从发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用

1.本发明涉及食品微生物领域，具体的说，是涉及一种从发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用。


背景技术：

2.黑麦粉富含氨基酸、膳食纤维、维生素和矿物质，还含有阿魏酸、黄酮类化合物、植物甾醇类等生物活性物质，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高机体免疫力等营养保健作用。
3.酸面团是以谷物为原料，经微生物发酵后制成，常被作为传统发酵面制品中常用的发酵剂。酸面团中的优势菌种以乳酸菌和酵母菌为主。目前已经从酸面团中分离出的乳酸菌超过70种，最常见的乳酸菌如旧金山乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸短乳杆菌、乳球菌等。乳酸菌发酵过程中产生乳酸、乙酸等有机酸，可以提高面团酸度，降低面团ph，抑制有害微生物的生长；所形成的酸性环境进一步阻碍淀粉的酶水解；并诱导淀粉和面筋的相互作用，改变淀粉结构和组成，降低淀粉的可用性。因此乳酸发酵可以显著降低血糖升糖指数，成为生产低血糖生成指数gi功能性食品的良好原料。
4.不同发酵基质的微生物组成差别较大，近年来，酸面团发酵基质的研究成为热点。使用黑全麦粉作为基质发酵酸面团尚未见报道，筛选适合黑麦粉基质的专用发酵剂，缩短酸面团发酵周期，制备能降低血糖生成指数且具有较高抗氧化活性的酸面团，对进一步开发以黑麦粉为主要原料的系列黑麦功能性食品具有广阔前景。


技术实现要素：

5.本发明提供两株从自然发酵酸面团中筛选得到的乳酸菌及其应用，所述乳酸菌制备复合发酵剂用于黑麦面团发酵，能缩短黑麦酸面团发酵时间，降低血糖升糖指数，还能提高其抗氧化活性。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.第一方面，提供一株乳酸片球菌(pediacoccus acidiactici)rsd02，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.26520。
8.第二方面，提供一株植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)rsd54，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.26521。
9.第三方面，提供一种包含所述乳酸片球菌和所述植物乳杆菌的复合发酵剂，
10.发酵剂中有效活菌数为109cfu/ml；所述复合发酵剂的制备方法包括如下步骤：
11.将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54，分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h，活化2次，37℃培养12h后在6000r/min条件下离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，并制成109cfu/ml的菌悬液，将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54的菌悬液按照1：2的比例混合成为复合发酵剂。
12.第四方面，提供一种复合发酵剂在制备黑麦发酵酸面粉的应用,按质量份数计包括以下组分：
13.黑麦粉
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50份；
14.复合发酵剂
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1份；
15.无菌水
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49份；
16.包括以下制备步骤：
17.将黑麦粉、复合发酵剂和无菌水混合，得到黑麦面团；将黑麦面团放置于rh80％，37℃的发酵箱，发酵12h得到黑麦酸面团；将黑麦酸面团真空冷冻干燥，磨粉过80目筛，得到黑麦发酵酸面粉。
18.本发明相对现有技术的有益效果：
19.本发明从自然发酵黑麦酸面团中筛选得到两株乳酸菌，产酸快，产酸量高；两株乳酸菌复合配比后用于黑麦酸面团的发酵，能够显著缩短黑麦酸面团的发酵时间；得到的黑麦酸面团粉具有更低的血糖生成指数，更高的抗氧化性，可作为生产低gi功能性黑麦产品的良好原料。
附图说明
20.图1为乳酸片球菌rsd02菌株10k扫描电镜形态图；
21.图2为植物乳杆菌rsd54菌株10k扫描电镜形态图；
22.图3为乳酸片球菌rsd02菌株基于16s rdna的系统发育树；
23.图4为植物乳杆菌rsd54菌株基于16s rdna的系统发育树；
24.图5为乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54的生长曲线图；
25.图6为添加rsd02:rsd54＝1:2发酵黑麦面团发酵过程中ph值及tta含量变化图；
26.图7为自然发酵黑麦面团发酵过程中ph值及tta含量变化图；
27.图8为添加rsd02:rsd54＝1:2发酵黑麦面团发酵过程中乳酸及乙酸含量变化图；
28.图9为自然发酵黑麦面团发酵过程中乳酸及乙酸含量变化图；
29.图10为黑麦面团发酵过程中对α-淀粉酶抑制率变化图；
30.图11为黑麦面团发酵过程中对α-葡萄糖苷酶抑制率变化图；
31.图12为黑麦酸面团粉的体外消化曲线图；
32.图13为自然发酵面团500
×
电镜图；
33.图14为自然发酵面团1000
×
电镜图；
34.图15为自然发酵面团5000
×
电镜图；
35.图16为复合发酵剂酸面团500
×
电镜图；
36.图17为复合发酵剂酸面团1000
×
电镜图；
37.图18为复合发酵剂酸面团5000
×
电镜图。
38.生物保藏说明：
39.乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54，于2023年2月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.26520和cgmcc no.26521。
具体实施方式
40.以下参照附图及实施例对本发明进行详细的说明：
41.本发明提供了两株乳酸菌，乳酸片球菌(pediacoccus acidiactici)rsd02，保藏
编号为cgmcc no.26520；植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)rsd54，保藏编号为cgmccno.26521。所述两株乳酸菌均是从自然发酵黑麦酸面团中分离、纯化、鉴定得到；两株乳酸菌采用分子生物学方法鉴定，结果见核苷酸序列表。
42.本发明提供了一种包含上述方案所述乳酸片球菌和植物乳杆菌的复合发酵剂；所述发酵剂中有效活菌数为109cfu/ml；所述发酵剂制备方法：将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54，分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h，活化2次，37℃培养12h后在6000r/min条件下离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，并制成109cfu/ml的菌悬液，将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54的菌悬液按照1：2的比例混合成为复合发酵剂。
43.本发明提供了上述发酵剂制备黑麦酸面团粉的应用，按质量份数计包括以下组分：
44.黑麦粉
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50份；
45.复合发酵剂
ꢀꢀꢀ
1份；
46.无菌水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
49份；
47.包括以下制备步骤：
48.将黑麦粉、混合发酵剂和无菌水混合，得到黑麦面团；将黑麦面团放置于rh80％，37℃的发酵箱，发酵12h得到黑麦酸面团；将黑麦酸面团真空冷冻干燥，磨粉过80目筛，得到黑麦发酵酸面粉。
49.本发明从发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用，用于纯菌黑全麦酸面团的发酵，通过发酵进一步提高了黑全麦粉的抗氧化性，改善面团的延伸性和可塑性等加工性能，并显著降低了面团的血糖生成指数。
50.本发明从自然发酵黑麦酸面团中筛选得到两株乳酸菌，产酸快，产酸量高，两株乳酸菌复合配比后发酵，能够显著缩短黑麦面团的发酵时间，降低黑面粉的gi，提高黑麦粉的抗氧化性。
51.本发明乳酸菌具有很强的产酸能力，能缩短黑麦酸面团的发酵周期，降低其血糖升糖指数，并提高其抗氧化活性。
52.本发明制备的黑麦发酵酸面粉可以进一步用于生产黑麦面包、黑麦馒头、黑麦面条等，获得低gi系列黑麦主食产品。
53.本发明从发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用，发酵剂制备的黑麦酸面团粉，体外消化gi为51.25；缩短了发酵时间，降低了产品的gi。
54.本发明从发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用，发酵剂制备的黑麦酸面团粉，dpph自由基清除能力增加了1.22倍，羟自由基清除能力增加了2.20倍，提高了黑麦酸面粉的抗氧化性。
55.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.实施例1菌株rsd02和rsd54的鉴定
57.本发明的菌株rsd02和rsd54是从自然发酵的黑麦酸面团中分离筛选得到，通过形态学和分子生物学等方法鉴定，两株菌分别鉴定为乳酸片球菌和植物乳杆菌。
58.1、形态学鉴定
59.将菌株rsd02和rsd54接种于mrs培养基，37℃培养48h，观察菌落特征，挑取菌落进
行革兰氏染色后镜检，并进行扫描电镜观察(图1和图2)。rsd02菌落呈圆形，乳白色，扁平状，表面湿润；革兰氏染色阳性，菌体呈球状，直径约为0.7μm～1.5μm，单个或成对排列；过氧化氢阴性。rsd54菌落呈圆形，乳白色，表面光滑；革兰氏染色阳性，菌体短杆状，大小为0.6～1.0μm
×
3.0～8.0μm，单个或成对排列。
60.2、分子生物学鉴定
61.提取乳酸菌的基因组，并进行pcr扩增。pcr的反应体系为：基因组dna(20ng/μl)1.0μl，10
×
buffer(含2.5mm mg2+)5.0μl，taq聚合酶(5u/μl)1.0μl，dntp(10mm)1.0μl，27f引物(10um)1.5μl，1492r引物(10um)1.5μl，ddh2o 39.0μl，总体积50.0μl。引物为27f(5-agagtttgatcctggctcag-3)和1492r(5-ctacggctaccttgttacga-3’)，pcr条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸7min。反应完成后，取3μlpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认pcr扩增片段。将pcr产物送上海派森诺生物科技有限公司测序。登录ncbi数据库将所得序列与已知序列进行比对。用软件megax进行序列分析，并采用neighbor-joining法进行系统发育分析，构建进化树如图3和4。结合形态学特征，鉴定菌株rsd02为乳酸片球菌，序列登录号为nr_042057.1；菌株rsd54为植物乳杆菌，序列登录号为nr_113338.1。
62.实施例2黑麦酸面团的制备
63.黑麦酸面团设置复合发酵剂组和对照组，具体制备方法如下：
64.1)复合发酵剂组
65.将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54，分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h，活化2次后，37℃培养至生长对数期，两株菌的生长曲线见图3，然后在6000r/min条件下离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，制成109cfu/ml的菌悬液，将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54的菌悬液按照1：2的比例混合成为复合发酵剂。将黑麦粉50g，上述复合发酵剂1ml，无菌水49ml混合，得到黑麦面团，将黑麦面团放置于rh80％，37℃的发酵箱，发酵12h得到黑麦酸面团。
66.2)对照组
67.将黑麦粉50g，无菌水50ml混合，得到黑麦面团，将黑麦面团放置于rh80％，37℃的发酵箱，发酵1天得到自然发酵黑麦酸面团，为对照组。
68.测定黑麦面团发酵过程中ph和可滴定酸度；乳酸和乙酸含量；对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率。
69.黑麦面团发酵过程中ph和总可滴定酸度(tta)的测定：复合发酵剂组和对照组均每隔2h取样。采用ph计测定酸面团的ph；采用滴定法测定tta含量。以naoh标准溶液将样液滴定至ph为8.6，记消耗标准溶液体积的数值。样品中tta含量以消耗的naoh溶液体积(ml)表示。
70.黑麦面团发酵过程中乳酸和乙酸含量变化的测定：采用液相色谱法测定黑麦面团发酵过程中的乳酸和乙酸产量。分别在酸面团发酵0h、6h、12h取样5.0g，与20ml 0.01mol/l kh2po4混匀，15000r/min离心4min，上清液过0.22μm有机系滤膜待测。液相色谱条件：色谱柱为inertsustai-c18；流动相为0.01mol/l kh2po4(用20％磷酸调节ph值至2.70)；柱温30℃；流速1.0ml/min；进样量20μl；紫外检测波长210nm。
71.黑麦面团发酵过程中对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率的测定：分别在酸面团
发酵0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取样，采用分光光度计法测定酸面团发酵过程中对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率。
72.测定结果见图6-11。如图6所示，添加发酵剂的黑麦面团发酵过程中ph值显著降低，tta含量显著增加。发酵12h后，ph为3.86，tta含量为14.54ml。而自然发酵黑麦面团，如图7所示，发酵1天后，ph为6.15。添加发酵剂显著缩短了酸面团的发酵时间。如图8和9所示，随发酵时间延长，添加发酵剂的酸面团乳酸和乙酸含量均有增加，其中乳酸含量在发酵12h时达到2.49mg/g。如图10和11所示，添加发酵剂的酸面团对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率也显著提高，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分别提高了1.88倍和5.86倍。
73.实例3黑麦发酵酸面团粉的制备
74.将实施例2的酸面团于-20℃预冻，进行真空冷冻干燥，磨粉过80目筛，得到黑麦酸面团粉。
75.黑麦酸面团粉的估计血糖指数(egi)评价。测定消化过程中葡萄糖释放量，计算出快消化淀粉(rds)、慢消化淀粉(sds)、抗性淀粉(rs)值。根据葡萄糖含量计算出淀粉水解率，水解曲线见图12。按照egi和hi的关系公式，计算出黑麦酸面团粉的egi。如表1所示，添加复合发酵剂发酵后黑麦酸面团粉的淀粉结构和组成发生了显著变化，其中rds显著减少,sds显著增加。黑麦酸面团粉的egi值为51.25，属于低gi食品。
76.表1黑麦酸面团粉的不同淀粉组分及gi
[0077][0078]
黑麦酸面团粉的总酚含量及抗氧化性能力评价。采用福林-酚比色法测定黑麦酸面团粉的总酚含量；测定dpph自由基清除能力和羟自由基清除能力评价抗氧化活性。如表2，添加发酵剂发酵后的黑麦酸面团粉的总酚含量、dpph清除能力和羟自由基清除能力均显著提高。
[0079]
表2黑麦酸面团粉的总酚含量及抗氧化能力
[0080][0081]
黑麦酸面团粉的微观结构。经离子溅射喷金处理后，采用扫描电镜观察酸面团粉的微观结构。如图13至18，因乳酸菌的发酵作用，酸面粉组的淀粉颗粒变的更不规则，且淀粉颗粒表面被蛋白质包裹，大多镶嵌在面筋网络中，形成团状结构。
[0082]
由此说明，发酵作用促进淀粉颗粒与面筋蛋白的结合，使面筋网络更加紧密，进而阻碍淀粉的水解作用。
[0083]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的结构作任何形式上的
限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明的技术方案范围内。

技术特征：
1.一株乳酸片球菌(pediacoccus acidiactici)rsd02，其特征在于，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.26520。2.一株植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)rsd54，其特征在于，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.26521。3.一种包含权利要求1所述乳酸片球菌和权利要求2所述植物乳杆菌的复合发酵剂，其特征在于：所述复合发酵剂制备方法包括如下步骤：将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54，分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h，活化2次，37℃培养12h后在6000r/min条件下离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，并制成109cfu/ml的菌悬液，将乳酸片球菌rsd02和植物乳杆菌rsd54的菌悬液按照1：2的比例混合成为复合发酵剂。4.根据权利要求3所述的复合发酵剂在制备黑麦发酵酸面粉的应用,其特征在于，按质量份数计包括以下组分：黑麦粉
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50份；复合发酵剂
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1份；无菌水
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49份；包括以下制备步骤：将黑麦粉、复合发酵剂和无菌水混合，得到黑麦面团；将黑麦面团放置于rh80％，37℃的发酵箱，发酵12h得到黑麦酸面团；将黑麦酸面团真空冷冻干燥，磨粉过80目筛，得到黑麦发酵酸面粉。

技术总结
本发明涉及食品微生物领域，尤其涉及发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌及其应用，公开了两株从自然发酵黑麦酸面团中筛选到的乳酸菌，乳酸片球菌(Pediacoccus acidiactici)RSD02和植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)RSD54，均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.26520和：CGMCC NO.26521。两株菌具有良好的产酸能力，复配后用于黑麦面团发酵，能够显著缩短发酵周期，提高对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率；制备的黑麦酸麦团粉具有较高的抗氧化性，eGI为51.25，可用作生产低GI食品的主要原料。料。料。


技术研发人员：王永霞 江义蕊
受保护的技术使用者：河北工程大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/12