一种含棉籽肽的组合物及其应用

1.本发明属于生物医药或食品保健技术领域，具体涉及一种含棉籽肽的组合物及其应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层。病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。病程漫长，常反复发作。
3.柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂和皮质类固醇是常用于治疗溃疡性结肠炎的药物等。但是，柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂长期服用可能引起过敏反应和肝肾功能损伤。皮质类固醇为激素类药物，副作用也较大。
4.目前，亟待开发一种没有毒副作用的治疗溃疡性结肠炎的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种含棉籽肽的组合物及其应用，本发明组合物包括的原料为食物源活性物质，没有毒副作用，且能有效预防和治疗溃疡性结肠炎。
6.本发明提供了一种含棉籽肽的组合物，包括棉籽肽和复合益生菌；
7.所述棉籽肽是以棉籽为原料，经蛋白酶酶解得到；
8.所述复合益生菌包括鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌。
9.优选的，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶。
10.优选的，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比为(50～70)：(35～60)；所述复合益生菌的有效活菌数大于等于10
11
cfu/g；所述鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的质量比为4：2：1：1。
11.优选的，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比为6:4。
12.优选的，所述鼠李糖乳杆菌的有效活菌数为(3～12)
×
10
11
cfu/g；所述动物双歧杆菌的有效活菌数为(3～6)
×
10
11
cfu/g；所述植物乳杆菌的有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g；所述保加利亚乳杆菌有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g。
13.优选的，所述棉籽肽的制备方法包括以下步骤：
14.将棉籽、水和碱性蛋白酶混合，进行酶解反应，灭酶，得到包含棉籽肽的酶解产物。
15.优选的，在得到包含棉籽肽的酶解产物后，还包括对所述包含棉籽肽的酶解产物进行离心，收集上清液，对所述上清液进行干燥，得到棉籽肽；所述离心的转速为7000rpm/min；所述离心的时间为10～20min。
16.本发明还提供了上述方案所述的组合物在制备调节肠道菌群和/或调理肠胃功能的食品、保健品、饲料或饲料添加剂中的应用。
17.本发明还提供了上述方案所述的组合物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产
品中的应用；所述产品包括食品、保健品或药品。
18.优选的，所述溃疡性结肠炎包括由葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎。
19.本发明提供了一种含棉籽肽的组合物，包括棉籽肽和复合益生菌；所述棉籽肽是以棉籽为原料，经蛋白酶酶解得到；所述复合益生菌包括鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌。本发明的棉籽肽分子量小，能够通过小肠粘膜迅速被吸收，不经加工直接进入细胞。棉籽肽在体内具有良好的抗氧化活性，可以促进益生菌的生长和繁殖，增加肠道益生菌的绝对数量，抑制腐败菌的生长繁殖，优化肠内微生态环境，维持正常的肠道功能。在本发明中，所述复合益生菌能合成消化酶，促进肠道对营养物质的吸收，促进肠道菌群的平衡，降低炎性因子的浸润，改善炎症反应。综上，本发明的棉籽肽具备良好的抗氧化活性，复合益生菌具有抗炎、调节肠道菌群的功效，二者协同作用，相辅相成，能够共同治疗溃疡性结肠炎。经验证，本发明的组合物对溃疡性结肠炎有显著的治疗效果，可改善溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织的病理变化，减少结肠组织中炎性因子tnf-α、il-8、ifn-γ的表达，提高小鼠结肠中的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)的表达水平并降低脂质过氧化产物丙二醛(mda)的表达，从而发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。本发明的棉籽肽和复合益生菌均为食源性原料，具备良好的安全性和生物相容性，无毒副作用，在治疗急性溃疡性结肠炎中具有广阔的应用前景。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为不同组别小鼠疾病活动指数dai指数变化；其中，a为体重变化率；b为体重；c为腹泻；d为便血；e为疾病活动指数；f为最后一天疾病活动指数；
22.图2为不同组别小鼠结肠组织he染色；其中，a为ck组；b为葡聚糖硫酸钠dss组；c为ac组；d为p1组；e为p2组；f为p3组；标尺为100μm；
23.图3为不同组别小鼠结肠组织ifn-γ、tnf-α和il-8的表达；其中，a为il-8；b为tnf-α；c为ifn-γ；
24.图4为不同组别小鼠结肠组织sod、cat和mda的表达；其中，a为sod；b为cat；c为mda；
25.图1～4中，所有实验结果均通过graphpad prism 8.0.2软件完成；数据表示形式：平均值
±
标准差；其中
*/#
p《0.05，
**/##
p《0.01，
***/###
p《0.001表示数据具有统计学意义。
具体实施方式
26.本发明提供了一种含棉籽肽的组合物，包括棉籽肽和复合益生菌；所述棉籽肽是以棉籽为原料，经蛋白酶酶解得到；所述复合益生菌包括鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌。
27.在本发明中，所述组合物优选的由棉籽肽和复合益生菌组合得到。
28.在本发明中，所述组合物优选的包括以下重量份的组分：棉籽肽50～70份、鼠李糖
乳杆菌15～25份、动物双歧杆菌10～15份、植物乳杆菌5～10份和保加利亚乳杆菌5～10份；更优选的，所述组合物优选的由以下重量份的组分组成：棉籽肽50～70份、鼠李糖乳杆菌15～25份、动物双歧杆菌10～15份、植物乳杆菌5～10份和保加利亚乳杆菌5～10份。在本发明中，所述组合物优选的包括以下重量份的组分：棉籽肽60份、鼠李糖乳杆菌20份、动物双歧杆菌10份、植物乳杆菌5份和保加利亚乳杆菌5份；更优选的，所述组合物由以下重量份的组分组成：棉籽肽60份、鼠李糖乳杆菌20份、动物双歧杆菌10份、植物乳杆菌5份和保加利亚乳杆菌5份。
29.在本发明中，所述棉籽肽的分子量优选的≤2000da，更优选的≤1000da；所述棉籽肽具有抗炎抗氧化效果，能够促进益生菌的生长和繁殖，维持正常的肠道功能；所述复合益生菌可以补充肠道有益菌，对肠胃有保护作用，能调节肠道菌群平衡；棉籽肽和复合益生菌二者相辅相成，共同促进肠道健康。
30.在本发明中，所述蛋白酶优选的包括碱性蛋白酶。在本发明中，所述棉籽肽的制备方法优选的包括以下步骤：将棉籽、水和碱性蛋白酶混合，进行酶解反应，灭酶，得到包含棉籽肽的酶解产物。
31.在本发明中，所述棉籽优选的包括棉籽粉末；所述棉籽粉末优选为100目筛网的筛下组分。在本发明中，所述棉籽、水和碱性蛋白酶的质量比优选为10：100：2
×
10-3
。在本发明中，将棉籽、水和碱性蛋白酶混合优选的包括将棉籽和水混合，得到混合物，再将所述混合物和碱性蛋白酶混合。在得到所述混合物后，本发明优选的还包括调节所述混合物的ph值为8。在本发明中，所述酶解反应的温度优选为50℃；所述酶解反应优选的于水浴条件摇动下进行；所述酶促反应的ph值优选为8；调节所述ph值的试剂优选为浓度为1m的naoh水溶液。在本发明中，所述灭酶优选的包括将温度提高到95℃，使酶失活。
32.在得到包含棉籽肽的酶解产物后，本发明优选的还包括对所述包含棉籽肽的酶解产物进行离心，收集上清液，对所述上清液进行干燥，得到棉籽肽；所述离心的转速为7000rpm/min；所述离心的时间为10～20min。
33.在得到包含棉籽肽的酶解产物后且在所述离心前，本发明优选的还包括调节所述包含棉籽肽的酶解产物的ph为7，并对所述包含棉籽肽的酶解产物进行冷却至20～30℃。在本发明中，所述离心的温度优选为4℃；所述离心的时间优选为15min。在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥。
34.在本发明中，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比优选为(50～70)：(35～60)；所述复合益生菌的有效活菌数优选的大于等于10
11
cfu/g；所述鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的质量比优选为4：2：1：1。
35.在本发明中，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比优选为6:4。
36.在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌的有效活菌数优选为(3～12)
×
10
11
cfu/g；所述动物双歧杆菌的有效活菌数优选为(3～6)
×
10
11
cfu/g；所述植物乳杆菌的有效活菌数优选为3
×
10
11
cfu/g；所述保加利亚乳杆菌有效活菌数优选为3
×
10
11
cfu/g。
37.本发明的复合益生菌具有耐酸性、人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性，以及较高的安全性。
38.本发明还提供了上述方案所述的组合物在制备调节肠道菌群和/或调理肠胃功能的食品、保健品、饲料或饲料添加剂中的应用。
39.在本发明中，所述食品优选的包括功能性食品或特医食品。
40.本发明还提供了上述方案所述的组合物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用；所述产品包括食品、保健品或药品。
41.在本发明中，所述溃疡性结肠炎包括初发型、慢性复发型、慢性持续型和急性爆发型的溃疡性结肠炎中的一种或几种；或者，所述溃疡性结肠炎包括左半结肠型、直肠型和全结肠型溃疡性结肠炎中的一种或几种。
42.在本发明中，所述溃疡性结肠炎优选的包括由葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的溃疡性结肠炎。
43.在本发明中，所述治疗溃疡性结肠炎优选的通过以下1)～4)中的一个或几个方面实现：
44.1)改善结肠组织的病理变化；
45.2)减少结肠组织中炎性因子的表达；
46.3)提高抗氧化因子水平；
47.4)改善肠道菌群。
48.在本发明中，所述炎性因子优选的包括tnf-α、ifn-γ和il-8中的一种或几种。
49.在本发明中，所述抗氧化因子优选的包括sod、cat和mda中的一种或几种。
50.在本发明中，所述药物的剂型优选为口服剂型；以小鼠给药计，所述药物的单日给药剂量优选为260～780mg/kg，更优选为520mg/kg；所述药物的给药天数优选为7d。
51.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种含棉籽肽的组合物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.下述实施例中涉及的小鼠为7～8周龄雄性spf级c57bl/6j小鼠，购自辽宁长生生物技术股份有限公司；下述实施例中涉及的elisa试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司；下述实施例中涉及的大便隐血检测试剂盒购自埃博生物医药(杭州)有限公司；下述实施例中涉及的艾迪莎美沙拉嗪缓释颗粒购自上海爱的发制药有限公司；下述实施例中涉及的葡聚糖硫酸钠(dss)购自上海翊圣生物科技有限公司；下述实施例中涉及的h&e染色试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司；下述实施例中涉及的益生菌包括鼠李糖乳杆菌，动物双歧杆菌，植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌均由吉林大学生命科学学院提供。
53.在本发明中，组合物由以下重量份的组分组成：棉籽肽60份、鼠李糖乳杆菌20份、动物双歧杆菌10份、植物乳杆菌5份和保加利亚乳杆菌5份。
54.在本发明中，所述棉籽肽为酶解法得到，制备方法为：
55.称取10g棉籽粉末到250ml锥形瓶中，加入100ml高纯水溶解，用1mnaoh水溶液调节ph值至8.0。向瓶中加入2ml碱性蛋白酶后，在50℃的水浴中摇动锥形瓶进行酶促水解。随着酶促水解反应的进行，反应液的ph值会不断降低。向酶法水解液中加入1mnaoh水溶液会使ph值保持在8.0，每20min检测一次ph值。酶法水解反应结束后，将水浴温度提高到95℃，使酶失活，然后用1m hcl将水解液的ph值调整到7.0，将水解液冷却到室温后，在4℃下离心15min(7000rpm/min)。然后丢弃沉淀物，保留上清液，再将上清液冷冻干燥成粉末，得到棉籽肽。
56.在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的质量比为4：2：1：1；所述鼠李糖乳杆菌的有效活菌数为12
×
10
11
cfu/g；所述动物双歧杆菌的
有效活菌数为6
×
10
11
cfu/g；所述植物乳杆菌的有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g；所述保加利亚乳杆菌有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g。将所述棉籽肽和复合益生菌混合，得到肽-益生菌。
57.实施例1
58.1.1动物试验
59.1.1.1动物试验设计
60.7-8周龄雄性c57bl/6j小鼠，随机分为6组(n＝5只/组)，分别为空白组(ck组)，模型组(dss组)，阳性药物组(ac组)，棉籽肽益生菌复合物低剂量组(p1组)，棉籽肽益生菌复合物中剂量组(p2组)，棉籽肽益生菌复合物高剂量组(p3组)。分笼饲养，定期更换垫料与饲料。适应性喂养一周后，除空白组正常饮水外，各组饮用含质量百分浓度为3％的dss(36～50kda)的无菌水，连续8d。治疗组同时每天灌胃给药。
61.各组灌胃给药剂量：ck组每日灌胃0.2ml的0.9％的生理盐水，dss组和其他治疗组在每日自由饮用3％dss的基础上进行灌胃，dss组每日灌胃0.2ml的0.9％的生理盐水，ac组每日灌胃美沙拉嗪390mg/kg，p1组每日灌胃260mg/kg，p2组每日灌胃520mg/kg，p3组每日灌胃780mg/kg。
62.1.1.2疾病活动指数(dai)的测定
63.实验期间每日记录小鼠的体重、腹泻、便血、毛发等情况。dss模型小鼠的疾病活动指数(disease activity index，dai)评分标准见下表。dai＝(体重+腹泻+便血)/3
64.表1疾病活动指数评分
[0065][0066]
1.1.3小鼠结脏组织病理评估
[0067]
用pbs溶液清洗结肠并将其浸入福尔马林中，待组织固定后，室温保存。接着将组织按顺序脱水、石蜡包埋、制备切片、苏木精-伊红(h&e)染色。用显微镜对结肠组织的黏膜损伤进行观察。
[0068]
1.1.4结肠组织炎症因子的测定
[0069]
灌胃结束后，取结肠组织上清，通过elisa试剂盒，检测结肠组织tnf-α、ifn-γ、il-8的表达。
[0070]
1.1.5结肠组织抗氧化因子的测定
[0071]
灌胃结束后，取结肠组织上清，通过elisa试剂盒，检测结肠组织sod、cat、mda的表达。
[0072]
1.2数据处理
[0073]
本章所有实验结果均通过graphpadprism 8.0.2软件完成。数据表示形式：平均值
±
标准差。其中
*/#
p《0.05，
**/##
p《0.01，
***/###
p《0.001表示数据具有统计学意义。
[0074]
2.结果与分析
[0075]
2.1dai评分
[0076]
如图1所示，正式实验开始2～3天，除了ck组，其他组的小鼠均出现不同程度的体重减轻，腹泻，便血等情况，这表明uc小鼠造模成功。含有3％dss的饮用水导致小鼠体重明显下降。如图1中的a所示，dss组小鼠的平均体重在第8天下降了11.32％。ac组和p3组对缓解小鼠体重下降的效果最为明显，第8天小鼠的平均体重分别下降了6.93％和7.02％。小鼠的疾病活动指数包括体重变化、腹泻、便血。如图1中的b、c、d所示，灌胃第3天开始，小鼠体重计分发生变化，dss组小鼠体重下降最为明显，ck组小鼠体重增加，所以计分0，而其他治疗组均出现不同程度的体重下降的表现，其中ac组和p3组体重变化最小。灌胃第2天开始，小鼠出现不同程度的腹泻和便血。其中dss组小鼠腹泻和便血情况最为严重，ck组小鼠无明显变化。治疗组可以逆转这一变化，其中ac组和p1组腹泻较为严重，p3腹泻和便血情况较轻。如图1中的e和f所示，dss组小鼠dai指数最大，在第8天达到3.79分。ck组小鼠的dai无明显变化。与dss组相比，各治疗组的dai评分明显下降，其中p3组的评分下降最多(2.15分)，ac组、p2组和p1组的dai评分分别为2.53、2.37和2.49。与dss组相比，均有明显改善。这些结果表明，dss诱导小鼠体重显著下降，并伴随腹泻、便血的情况。而美莎拉嗪和棉籽肽益生菌复合物可显著缓解uc小鼠的症状，这表明给药治疗对uc具有一定的效果。
[0077]
2.2不同的治疗方案对小鼠结肠组织的影响
[0078]
采用h&e染色法，研究各组间的结肠组织病理变化。结果如图2所示，在荧光显微镜下(100倍)，ck组杯状细胞的结构完整，没有发现明显的中性粒细胞浸润。dss组结肠黏膜和杯状细胞基本全部被破坏，并伴随大量中性粒细胞浸润，粘膜充血，腺体消失，部分区域有溃疡及脓肿的形成。ac组出现少量中性粒细胞浸润现象，p3高剂量组杯状细胞略微减少，少量中性粒细胞浸润。p1低剂量组出现杯状细胞减少，大量中性粒细胞浸润现象。表明dss可以诱导炎症反应，导致中性粒细胞浸润，对结肠上皮细胞具有毒性，并影响黏膜屏障的完整性。美莎拉嗪及棉籽肽益生菌复合物对dss诱导的溃疡性结肠炎具有一定的改善作用。
[0079]
2.3不同的治疗方案对小鼠结肠组织炎性因子水平的影响
[0080]
如图3所示，dss组小鼠结肠中的炎症细胞因子il-8、ifn-γ和tnf-α水平明显高于ck组(p＜0.01)。如图3中的a、b和c所示，与dss组相比，ac组、p1组、p2组和p3组均能降低炎症细胞因子的表达水平。其中ac组的il-8、tnf-α和ifn-γ水平降低幅度较其他治疗组大，并与dss组具有显著差异。总的来说，p3组治疗比p2组和p1组在降低炎症细胞因子水平方面更有效，表明棉籽肽益生菌复合物的治疗具有剂量效应。
[0081]
2.4不同的治疗方案对小鼠结肠组织抗氧化因子水平的影响
[0082]
作为一种重要的抗氧化酶，sod在调节氧化应激方面起着重要作用。如图4中的a所示，与ck组相比，dss组结肠组织中的sod水平明显下降(p＜0.05)。用药8天后，与dss组相比，各治疗组的sod水平都得到了提高。总的来说，与dss组相比，ac组对提高结肠组织中sod的水平效果最好，p2组和p3组也能明显提高sod的水平。cat是一种在哺乳动物中广泛存在的具有生物活性的四聚体蛋白，能有效催化过氧化氢转化为水和氧，减少氧化应激。如图4中的b所示，与正常小鼠相比，dss组小鼠结肠组织中cat的水平明显下降(p＜0.01)。与dss组相比，ac组、p2组和p3组小鼠结肠组织中的cat浓度明显增加(p＜0.05)，p2组的浓度最
高。炎症会增加体内的脂质过氧化。如图4中的c所示，与正常小鼠相比，dss组小鼠结肠组织中的脂质过氧化产物mda的水平明显增加(p＜0.01)。给药8天后，各治疗组小鼠结肠组织中的mda浓度均明显低于dss组(p＜0.05)。ac组对降低mda浓度的效果最好，其次是p3组。
[0083]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种含棉籽肽的组合物，其特征在于，包括棉籽肽和复合益生菌；所述棉籽肽是以棉籽为原料，经蛋白酶酶解得到；所述复合益生菌包括鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比为(50～70)：(35～60)；所述复合益生菌的有效活菌数大于等于10
11
cfu/g；所述鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的质量比为4：2：1：1。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述棉籽肽和复合益生菌的质量比为6:4。5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的有效活菌数为(3～12)
×
10
11
cfu/g；所述动物双歧杆菌的有效活菌数为(3～6)
×
10
11
cfu/g；所述植物乳杆菌的有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g；所述保加利亚乳杆菌有效活菌数为3
×
10
11
cfu/g。6.根据权利要求1～4任意一项所述的组合物，其特征在于，所述棉籽肽的制备方法包括以下步骤：将棉籽、水和碱性蛋白酶混合，进行酶解反应，灭酶，得到包含棉籽肽的酶解产物。7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，在得到包含棉籽肽的酶解产物后，还包括对所述包含棉籽肽的酶解产物进行离心，收集上清液，对所述上清液进行干燥，得到棉籽肽；所述离心的转速为7000rpm/min；所述离心的时间为10～20min。8.权利要求1～7任意一项所述的组合物在制备调节肠道菌群和/或调理肠胃功能的食品、保健品、饲料或饲料添加剂中的应用。9.权利要求1～7任意一项所述的组合物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用；所述产品包括食品、保健品或药品。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述溃疡性结肠炎包括由葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎。

技术总结
本发明提供了一种含棉籽肽的组合物及其应用，属于生物医药或食品保健技术领域；所述组合物，包括棉籽肽和复合益生菌；所述棉籽肽是以棉籽为原料，经蛋白酶酶解得到；所述复合益生菌包括鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌。本发明的棉籽肽具备良好的抗氧化活性，复合益生菌具有抗炎、调节肠道菌群的功效，二者协同作用，相辅相成，能够共同治疗溃疡性结肠炎。共同治疗溃疡性结肠炎。共同治疗溃疡性结肠炎。


技术研发人员：徐力 郭轶 张杉
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/9