(b)寡核酸缀合物的粒度分布评价
[0385]
使用粒径分析装置(malvern panalytical制造的zetasizer nano zs)评价比较例1中所得的mpeg5k sirna af5 dgl g4的平均粒径。小室(cell)使用malvern panalytical制造的zen0040通过动态光散射法测定。所得结果在表4中显示。
[0386]
[表4]
[0387][0388]
(c)寡核酸缀合物水合层厚度h的评价
[0389]
如上所述，求得结合至树状聚合物的亲水性接头的末端间的直线距离平均值，可使用利用将彼此长度不同的亲水性接头结合的多种树状聚合物的方法。具体而言，可通过测定这些粒径，作出亲水性接头的分子量和亲水性接头的末端间距离的校准曲线，来推断实验上未使用的分子量的亲水性接头的末端间距离。作为一个实例，以下中显示使用peg作为亲水性接头，用两种样品作成校准曲线的情况。
[0390]
实施例的寡核酸缀合物水合层的厚度h(即peg5k的末端间的直线距离的平均值)如下求得。首先，使用粒径分析装置(malvern panalytical制造的zetasizer ultra)，通过多角度动态光散射法测定参考例1中的纳米粒子化合物叠氮化物-peg2k af5 dgl g4和参考例2中的纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k af5 dgl g4的平均粒径。使用sarstedt公司制造的比色皿(产品编号：67.754)作为小室。结果在表5中显示。接下来，由叠氮化物-peg5kaf5 dgl g4的平均粒径和叠氮化物-peg2k af5 dgl g4的平均粒径之差算出每单位分子量的peg的水合层厚度。具体而言，每个分子量1000的peg的水合层厚度被计算为(32.9-21.5)/[2
×
(5000-2000)]
×
1000＝1.9nm。由该结果，具有以分子量5000的peg作为亲水性接头的实施例的寡核酸缀合物水合层的厚度h被计算为5000/1000
×
1.9＝9.5nm。换言之，可以说亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值为9.5nm。另一方面，在实施例中，由于sirna(分子长度：约5nm)借由peg12(分子量约500的peg)和spacer18(分子量约250的peg)结合至树状聚合物，因此从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值被计算为5+(500+250)/1000
×
1.9＝6.4nm。因此，可以说在实施例的寡核酸缀合物中，亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值比sirna的长度长，并且也比从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值长。然而，本分析结果和本考察仅限于使用参考例1和2的纳米粒子化合物作为样品，并且假定peg分子量和水合层厚度为线性关系的情况。作为一个实
例，显示了两点近似的实例，但为了更正确地进行分析，合乎期望的是进行多点近似。
[0391]
[表5]
[0392][0393]
(d)亲水性接头的末端间的直线距离的平均值与寡核酸长度的比较
[0394]
使用粒径分析装置(malvern panalytical制造的zetasizer ultra)，通过多角度动态光散射法测定在实施例25的(a)中得到的纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k spdp af5 dgl g4和在该纳米粒子化合物上结合了sirna的纳米粒子化合物叠氮化物-peg5k sirna af5 dgl g4(在实施例25的(b)中合成)的平均粒径。使用sarstedt公司制造的比色皿(产品编号：67.754)作为小室。同样地，测定实施例26的合成过程中得到的纳米粒子化合物叠氮化物-peg10k spdp af5 dgl g4和在该纳米粒子化合物上结合了sirna的纳米粒子化合物叠氮化物-peg10k sirna af5 dgl g4(以实施例26的合成过程获取)的平均粒径。结果在表6中显示。
[0395]
[表6]
[0396][0397]
在将peg5k(分子量5000的peg)作为亲水性接头使用的情况下，通过使杂乱-sirna结合至核心处而将纳米粒子化合物的平均粒径增大5.4nm。由该结果可以说从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值比亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值长2.7nm。因此，可知与试验例1的(c)中的结果相反，在具有亲水性接头peg5k的实施例的寡核酸缀合物中，亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值比从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值短。
[0398]
另一方面，在将peg10k(分子量10000的peg)作为亲水性接头使用的情况下，即使将杂乱-sirna结合至核心，纳米粒子化合物的平均粒径也几乎不变化。由该结果可以说亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值比从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值长。
[0399]
需要说明的是，从核心表面到sirna的游离末端的直线距离的平均值比亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值长2.7nm，因此，如果亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值为1.35nm以上且不足2.7nm，则可以说该直线距离的平均值为从核心表面到寡核酸的游离末端的长度的三分之一以上且不足一半。此外，如果亲水性接头peg5k的末端间的直线距离的平均值为2.7nm以上，则可以说该直线距离的平均值为从核心表面到寡核酸的游离末端的长度的一半以上。
[0400]
然而，本分析结果仅限于本次的合成批次，在使用同分子量的材料的情况下并不普遍化。为了进行亲水性接头的末端间的直线距离的平均值与寡核酸长度的比较，需要对每个合成批次进行相同的分析。
[0401]
《试验例2.crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0402]
在96孔板中接种人类神经胶质母细胞瘤细胞株(u-87mg)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。转染后48小时，在用pbs洗涤细胞后，测定荧光强度(激发波长540nm，荧光波长585nm)。进一步地，由sirna和荧光分子的数目之比(sirna的数目/荧光分子的数目)，将sirna浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为0.1μm或1μm时的荧光强度。所使用的样品在表7中显示，所得结果在图2中显示。
[0403]
表7中，mpeg-siatp5b对应于比较例1，crgd-siatp5b对应于实施例1。
[0404]
[表7]
[0405]
样品mpeg-siatp5bcrgd-siatp5b对应实施例/比较例比较例1实施例1树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目20.835.5亲水性接头peg5kpeg5k细胞内化促进剂-crgdfk细胞内化促进剂的数目-25.4荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目6.716.9加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0406]
在96孔板中接种人类神经胶质母细胞瘤细胞株(u-87mg)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。对于对照组，加入pbs代替样品。转染后48小时，使用rneasy mini kit(qiagen公司制造)提取mrna，使用high capacity rna-to-cdna kit(applied biosystems(注册商标))由一定量的mrna合成cdna。接着，将所得cdna作为模板，使用powerup sybr green mastermix(applied biosystems)实施定量rt-pcr。使用下表8中所示序列号12和序列号13的引物作为atp5b引物，使用下表8中所示序列号14和序列号15的引物作为gapdh引物。pcr
条件(温度和时间)如下。设计以在95℃下1秒、在60℃下30秒作为一个循环，实施40个循环。基于定量rt-pcr的结果，计算“hatp5b的表达量/hgapdh(内标基因)的表达量”的值，将关于对照组的计算结果和关于样品添加组的计算结果进行比较。所使用的样品在表7中显示，所得结果在图3中显示。
[0407]
[表8]
[0408][0409]
《试验例3.使用crgd配体结合型寡核酸缀合物的sirna序列特异性敲减活性的评价》
[0410]
在96孔板中接种人类神经胶质母细胞瘤细胞株(u-87mg)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。对于对照组，加入pbs代替样品。转染后48小时，使用rneasy mini kit(qiagen公司制造)提取mrna，使用high capacity rna-to-cdna kit(applied biosystems)由一定量的mrna合成cdna。接着，将所得cdna作为模板，使用powerup sybr green master mix(applied biosystems)实施定量rt-pcr。使用上表8中所示序列号12和序列号13的引物作为atp5b引物，使用上表8中所示序列号14和序列号15的引物作为gapdh引物。pcr条件(温度和时间)如下。设计以在95℃下1秒、在60℃下30秒作为一个循环，实施40个循环。基于定量rt-pcr的结果，计算“hatp5b的表达量/hgapdh(内标基因)的表达量”的值，将关于对照组的计算结果和关于样品添加组的计算结果进行比较。所使用的样品在表9中显示，所得结果在图4中显示。
[0411]
表9中，mpeg-siatp5b对应于比较例1，其余样品对应于实施例1。
[0412]
[表9]
[0413]
样品mpeg-siatp5bcrgd-si杂乱crgd-siatp5b对应实施例/比较例比较例1实施例1实施例1树状聚合物dgl g4dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirna杂乱-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目20.818.028.0亲水性接头peg5kpeg5kpeg5k细胞内化促进剂-crgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目-26.225.6荧光分子alexafluor 546alexafluor 546alexafluor 546
荧光分子的数目6.75.86.1加帽剂甲基-peg12甲基-peg12甲基-peg12
[0414]
《试验例4.ge11配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0415]
在96孔板中接种人类鳞状细胞癌细胞株(a431)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。转染后48小时，在用pbs洗涤细胞后，测定荧光强度(激发波长540nm，荧光波长585nm)。进一步地，由sirna和荧光分子的数目之比(sirna的数/荧光分子的数目)，将sirna浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子浓度为0.1μm或1μm时的荧光强度。所使用的样品在表10中显示，所得结果在图5中显示。
[0416]
表10中，mpeg-siatp5b对应于比较例1，ge11-siatp5b对应于实施例2。
[0417]
[表10]
[0418]
样品mpeg-siatp5bge11-siatp5b对应实施例/比较例比较例1实施例2树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目20.821.5亲水性接头peg5kpeg5k细胞内化促进剂-ge11细胞内化促进剂的数目019.1荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目6.78.2加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0419]
在96孔板中接种人类鳞状细胞癌细胞株(a431)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。对于对照组，加入pbs代替样品。转染后48小时，使用rneasy mini kit(qiagen公司制造)提取mrna，使用high capacity rna-to-cdna kit(applied biosystems)由一定量的mrna合成cdna。接着，将所得cdna作为模板，使用powerup sybr green master mix(applied biosystems)实施定量rt-pcr。使用上表8中所示序列号12和序列号13的引物作为atp5b引物，使用上表8中所示序列号14和序列号15的引物作为gapdh引物。pcr条件(温度和时间)如下。设计以在95℃下1秒、在60℃下30秒作为一个循环，实施40个循环。基于定量rt-pcr的结果，计算“hatp5b的表达量/hgapdh(内标基因)的表达量”的值，将关于对照组的计算结果和关于样品添加组的计算结果进行比较。所使用的样品在表10中显示，所得结果在图6中显示。
[0420]
《试验例5.在核心处使用pamam的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0421]
在96孔板中接种人类神经胶质母细胞瘤细胞株(u-87mg)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的树形高分子
浓度为2nm或10nm。转染后48小时，在用pbs洗涤细胞后，测定荧光强度(激发波长740nm，荧光波长780nm)。进一步地，由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为5nm或25nm时的荧光强度。所使用的样品在表11中显示，所得结果在图7中显示。
[0422]
表11中，crgd-dgl4对应于实施例5，crgd-pam5对应于实施例3，crgd-pam6对应于实施例4。
[0423]
[表11]
[0424]
样品crgd-dgl4crgd-pam5crgd-pam6对应实施例534树状聚合物dgl g4pamam g5pamam g6寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目25.613.915.9亲水性接头peg5kpeg5kpeg5k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目19.910.520.8荧光分子tidefluor 7wstidefluor 7wstidefluor 7ws荧光分子的数目2.91.02.0加帽剂甲基-peg12甲基-peg12甲基-peg12
[0425]
在96孔板中接种人类神经胶质母细胞瘤细胞株(u-87mg)，使用含有10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。次日，在交换培养基的同时向各孔中加入样品，转染细胞，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm。对于对照组，加入pbs代替样品。转染后48小时，使用rneasy mini kit(qiagen公司制造)提取mrna，使用high capacity rna-to-cdna kit(applied biosystems(注册商标))由一定量的mrna合成cdna。接着，将所得cdna作为模板，使用powerup sybr green master mix(applied biosystems)实施定量rt-pcr。使用上表8中所示序列号12和序列号13的引物作为atp5b引物，使用上表8中所示序列号14和序列号15的引物作为gapdh引物。pcr条件(温度和时间)如下。设计以在95℃下1秒、在60℃下30秒作为一个循环，实施40个循环。基于定量rt-pcr的结果，计算“hatp5b的表达量/hgapdh(内标基因)的表达量”的值，将关于对照组的计算结果与关于样品添加组的计算结果进行比较。所使用的样品在表11中显示，所得结果在图8中显示。
[0426]
《试验例6.具有各种修饰数的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0427]
依照试验例5的程序实施向细胞的摄取评价。转染时间点的样品的树形高分子浓度为2nm或10nm。荧光强度在激发波长540nm，荧光波长580nm下进行测定。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为10nm或50nm时的荧光强度。所使用的样品在表12中显示，所得结果在图9中显示。
[0428]
依照试验例5的程序实施敲减活性评价。所使用的样品在表12中显示，所得结果在图10中显示。
[0429]
[表12]
[0430][0431]
《试验例7.整联蛋白αvβ6靶肽配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0432]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。作为细胞，使用人类肺腺癌细胞株(h2009)。荧光强度在激发波长540nm，荧光波长580nm下进行测定。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为5nm或25nm时的荧光强度。所使用的样品在表13中显示，所得结果在图11中显示。
[0433]
依照试验例6的程序实施敲减活性评价。转染时间点的样品的sirna浓度为0.05μm或0.5μm。所使用的样品在表13中显示，所得结果在图12中显示。
[0434]
[表13]
[0435]
样品n3-dgl4c(avb6)-dgl4对应实施例1(b)中所得合成中间体11树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目30.221.9亲水性接头peg5kpeg5k细胞内化促进剂-c(avb6)细胞内化促进剂的数目-16.5荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目2.54.4加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0436]
《试验例8.叶酸配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0437]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。作为细胞，使用人类口腔表皮样癌细
胞株(kb)。转染时间点的样品的荧光浓度为10nm或100nm。所使用的样品在表14中显示，所得结果在图13中显示。
[0438]
[表14]
[0439]
样品n3-dgl4fa-dgl4对应实施例1(b)中所得合成中间体12树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目20.528.5亲水性接头peg5kpeg5k细胞内化促进剂-叶酸细胞内化促进剂的数目-31.5荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目10.08.9加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0440]
《试验例9.核仁素靶适体配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0441]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。作为细胞，使用人类乳癌细胞株(mcf-7)。转染时间点的样品的树形高分子浓度为3nm、10nm或30nm。荧光强度在激发波长650nm，荧光波长695nm下进行测定。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为6nm、20nm或60nm时的荧光强度。所使用的样品在表15中显示，所得结果在图14中显示。
[0442]
依照试验例6的程序实施敲减活性评价。转染时间点的样品的树形高分子浓度为3nm、10nm或30nm。所使用的样品在表15中显示，所得结果在图15中显示。
[0443]
[表15]
[0444][0445]
《试验例10.使用不同世代数的聚赖氨酸树形接枝物的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0446]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价和敲减活性评价。所使用的样品在表
16中显示，所得结果在图16和图17中显示。
[0447]
[表16]
[0448]
样品crgd-dgl3crgd-dgl4crgd-dgl5对应实施例18119树状聚合物dgl g3dgl g4dgl g5寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目10.925.344.8亲水性接头peg5kpeg5kpeg5k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目7.223.640.5荧光分子alexafluor 546alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目1.56.514.0加帽剂甲基-peg12甲基-peg12甲基-peg12
[0449]
《试验例11.修饰有不同分子量的peg的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价1》
[0450]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。转染时间点的样品的树形高分子浓度为2nm或10nm。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为20nm或100nm时的荧光强度。所使用的样品在表17中显示，所得结果在图18中显示。
[0451]
[表17]
[0452]
[0453]
《试验例12.修饰有不同分子量的peg的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价2》
[0454]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。所使用的样品在表18中显示，所得结果在图19中显示。
[0455]
[表18]
[0456]
样品crgd-peg5k-dgl4crgd-peg10k-dgl4对应实施例2526树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirna杂乱-sirna寡核酸的数目18.313.1亲水性接头peg5kpeg10k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目34.821.8荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目1.73.7加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0457]
《试验例13.使用pmeox的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0458]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。转染时间点的样品的树形高分子浓度为4nm或20nm。荧光强度在激发波长740nm、荧光波长780nm下进行测定。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为10nm或50nm时的荧光强度。所使用的样品在表19中显示，所得结果在图20中显示。
[0459]
依照试验例6的程序实施敲减活性评价。所使用的样品在表19中显示，所得结果在图21中显示。
[0460]
[表19]
[0461]
样品crgd-peg5k-dgl4crgd-pmeox10k-dgl4对应实施例527树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目17.716.8亲水性接头peg5kpmeox10k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目14.014.7荧光分子tidefluor7wstidefluor7ws荧光分子的数目2.12.5加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0462]
《试验例14.使用psar的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0463]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价和敲减活性评价。所使用的样品在表20中显示，所得结果在图22和图23中显示。
[0464]
[表20]
[0465]
样品crgd-peg5k-dgl4crgd-psar10k-dgl4对应实施例128树状聚合物dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目27.221.5亲水性接头peg5kpsar10k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目20.722.9荧光分子alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目7.83.5加帽剂甲基-peg12甲基-peg12
[0466]
《试验例15.修饰有各种加帽剂的crgd配体结合型寡核酸缀合物的细胞评价》
[0467]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。转染时间点的样品的树形高分子浓度为2nm或10nm。由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为20nm或100nm时的荧光强度。所使用的样品在表21中显示，所得结果在图24中显示。
[0468]
依照试验例6的程序实施敲减活性评价。所使用的样品在表21中显示，所得结果在图25中显示。
[0469]
[表21]
[0470][0471]
《试验例16.修饰有具有质子化能力的加帽剂的crgd配体结合型寡核酸缀合物的
细胞评价》
[0472]
依照试验例6的程序实施向细胞的摄取评价。转染时间点的样品的sirna浓度为0.1μm或1μm，由荧光分子的数目将树形高分子浓度换算为荧光分子的浓度，在将荧光强度和荧光分子的浓度近似为正比关系的基础上，算出荧光分子的浓度为0.1μm或1μm时的荧光强度。所使用的样品在表22中显示，所得结果在图26中显示。
[0473]
依照试验例6的程序实施敲减活性评价。所使用的样品在表22中显示，所得结果在图27中显示。
[0474]
[表22]
[0475]
样品crgd-mpeg12-dgl4crgd-mp-dgl4crgd-tp-dgl4对应实施例13738树状聚合物dgl g4dgl g4dgl g4寡核酸atp5b-sirnaatp5b-sirnaatp5b-sirna寡核酸的数目35.514.216.8亲水性接头peg5kpeg5kpeg5k细胞内化促进剂crgdfkcrgdfkcrgdfk细胞内化促进剂的数目25.428.828.3荧光分子alexafluor 546alexafluor 546alexafluor 546荧光分子的数目16.910.111.4加帽剂甲基-peg12吗啉基硫代吗啉基
[0476]
《试验例17.修饰有具有质子化能力的加帽剂的树状聚合物的ph敏感性的评价》
[0477]
向样品中添加纯水，将各样品的树形高分子浓度调整至8.2μm。此外，将6-对甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐(tns，sigma-aldrich公司制造)溶解于dmso，调制2mg/ml的tns溶液。向12.4μl的各样品中添加487μl ph4.5、5.5、6.5或7.5的10mm柠檬酸-20mm磷酸缓冲生理盐水，进一步添加5μl tns溶液，进行剧烈搅拌。将各混合液向96孔板中的3处孔中各添加150μl后，测定荧光强度(激发波长325nm，荧光波长435nm)。将各ph下的荧光强度除以ph7.5下的荧光强度，计算相对荧光强度。所使用的样品在表23中显示，所得结果在图28中显示。
[0478]
[表23]
[0479]
样品mpeg12-dgl4mp-dgl4tp-dgl4参考例534树状聚合物dgl g4dgl g4dgl g4亲水性接头mpeg2kmpeg2kmpeg2k加帽剂甲基-peg12吗啉基硫代吗啉基
[0480]
产业上的可利用性
[0481]
本发明的一个方面所涉及的寡核酸缀合物可提高输送至细胞质内的寡核酸的量，因此可作为用于治疗或预防疾病的药物组合物或药物利用。
[0482]
符号说明
[0483]1···
寡核酸，2
···
细胞内化促进剂，3
···
亲水性接头，4
···
加帽剂，5
···
接头，10
···
核心，20
···
水合层，100
···
寡核酸缀合物。

技术特征：
1.寡核酸缀合物，其含有树状聚合物、多个寡核酸、一个或多个细胞内化促进剂以及一个或多个亲水性接头，各寡核酸直接地或借由接头结合至前述树状聚合物，各细胞内化促进剂借由前述亲水性接头结合至前述树状聚合物。2.权利要求1中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键、金属配位或主客体相互作用。3.权利要求1中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键或金属配位。4.权利要求1中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物与前述寡核酸的结合、前述树状聚合物与前述亲水性接头的结合、前述树状聚合物与前述接头的结合、前述细胞内化促进剂与前述亲水性接头的结合和前述接头与前述寡核酸的结合为共价键。5.权利要求1～4的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物的反应性官能团的至少一部分通过加帽剂来加帽。6.权利要求5中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自亲水性分子和疏水性分子的分子。7.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为亲水性分子。8.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自电中性的亲水性分子、在酸性条件下质子化的极性分子、阴离子性分子和阳离子性分子的亲水性分子。9.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自电中性的亲水性分子、在酸性条件下质子化的极性分子和阴离子性分子的亲水性分子。10.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为疏水性分子。11.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为1种以上的选自脂肪族化合物、芳香族化合物、三烷基胺和类固醇的分子。12.权利要求6中所述的寡核酸缀合物，其中前述加帽剂为脂肪族化合物。13.权利要求1～12的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物为树形接枝物或树形高分子。14.权利要求1～12的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物中的单体彼此通过酰胺键、酯键或糖苷键结合。15.权利要求1～12的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物中的单体彼此通过酰胺键或酯键结合。16.权利要求1～12的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述树状聚合物为聚-l-赖氨酸树形接枝物、聚酰胺胺树形高分子或2,2-双(羟基-甲基)丙酸树形高分子。17.权利要求1～16的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述寡核酸为基因表达控制剂。18.权利要求17中所述的寡核酸缀合物，其中前述基因表达控制剂为抑制mrna表达的分子。
19.权利要求17中所述的寡核酸缀合物，其中前述基因表达控制剂为rna干扰诱导核酸或反义核酸。20.权利要求1～19的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的五分之一以上。21.权利要求1～19的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的四分之一以上。22.权利要求1～19的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的三分之一以上。23.权利要求1～19的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的五分之二以上。24.权利要求1～19的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中各亲水性接头的末端间的直线距离的平均值为前述寡核酸长度的一半以上。25.权利要求1～24的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述亲水性接头为1种以上的选自聚乙二醇、聚(2-烷基-2-噁唑啉)、多肽和聚类肽的亲水性接头。26.权利要求1～24的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述亲水性接头为1种以上的选自聚乙二醇、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、ek肽和聚肌氨酸的亲水性接头。27.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为1种以上的选自低分子配体、多肽、适体、抗体或其片段、糖链和脂质的细胞内化促进剂。28.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为低分子配体。29.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为多肽。30.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为适体。31.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为抗体或其片段。32.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为糖链。33.权利要求1～26的任一项中所述的寡核酸缀合物，其中前述细胞内化促进剂为脂质。34.药物组合物，其含有权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物作为有效成分。35.针对下述疾病的治疗剂或预防剂，其含有权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物作为有效成分，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。36.用于治疗和/或预防下述疾病的方法，其包括给予治疗有效量的权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤
维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。37.权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物在用于制造针对下述疾病的治疗剂和/或预防剂中的应用，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。38.用于下述疾病的治疗和/或预防的权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物，所述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。39.一种药物，其含有权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物与针对疾病的1种以上的治疗剂和/或1种以上的预防剂的组合，前述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。40.寡核酸缀合物，其是用于与针对疾病的1种以上的治疗剂和/或1种以上的预防剂并用来治疗疾病的权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物，前述疾病选自：先天性代谢异常症、先天性内分泌疾病、单基因疾病、神经变性疾病、神经疾病、肌肉疾病、脑膜炎、脑炎、脑病、溶酶体病、恶性肿瘤、纤维化、炎症性疾病、免疫缺陷疾病、自身免疫疾病和感染性疾病。41.权利要求1～33的任一项中所述的寡核酸缀合物的制造方法，其包括：使多个寡核酸和一个或多个亲水性接头结合至树状聚合物的工序；以及使细胞内化促进剂结合至各亲水性接头的工序。42.权利要求41中所述的寡核酸缀合物的制造方法，其进一步包括：使加帽剂结合至前述树状聚合物的工序。

技术总结
本发明以使细胞内化促进剂与靶细胞效率良好地相互作用，提高输送至细胞质内的寡核酸的量为目的。本发明所涉及的寡核酸缀合物包含树状聚合物、多个寡核酸、一个或多个细胞内化促进剂以及一个或多个亲水性接头，各寡核酸直接地或借由接头结合至上述树状聚合物，各细胞内化促进剂借由上述亲水性接头结合至上述树状聚合物。状聚合物。状聚合物。


技术研发人员：上坂晃弘 牧田尚树 竹田昌史
受保护的技术使用者：住友制药株式会社
技术研发日：2021.10.08
技术公布日：2023/9/9