模拟皮肤微生物组的合成混合培养物的制作方法

模拟皮肤微生物组的合成混合培养物
发明领域
1.本发明涉及借助于模拟皮肤微生物组的合成混合培养物筛选化合物的生物活性的体外方法。
现有技术
2.作为身体最大的器官，人体皮肤是一种极其复杂和动态的基质，其功能是提供针对损伤和微生物侵害的物理屏障。如今，充分确立的是，皮肤是大量和广泛种类的微生物诸如细菌、真菌和病毒的家园。每平方厘米的皮肤被估计100万个细菌栖息，其中数百种不同的微生物物种以混合群体生活在一起。平衡的微生物群落与组织处于动态平衡(holland，k.t.，bojar，r.a.，am.j.clin.dermatol.，2002，3，445-449)，且因此可被视为皮肤的必要组分。通过多种机制，皮肤控制以下事实：微生物不能任意地传播，特别是阻止致病微生物。这些微生物及其基因构成人类皮肤微生物组。
3.研究已经显示，性别、年龄、生活方式、居住区域、遗传易感性、饮食和药物使用(药物摄入)与皮肤微生物组千丝万缕地相关。此外，各种压力源可以促进皮肤微环境内的代谢变化。
4.在特定条件下，致病微生物诸如致病细菌、酵母和霉菌对定殖的限制可能受损，并引起皮肤微生物群落的干扰。此类微生物的定殖可以破坏健康微生物组的平衡。当这些群体的平衡被严重破坏时-一种称为“生态失调”的状态-可以观察到对宿主的皮肤状况和人类健康的负面影响。
5.通过比较健康和患病状态下部位特异性的真皮微生物组，几项研究已经清楚地表明，疾病与微生物群及其宏基因组的组成的扰动有关。
6.在健康皮肤中，可以发现各种各样的微生物，而微生物组的多样性经常随着皮肤状况异常而降低。这已经在具有特应性皮炎的患者中进行研究，其中观察到皮肤中显著不同且多样性较低的细菌定殖模式-不仅在具有急性或慢性湿疹的受影响区域，而且在非发炎皮肤区域中也是如此。
7.因此，ep3049533公开了与特应性皮炎相关的细菌特征的表征及其在特应性皮炎的预后和/或诊断的体外方法、用于监测对治疗的反应的方法、用于监测特应性皮炎的发展的方法以及用于选择可用于预防和/或治疗特应性皮炎的化合物的方法中的用途。
8.频繁洗涤和使用特定化妆品两者先前都与改变皮肤微生物组相关。
9.bouslimani等人在bmc biology 2019，17：47中公开了护肤品对皮肤化学和微生物组动力学的影响。
10.wallen-russell在cosmetics 2019，6，2中公开了一项关于经常使用的化妆品在改变皮肤微生物组中的作用的分析。
11.此外，在ep2776836中已经公开了一种用于鉴定对人类皮肤共生微生物表现出益生元活性的测试剂和包含此类试剂的组合物的方法。该方法包括提供测试剂、人皮肤共生微生物和基本碳培养基的测试培养物。
12.所有现有技术的一个缺点是，所公开的方法或者在皮肤基质中进行并需要长时间段才能得出结果，或者所述方法因为不同微生物的量非常有限而甚至没有接近真实皮肤微生物组的复杂性。
13.本发明的一个目的是提供一种用于快速和可重复地测试化合物的方法，其也模拟天然存在的皮肤微生物组的复杂性。


技术实现要素：

14.令人惊讶地发现，权利要求1的方法能够为本发明的目的提供解决方案并且克服现有技术的至少一个缺点。
15.本发明因此提供了如权利要求1中所述的借助于模拟皮肤微生物组的合成混合培养物筛选化合物的生物活性的体外方法。
16.本发明进一步提供了如权利要求11中所述的模拟皮肤微生物组的合成混合培养物。
17.本发明的一个优点是本发明的方法在数小时内提供可靠的结果。
18.本发明的另一个优点是它能够模拟天然、健康人皮肤的微生物组及其由于外部施加的化合物而导致的变化。
19.本发明的一个进一步优点是可以有效地模拟不同身体区域的微生物组。
20.本发明的另一个优点是，节省资源，因为本发明的方法可以用最少的样品体积进行。
21.本发明的一个进一步优点是皮肤或皮肤样基质不是必需的。
22.本发明的另一个优点是代表用于机械和分子概况分析的明确定义且最可控的环境。
23.本发明的一个进一步优点是可以避免由种群结构、地理或环境条件的巨大差异导致的测量微生物群体的波动和变化。
24.本发明的另一个优点是可以极大地简化低生物量皮肤微生物组样品的收集和处理问题。
25.本发明的一个进一步优点是可以大大降低污染的风险。
26.本发明的一个方面因此为用于筛选化合物的生物活性的体外方法，所述方法包括以下步骤：
27.a)提供模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种不同细菌菌株的合成混合培养物，
28.b)在包含所述化合物的培养基中培养所述合成混合培养物一段时间，
29.c)在步骤b)之后测量所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况并将所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况与对照微生物组的多样性水平和/或多样性概况进行比较，和
30.d)通过步骤c)中获得的所述合成混合培养物和所述对照微生物组之间的偏差推断所述化合物的生物活性。
31.本发明上下文中的术语“生物活性”包括化合物在培养期间对合成混合培养物中含有的生物体在微生物的相对丰度如何改变的方面的影响。
kroppenstedtii)、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌(corynebacterium simulans)、纹带棒杆菌(corynebacterium striatum)、结核硬脂酸棒杆菌(corynebacterium tuberculostearicum)、干燥棒杆菌(corynebacterium xerosi)、气囊水栖菌(enhydrobacter aerosaccus)、藤黄微球菌(micrococcus luteus)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、头状葡萄球菌(staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)、缓症链球菌(streptococcus mitis)、口腔链球菌(streptococcus oralis)、假肺炎链球菌(streptococcus pseudopneumoniae)、血红链球菌(streptococcus sanguinis)和小韦荣氏球菌(veillonella parvula)。
47.皮肤可以在生理上分为不同的部位：
48.例如，小鱼际手掌和前臂掌侧被认为是干燥部位，
49.鼻孔、肘前窝、腹股沟皱缝、指间蹼(interdigital web)、胭窝被认为是潮湿部位，鼻翼皱缝、面颊、眉间、外耳道、柄状体、耳后皱缝、枕骨部和背部被认为是分泌皮脂部位，且
50.脚趾蹼空间、脚趾甲和足底跟被认为是足部部位。
51.当在本发明的方法的步骤a)中模拟不同皮肤部位的皮肤微生物组时，优选的是，
52.在模拟干燥部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，
53.a)结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、假肺炎链球菌、血红链球菌和小韦荣氏球菌，
54.在模拟潮湿部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，
55.b)非发酵棒杆菌、corynebacterium fastidiosum、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、气囊水栖菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，
56.在模拟分泌皮脂部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，
57.c)无枝菌酸棒杆菌、粘金色棒杆菌、克罗彭斯特棒杆菌、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和缓症链球菌，
58.在模拟足部部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，
59.d)非发酵棒杆菌、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。
60.模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，
61.痤疮丙酸杆菌、非发酵棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、干燥棒杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和缓症链球菌。
62.本发明的合成混合培养物不仅限于细菌物种，因为人类皮肤的微生物组还含有真核和病毒物种。
63.因此，根据本发明优选的是，本发明的步骤a)中的合成混合培养物包含真核和/或病毒物种，优选真核物种，优选马拉色菌属(malassezia)、曲霉属(aspergillus)、德巴利酵
母属(debaroyomyces)和隐球菌属(cryptococcus)，并且最优选马拉色菌属，且优选限制性马拉色菌(mrestricta)和球形马拉色菌(m.globosa)。
64.本发明的方法的一个优点是，且因此优选，步骤b)中的培养可以是在模拟皮肤微生物组的细菌菌株至少部分悬浮的情况下进行的。已经令人惊讶地发现，模拟皮肤微生物组的细菌菌株的生长比它们在基质上的生长更快，同时仍然经历多样性水平和/或多样性概况相同的变化。
65.根据本发明的步骤b)中的培养可以在通气、减少通气或不通气的情况下进行。
66.取决于通气等级(其可例如受氧气供应和/或培养基搅动程度的影响)，培养被认为是有氧或无氧的。
67.本发明上下文中的术语“无氧培养”意指在与培养基接触的氧浓度小于5vol.％的气体存在的情况下的培养。
68.本发明上下文中的术语“有氧培养”意指在与培养基接触的氧浓度为5vol.％或更高的气体存在的情况下的培养。
69.根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养无氧进行，更优选向与培养基接触的气体提供氮气。
70.根据本发明的一种替代优选方法的特征在于，步骤b)中的培养以低搅拌速率有氧进行，优选以小于800rpm的搅拌速率，更优选以50rpm至700rpm的搅拌速率，最优选以300rpm至600rpm的搅拌速率进行。
71.根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养在实验室培养皿中进行，所述实验室培养皿优选选自多孔板，优选选自6-、24-、48-、96-和384孔板。
72.根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养进行2小时至48小时、优选4小时至36小时、更优选6小时至24小时、甚至更优选8小时至20小时的时间段。
73.测量微生物组的多样性水平和/或多样性概况的不同方法是本领域技术人员众所周知的。它们的范围从sanger-测序、16s rrna分析、对转录间隔区1(its1)区域分析到全基因组测序，后者不经靶向扩增步骤即捕获微生物组中的遗传物质的全部互补序列。例如在wo2020150723中公开了微生物组的16s rrna分析以评价样品的多样性。例如在wo2015170979中公开了微生物组的转录间隔区1区域分析以评价样品的多样性。oh等人在cell 165，854-866(2016)中公开了通过鸟枪宏基因组测序评价微生物组的多样性的合适方法。
74.根据本发明的一种优选方法的特征在于，所述微生物组的多样性水平和/或多样性概况通过16s rrna分析进行测量。当合成混合培养物仅含有细菌菌株作为模拟皮肤微生物组的微生物时尤其如此。
75.在本发明的合成混合培养物包含真核和/或病毒物种的情况下，微生物组的多样性水平和/或多样性概况优选地通过鸟枪宏基因组测序来测量。
76.根据本发明的方法的步骤c)包括将所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况与对照微生物组的多样性水平和/或多样性概况进行比较。
77.这优选地包括确定合成混合培养物和对照微生物组中包含的微生物的相对丰度，以及确定两种培养物之间相对丰度的偏差。
78.根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤c)中的对照微生物组选自与所述合
成混合培养物相同培养、但在步骤b)开始时不含所述化合物和所述合成混合培养物的合成混合参考培养物，优选地，它是与所述合成混合培养物相同培养、但不含所述化合物的合成混合参考培养物。
79.根据本发明的方法的步骤d)包括通过步骤c)中获得的所述合成混合培养物和所述对照微生物组之间的偏差推断所述化合物的生物活性。
80.本领域技术人员将容易理解，当已经确定合成混合培养物中物种相对丰度的变化时，筛选的化合物具有什么生物活性：
81.例如，如果合成混合培养物的微生物组成在暴露于植物或微生物提取物时以与任何给定皮肤病相关的微生物物种的生长速率受到抑制的方式有所不同，而共生微生物物种显示出更高的生长，则该方法可用作可能对治疗所述皮肤病具有有益作用的化合物的早期诊断标志物。
82.l.weyrich等人在2015年在australasian journal of dermatology56(4)中发表了一篇综述文章，其描述了人类皮肤上改变的微生物群体和疾病之间的关联。
83.evonik正在商业化提供产品这是一种基于天然益生菌乳杆菌的无细胞提取物，其被设计为保持和恢复皮肤微生物群的自然平衡，促进有益细菌表皮葡萄球菌的生长，同时防止金黄色葡萄球菌的生长，所述金黄色葡萄球菌与皮炎和皮肤干燥相关。在本发明的方法中，可以在数小时内显示这两种细菌菌株的这种相对丰度变化。
84.本发明的另一个方面是模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种分离的不同细菌菌株的合成混合培养物。
85.本发明的合成混合培养物的优选实施方案在上文中描述为本发明方法的步骤a)中提供的优选合成混合培养物。
86.附图的简要说明
87.图1：在根据比率1用菌株混合物接种后，在未处理的有氧培养中在t＝28h时的模型微生物组组成
88.图2：在根据比率1用菌株混合物接种后，在未处理的无氧培养中在t＝22h时的模型微生物组组成
89.图3：与用化合物w、x、y或z处理的培养物的最终组成相比，在根据比率1用菌株混合物接种后，在未处理的有氧培养中在t＝28h时的模型微生物组组成
90.图4：与用化合物w、x、y或z处理的培养物的最终组成相比，在根据比率1用菌株混合物接种后，在未处理的无氧培养中在t＝22h时的模型微生物组组成
91.图5：用处理前五个健康人个体的平均微生物组。
92.图6：用处理后五个健康人个体的平均微生物组。
93.下文中所举例的实施例通过实例的方式描述了本发明，本发明的应用范围从整个说明书和权利要求中是显而易见的，且无意将本发明限于实施例中指定的实施方案。
实施例：
94.实施例1：核心皮肤微生物组模型的有氧培养
95.从冷冻培养物接种单个细菌菌株以起始预培养物生长。根据德国微生物和细胞培
养物保藏中心gmbh(german collection of microorganisms and cell cultures gmbh)的推荐，将bhi media(110493二merck kgaa，64293darmstadt)或dsmz培养基92或dsmz培养基535培养基用于预培养物培养。
96.菌株和生长条件概述于表1中。
97.为了避免饥饿，将单一smfb01001葡萄糖feedbead(kuhner shaker gmbh，kaiserstraβe 100，52134herzogenrath)添加至10ml预培养培养基中，如果指明的话。
[0098][0099][0100]
表1：菌株的预培养条件
[0101]
在培养结束时，使用bhi培养基稀释菌株以产生od
600
＝1的光密度。这些单一菌株培养物根据其生长特性以定义的菌株比率混合。
[0102]
导致高度多样培养物的示例比率概述于表2中。
[0103][0104][0105]
表2：不同起始群体中单一菌株培养物的份额[比率1-12]
[0106]
使用具有mtp-48-boh 1板的biolector[m2p-labs；arnold-sommerfeld-ring 2，52499baesweiler]小规模测试系统实施培养。
[0107]
根据表2中的比率，将100μl菌株混合物添加至1ml bhi培养基中，导致起始od
600
为0.091。培养在37℃、600rpm的振荡频率和85％的相对湿度下进行28小时，直至过程停止。
[0108]
在培养结束时，测定od
600
，并将剩余的培养物在eppendorf台式离心机中以4℃、
5000rpm和5分钟离心。弃去上清液，并将沉淀保存在-20℃。
[0109]
使用dneasy powersoil pro kit[qiagen gmbh，qiagen strasse 1，40724hilden]从这些样品中提取基因组dna。通过lgc genomics gmbh[ostendstraβe 25，12459berlin]使用引物对341f，seq.id no 1和785r，seq.id no 2或文库制备物和用于测序的ilumina miseq分析dna样品。
[0110]
结果由lgc genomics gmbh处理，并映射至含有在单独模型中存在的菌株序列的单独参考数据库。
[0111]
实施例2：核心皮肤微生物组模型的无氧培养
[0112]
如实施例1中实施预培养物培养和比率混合。使用具有mtp-48-boh 1板和无氧模块(包括用于氮气(n2)的外部质量流量控制器)的biolector[m2p-1abs；arnold-sommerfeld-ring 2，52499baesweiler]小规模测试系统进行无氧培养。
[0113]
根据表2中的比率，将100μl菌株混合物添加至1ml bhi培养基中，导致起始od
600
为0.091。培养在37℃、600rpm的振荡频率和氮气冲洗下进行22小时，直至过程停止。
[0114]
实施例3：测试化合物对核心微生物组模型的影响的表征
[0115]
如实施例1或2中实施预培养物培养、比率混合和培养。在t＝0、4、8、12、16或24小时将测试化合物添加至培养物中。在培养结束时，如实施例1或2中获取和处理样品，并将结果与未处理的培养物进行比较，以评估测试化合物对核心微生物组模型的影响。
[0116]
在有氧条件下比率1的培养导致od
600
＝17.2的光密度和如图1中所示的最终微生物组模型组成。
[0117]
在无氧条件下比率1的培养导致od
600
＝1.81的光密度和如图2中所示的最终微生物组模型组成。
[0118]
在处理有氧培养的培养物(该培养物以比率1接种并用化合物evonik(w)、来自evonik的cosmo c 100(肌酸)(x)、恶臭假单胞菌的无细胞裂解物(y)或来自basf的nso(月桂基醚硫酸钠)(z)在t＝0时处理)后，最终微生物组组成差异显著，如图3中所示。
[0119]
在我们的模型中引起金黄色葡萄球菌的显著减少，同时增加表皮葡萄球菌的丰度并将微生物多样性保持在不变的高水平。由于其显著减少金黄色葡萄球菌，可被视为一种微生物组阳性化合物，特别是对治疗特应性和/或皮肤干燥状况具有明显益处。
[0120]
在有氧条件下，用肌酸(一种细胞能量代谢的复苏剂)获得了与基线组成相比仅微小的变化：只有与皮肤健康相关的表皮葡萄球菌和人葡萄球菌的相对丰度略微增加且金黄色葡萄球菌相应地略微减少。因此，肌酸可被视为微生物组中性化合物。
[0121]
恶臭假单胞菌裂解物对基线偏移具有更大的影响，除了对头状葡萄球菌没有影响以及沃氏葡萄球菌的丰度相应增加外，所有物种都显著减少。由于其显著减少金黄色葡萄球菌，该裂解物可被视为微生物组阳性化合物。
[0122]
用刺激性表面活性剂月桂基醚硫酸钠处理引起微生物群体的剧烈转变，其中沃氏葡萄球菌的丰度显著增加，但以损害所有其他葡萄球菌物种为代价，即观察到多样性的显著丧失。由于一种物种的过度生长经常与致病性皮肤相关，因此在皮肤上使用纯化合物可
能引起对微生物组的负面影响。
[0123]
当比较同一起始培养物在有氧条件下与无氧条件下的生长模式时，令人惊讶地发现在有氧条件下形成混合的、以葡萄球菌为主的培养物，它可以模拟人体皮肤的分泌皮脂部位，并且也代表人体皮肤的潮湿部位。这些葡萄球菌也通过其减少皮肤表面的病原体负荷的能力在皮肤保护中发挥重要作用，并且有效地维持皮肤表面的群体结构。
[0124]
在无氧条件下获得不同但也可重现的合成模型群体。我们怀疑造成这种影响的原因是由于氧对每个成员的区别性影响，这将影响微生物模型群体的生长模式。在无氧培养条件下，痤疮丙酸杆菌更好地包含在合成混合培养物中是可能的，并且该物种可以与包括表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌在内的葡萄球菌物种一起以更高的丰度在共培养物中生长。众所周知，痤疮丙酸杆菌是导致皮肤病、痤疮发展的促进因素，尽管痤疮丙酸杆菌如何促进痤疮的机制细节并不充分理解，而且痤疮丙酸杆菌可能不会参与所有痤疮病例(shaheen&gonzalez，2013)。由于痤疮丙酸杆菌优先栖息于富含皮脂的皮肤区域并且可以消耗皮肤油脂(皮脂)并产生副产物诸如短链脂肪酸和丙酸(已知这有助于维持健康的皮肤屏障)，因此这种合成模型群体可以特别可用于筛选和预测潜在成分的体内作用，所述潜在成分针对例如油性和/或容易长痤疮的皮肤的面部应用是有利的。
[0125]
在处理无氧培养的培养物(其以比率1接种并在t＝0时用化合物x、y或z处理)后，由于痤疮丙酸杆菌的生长条件，最终的微生物组组成显著变化，如图4中所示。然而，如通过对于化合物(w)、肌酸(x)和月桂基醚硫酸钠(z)获得的结果判断，合成群体的总体可预测性的一般趋势在无氧条件下也保持不变。
[0126]
对于恶臭假单胞菌(y)的无细胞裂解物获得了最不同的结果，由于其在降低混合合成培养物中的痤疮丙酸杆菌的丰度的多功能效力、同时仅略微降低微生物多样性，其可能特别可用于设计用于抑制痤疮细菌的生长和增殖的个人护理产品和用于油性皮肤区域的清洁产品。
[0127]
实施例4：测试化合物对体内皮肤上微生物组的影响的表征分析五个人个体的来自小腿区域的微生物组的组成，并且可以分离五十九种细菌形态类型。从鉴定的物种中，从先前获得的体外合成模型群体(实施例1至3)中选择相同的11个物种，并计算它们的相对丰度(图5)。在用含有2％(化合物w)的化妆品o/w乳膏以每日剂量在小腿上处理28天后，针对安慰剂，再次分析个体的皮肤微生物组。
[0128]
图5和图6显示测试人员的微生物组组成的平均值。
[0129]
如图5和图6中所示，读出值显示表皮葡萄球菌和人葡萄球菌物种丰度的类似增加以及金黄色葡萄球菌丰度的减少。因此，在用处理皮肤前后微生物组组成的变化可以清楚地与实施例3中也看到的变化相关，表明合成模型群体的可行性。

技术特征：
1.用于筛选化合物的生物活性的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种不同细菌菌株的合成混合培养物，b)在包含所述化合物的培养基中培养所述合成混合培养物一段时间，c)在步骤b)之后测量所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况并将所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况与对照微生物组的多样性水平和/或多样性概况进行比较，和d)通过步骤c)中获得的所述合成混合培养物和所述对照微生物组之间的偏差推断所述化合物的生物活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细菌菌株选自包含以下的组：痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)、非发酵棒杆菌(corynebacterium afermentans)、无枝菌酸棒杆菌(corynebacterium amycolatum)、粘金色棒杆菌(corynebacterium aurimucosum)、coryne6acterium fastidiosum、克罗彭斯特棒杆菌(corynebacterium kroppenstedtii)、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌(corynebacterium simulans)、纹带棒杆菌(corynebacterium striatum)、结核硬脂酸棒杆菌(corynebacterium tuberculostearicum)、干燥棒杆菌(corynebacterium xerosi)、气囊水栖菌(enhydrobacter aerosaccus)、藤黄微球菌(micrococcus luteus)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium aches)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、头状葡萄球菌(staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)、缓症链球菌(streptococcus mitis)、口腔链球菌(streptococcus oralis)、假肺炎链球菌(streptococcus pseudopneumoniae)、血红链球菌(streptococcus sanguinis)和小韦荣氏球菌(veillonella parvula)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述细菌菌株选自以下组a)结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、假肺炎链球菌、血红链球菌和小韦荣氏球菌，b)非发酵棒杆菌、corynebacterium fastidiosum、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、气囊水栖菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，c)无枝菌酸棒杆菌、粘金色棒杆菌、克罗彭斯特棒杆菌、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和缓症链球菌，d)非发酵棒杆菌、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，和e)痤疮丙酸杆菌、非发酵棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、干燥棒杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和缓症链球菌。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤a)的合成混合培养物包含真核物种，优选马拉色菌属(malassezia)、曲霉属(aspergillus)、德巴利酵母属(debaroyomyces)和隐球菌属(cryptococcus)，并且最优选马拉色菌属，且优选限制性马拉色菌(m.restricta)和球形马拉色菌(m.globosa)。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤b)中的培养是在模拟皮肤
微生物组的细菌菌株至少部分悬浮的情况下进行的。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤b)中的培养是在无氧条件下进行的。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于步骤b)中的培养以低搅拌速率有氧进行，优选以小于800rpm的搅拌速率，更优选以50rpm至700rpm的搅拌速率，最优选以300rpm至600rpm的搅拌速率进行。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤b)中的培养在实验室培养皿中进行，所述实验室培养皿优选选自多孔板，优选选自6-、24-、48-、96-和384孔板。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述微生物组的多样性水平和/或多样性概况通过16s rrna分析进行测量。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤c)中的对照微生物组选自与所述合成混合培养物相同培养、但在步骤b)开始时不含所述化合物和所述合成混合培养物的合成混合参考培养物，优选地，它是与所述合成混合培养物相同培养、但不含所述化合物的合成混合参考培养物。11.模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种分离的不同细菌菌株的合成混合培养物。12.根据权利要求11所述的合成混合培养物，其特征在于所述细菌菌株选自包含以下的组：痤疮丙酸杆菌(cutibacterium aches)、非发酵棒杆菌、无枝菌酸棒杆菌、粘金色棒杆菌、corynebacterium fastidiosum、克罗彭斯特棒杆菌、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌、纹带棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、干燥棒杆菌、气囊水栖菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、假肺炎链球菌、血红链球菌和小韦荣氏球菌。

技术总结
本发明涉及借助于模拟皮肤微生物组的合成混合培养物筛选化合物的生物活性的体外方法。法。


技术研发人员：T
受保护的技术使用者：赢创运营有限公司
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2023/9/9