超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球及制备与应用

1.本发明属于制药领域，涉及一种超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球及制备与应用，主要用于抗肿瘤和抑制肿瘤转移。


背景技术：

2.重酒石酸长春瑞滨(vinorelbine，vnb)是一种半合成的长春花生物碱，其结构如下所示，具有较高的抗肿瘤活性和广泛的抗肿瘤谱，已被fda批准用于治疗晚期乳腺癌(abc)和晚期/转移性非小细胞肺癌(nscls)[sci transl med,83(2008)584-594]。然而，vnb注射液为高渗性溶液，易导致血管通透性增加，引起静脉和毛细血管痉挛，造成注射部位静脉炎、水泡、溃疡，甚至局部组织坏死[int j mol sci，22(2021)4618]，而治疗期间伴随的高骨髓抑制毒性更是严重影响了患者的治疗进程[aaps pharmscitech,23(2019)163]。因此，如何在不影响疗效的基础上有效降低vnb注射液的毒副作用是目前亟需解决的问题。
[0003]
事实上，包括vnb在内的大多数化疗药物的直接刺激均会使癌细胞产生ros，发生氧化应激。但不同于放射疗法和光动力疗法，化疗产生的ros并不是杀死肿瘤细胞的主导因素[biochem pharmacol,83(2012)1159-1171]，同时，许多肿瘤细胞能够通过上调自身抗氧化系统的活性来应对升高的ros水平以缓解氧化应激，最终达到一个高水平的氧化还原稳态[biochem pharmacol,92(2021)90-101]。在这种情况下，ros可以作为第二信使，激活多个肿瘤相关通路而促进癌症进展，例如ros可以激活nf-κb从而引起bcl-2、claudin-1和vegf的转录增加，导致肿瘤细胞抗凋亡、emt和药物抵抗；ros也可以激活mapk家族的多条通路而激活受体酪氨酸激酶(rtks),rtks与生长因子的结合可以促进肿瘤转移；ros还有助于维持细胞骨架动力，参与肿瘤细胞伪足形成，有利于肿瘤的侵袭和转移[med res rev,41(2021)342-394]。已有研究表明，抗氧化剂可以提高化疗效果并降低肿瘤细胞转移的能力[drug discov,20(2021)689]。
[0004]
目前对vnb进行减毒增效的方法就是利用脂质体技术、纳米技术等将其有效包封，从而减少药物暴露量并通过药物递送系统增加肿瘤组织中的药物浓度。然而遗憾的是，由于vnb的高亲水性，其包封难度较大，应用过程中依然存在药物泄露、游离药物浓度高的问题[int j nanomedicine,454(2013)472-477]，这也就意味着治疗期间的高毒副作用、低药物利用度、疗效有限的问题没有得到根本解决。
[0005]
因此，如何有效增加vnb的包封率，从而解决上述问题显得尤为重要。而鉴于vnb的理化性质，处方成分的合理设计与实现高的包封率息息相关。同时，抗氧化剂与vnb的联合治疗有望进一步提高vnb的抗肿瘤效果。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球，所述微球由重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂、ph调节剂以及稳定剂组成，其中重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂、ph调节剂及稳定剂按重量比计为0.5～5：2～30：5～11：0.5～2：20～40。
[0007]
所述注射用油为中链甘油三酯和至少一种维生素e及其衍生物。作为维生素e衍生物，可列举出α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育酚醋酸酯、α-生育酚琥珀酸酯、聚乙二醇维生素e琥珀酸酯(tgps)等。从重酒石酸长春瑞滨的包封率、油相的用量、乳化的程度、脂质微球的粒径以及抗肿瘤效果等方面考虑，所述维生素e及其衍生物进一步优选为维生素e、α-生育酚、α-生育酚醋酸酯或α-生育酚琥珀酸酯。其中，维生素e及其衍生物与中链甘油三酯以重量比计为5～20：1～17，优选为5～15：2～15。
[0008]
所述乳化剂为选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或多种。作为合成磷脂，可列举出二棕榈酰基卵磷脂(dppc)、二硬脂酰基卵磷脂(dspc)、儿油酰基卵磷脂(dopc)等。从乳化效果、以及所制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的包封率等方面考虑，磷脂优选为蛋黄卵磷脂和/或大豆磷脂，更优选为蛋黄卵磷脂。其中，乳化剂与注射用油以重量比计为3～15：1～37，优选为5～11：2～30。
[0009]
所述ph调节剂为选自谷氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种或多种。从乳化效果、以及所制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的包封率等方面考虑，优选为精氨酸。其中，精氨酸与重酒石酸长春瑞滨以重量比计为0.1～5：0.1～10，优选为0.5～2：0.5～5。
[0010]
所述稳定剂为选自蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。
[0011]
本发明的另一个目的是提供所述的一种重酒石酸长春瑞滨脂质微球及其冻干粉的制备方法，共分为五步：1.油相制备；2.水相制备；3.初乳制备；4.终乳制备；5.分装灭菌及冻干。
[0012]
(1)油相制备：将重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂与有机溶剂(无水乙醇)混合，超声溶解，真空挥发除去乙醇，即得油相。
[0013]
(2)水相制备：将ph调节剂、稳定剂加入到注射用水中，超声溶解，得水相。
[0014]
(3)初乳制备：油相在一定转速下剪切，将水相缓慢加入到油相中，继续剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳；
[0015]
(4)终乳制备：将初乳转至均质机，加压循环均质，在1350bar的压力下循环四次后，在1500bar的压力下再循环5次，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳。
[0016]
(5)分装灭菌及冻干：采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次，再采用同样材质的0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，经高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球或再经冻干得重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干粉。冻干程序如下表1。
[0017]
表1
[0018]
需要说明的是，制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球既可以以微乳的形式直接使用，又可以制成冻干粉后经复溶再使用，二者均具有良好的稳定性，方便运输及贮藏。
[0019]
本发明的再一个目的是提供所述的一种重酒石酸长春瑞滨脂质微球在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤是非小细胞肺癌，所述应用是通过调控肿瘤氧化应激和外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2基因来抑制化疗过程中肿瘤细胞侵袭和转移的发生。
[0020]
本发明选用恰当的注射用油、乳化剂以及ph调节剂将化疗药物重酒石酸长春瑞滨有效包封于脂质微球中，同时纳米级药物递送系统可以保护药物在血液中不被消除和渗漏，还可以通过增强的通透性和滞留性(epr)效应内化到癌细胞中，从而提高药物利用度和疗效。本发明创造性地将维生素e作为注射用油，可以与重酒石酸长春瑞滨发挥协同作用，产生更强的肿瘤杀伤效果。含药微粒也因维生素e的存在具有抗氧化特性，能够响应肿瘤的高活性氧(ros)环境从而高效释放药物，避免了对其他脏器的损伤。此外，脂质微球可以缓解化疗期间enpp2基因的上调和氧化应激下游信号通路的激活，因此该脂质微球也避免了vnb本身诱导的肿瘤侵袭和迁移的发生。
[0021]
综上所述，本发明提供的脂质微球具有如下应用优势：
[0022]
(1)实现了对重酒石酸长春瑞滨的高效包封。本发明选用合理的处方成分，将药物包封于脂质微球核心，最终包封率可达100％。
[0023]
(2)肿瘤微环境的药物响应性释放。本发明制备的脂质微球含有维生素e，其抗氧化特性可以响应低氧的肿瘤微环境，有助于药物在肿瘤部位有效释放，从而提高其抗肿瘤疗效并减少副作用的产生。
[0024]
(3)增强重酒石酸长春瑞滨的作用效果。在脂质微球中，维生素e可以增强重酒石酸长春瑞滨的抗肿瘤能力，产生“1+1＞2”的效果，可实现更好地抑制或杀死肿瘤细胞的目的。
[0025]
(4)抑制重酒石酸长春瑞滨本身诱导的肿瘤侵袭和转移。所述重酒石酸长春瑞滨脂质微球通过缓解氧化应激并抑制enpp2基因的激活从而抑制了化疗期间肿瘤细胞侵袭和转移的发生。
[0026]
(5)具有高的安全性。所述脂质微球避免了使用油酸、环糊精等具有潜在毒性的辅料，降低了用药风险。同时，制备过程中使用到的无水乙醇最终会通过真空挥发除去，避免了其引发的血管刺激性和酒精中毒的风险。此外，本发明采用的重酒石酸长春瑞滨虽然具有高的水溶性，但由于碱性氨基酸和磷脂的存在，亲水性的重酒石酸长春瑞滨会在制备过程中反应为疏水性的长春瑞滨，保证了高的载药量和包封率。
[0027]
本发明的创新性在于通过设计合理的处方，制备了一种具有超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球。该制剂具有便于生产、成本低廉、性质稳定、安全性高，且抗肿瘤能力
强和不良风险低的优点。化疗引起的氧化应激是疗效有限和毒副作用高的原因之一，本发明巧妙地将抗氧化剂与重酒石酸长春瑞滨联合使用，在降低重酒石酸长春瑞滨注射液的毒副作用和提高其抗肿瘤效果方面均有显著成效，因此具有良好的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干前的粒径分布图，平均粒径为112.3nm。
[0029]
图2为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球复溶后的粒径分布图，平均粒径为115.2nm。
[0030]
图3为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的血清稳定性评价，脂质微球可以在含有10％血清的体系中保持72小时的稳定性(图a为72小时内平均粒径的变化；图b为72小时内多分散系数(pdi)的变化)。
[0031]
图4为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的溶血毒性评价，相比重酒石酸长春瑞滨注射液，脂质微球具有更低的溶血毒性。
[0032]
图5为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体外安全性评价，相比重酒石酸长春瑞滨注射液，脂质微球具有更高的选择性肿瘤杀伤能力(图a为重酒石酸长春瑞滨脂质微球对肿瘤细胞和正常细胞的选择性杀伤效果，图b为重酒石酸长春瑞滨注射液对肿瘤细胞和正常细胞的选择性杀伤效果)。
[0033]
图6为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体内骨髓抑制毒性评价，相比重酒石酸长春瑞滨注射液，脂质微球对小鼠的骨髓抑制程度较轻(图a为小鼠白细胞变化；图b为小鼠血小板变化；图c为小鼠中性粒细胞变化)。
[0034]
图7为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的全身安全性评价，相比重酒石酸长春瑞滨注射液，脂质微球对大鼠体重影响较小，引起的死亡率更低，具有更高的安全性(图a为重酒石酸长春瑞滨脂质微球引起的大鼠体重变化；图b为重酒石酸长春瑞滨注射液引起的大鼠体重变化)。
[0035]
图8为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的ros响应性释放效果，脂质微球可以响应高ros的环境，从而高效释放药物。
[0036]
图9为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球对细胞内ros产生的影响，相比重酒石酸长春瑞滨注射液，脂质微球不会造成肿瘤细胞中ros的积累，避免了其下游信号通路的激活。
[0037]
图10为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体外抗肿瘤效果，维生素e和重酒石酸长春瑞滨的协同作用使脂质微球能够有效杀死a549细胞和llc细胞(图a为脂质微球对a549的细胞毒性；图b为脂质微球对llc的细胞毒性)。
[0038]
图11为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体内抗肿瘤效果,脂质微球具有最优的抑制肿瘤生长和转移的能力(图a为a549肿瘤生长曲线；图b为小鼠体重变化曲线；图c为小鼠肝脏和肺脏的ki67免疫组化染色图片；图d为小鼠肝脏和肺脏的h&e染色图片)。
[0039]
图12为制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球抑制肿瘤转移的机制，脂质微球通过缓解化疗时enpp2基因的过度上调而抑制肿瘤转移(图a、b分别为重酒石酸长春瑞滨脂质微球vs.重酒石酸长春瑞滨注射液的变化基因热图和火山图；图c为不同刺激条件下atx蛋白的
表达情况)
[0040]
图中的缩写说明：vnb：重酒石酸长春瑞滨注射液；vnb-np：不含维生素e的重酒石酸长春瑞滨脂质微球；vnb-vnp：本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球(含维生素e)。
具体实施方式
[0041]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细描述。应当指出，以下实施例仅为示例性地说明和解释本发明，不应用于限定本发明。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。在各实施例中，对于处方中的各组成成分的使用量，若无特别说明，则均为“按重量比计”。
[0042]
实施例1
[0043]
一种本发明提供的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表2)
[0044]
表2处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1中链甘油三酯(mct)15蛋黄卵磷脂(pl-100m)10精氨酸(l-arg)1蔗糖30无水乙醇30
[0045]
将vnb、mct和pl-100m溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将蔗糖和l-arg溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0046]
实施例2
[0047]
一种本发明提供的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表2)
[0048]
表2处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1维生素e(ve)10中链甘油三酯(mct)10蛋黄卵磷脂(pl-100m)10精氨酸(l-arg)1蔗糖30无水乙醇30注射用水180
[0049]
将vnb、ve、mct和pl-100m溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将蔗糖和
l-arg溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球或再经冻干得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干粉。
[0050]
拟考察本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的粒径、电位、药物包封率以及安全性。以实施例2的重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)为例进行以下方面的考察。
[0051]
1、冻干前与复溶后的粒径、pdi(polydispersity index)及包封率的对比
[0052]
复溶的操作具体如下：将实施例2所制得的重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干粉复溶(即向所制得的一瓶重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干粉内加入2ml注射用水或0.9％氯化钠溶液或5％葡萄糖溶液，振摇0.5～5分钟，勿倒置，至完全复溶)。
[0053]
粒径及pdi测定的操作具体如下：在测定前，利用超纯水将实施例2中制得的冻干前的脂质微球或复溶后的脂质微球稀释500倍，然后采用纳米粒度仪测定粒径及pdi。测定结果如表3所示。
[0054]
采用hplc法测定其包封率，具体测定方法如下：
[0055]
(1)色谱条件：a：b＝33：67。
[0056]
(2)标曲建立：称28mg重酒石酸长春瑞滨至20ml容量瓶中，加水溶解并稀释定容，摇匀。分别加水稀释成不同浓度的系列标准溶液，分别进hplc，以峰面积(a)对浓度(c)进行线性回归，得回归方程。
[0057]
(3)测重酒石酸长春瑞滨脂质微球中游离药物的含量：将1ml脂质微球稀释20倍后，取一定量置于50kd超滤管中，于5000rpm，4℃下离心10min，取清夜通过hplc测定游离重酒石酸长春瑞滨的含量。
[0058]
测重酒石酸长春瑞滨脂质微球中总药物的含量：精密吸取1ml重酒石酸长春瑞滨脂质微球并用无水乙醇破乳，然后利用hplc测定其中重酒石酸长春瑞滨的含量。
[0059]
根据上述方法分别测定总药物含量m1和游离药物含量m2，然后按照公式(1-m2/m1)
×
100％，即可计算出包封率。测定结果如表3所示。
[0060]
表3
[0061]
由表3可知，实施例2中制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球在冻干前后外观及粒径无明显差异，pdi均在0.1左右，包封率均高达99.5％，冻干不会影响制剂的性质，方便运输及贮存。此外，脂质微球冻干前后的粒径分布如图1和图2所示。
[0062]
需要说明的是，测定后述实施例6～13中制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的粒径、pdi及包封率的方法与上述相同。
[0063]
2、血清稳定性评价
[0064]
将实施例2中制备的脂质微球与10％胎牛血清共孵育，于不同时间点采样测定粒径及多分散指数(pdi)。结果如图3所示，72小时内脂质微球的粒径及pdi仅略微增加，表明本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球具有高的血清稳定性，可避免静脉注射后药物渗漏的发生，从而减少静脉刺激毒性并提高药物利用度。
[0065]
3、溶血毒性评价
[0066]
为了进行溶血测试，采集健康兔子的新鲜心脏血液。用盐水(1:10，v/v)稀释血液并以1300rpm离心15分钟以分离红细胞。按照表4所示将收集的红细胞进行孵育处理，仅用纯水和盐水处理的细胞分别用作阳性和阴性对照。在37℃下孵育3小时后，将样品以3000rpm离心5分钟，小心收集上清后使用紫外分光光度计在545nm进行光谱分析。溶血参数按照公式(odt-odn)/(odp-odn)
×
100％计算，其中odt、odn和odp分别代表测试组、阴性组和阳性组的光密度。结果如图4所示，即相比较重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)，本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)可显著降低溶血的发生，保证了临床用药安全性。
[0067]
表4
[0068]
4、体外安全性评价将实施例2中制备的脂质微球(vnb-vnp)以及市售重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)分别用pbs稀释到0.01μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.0μg/ml、100μg/ml和250μg/ml，然后孵育a549和nih-3t3细胞48小时，最后通过cck8检测细胞活性，需要注意的是，有效浓度均以长春瑞滨计。结果如图5所示，vnb-vnp对肿瘤细胞具有选择性杀伤能力(图5a)，而vnb对肿瘤细胞和正常细胞具有同等的杀伤效果(图5b)。因此本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球相比重酒石酸长春瑞滨注射液具有更高的选择性肿瘤杀伤能力，可有效避免对正
常细胞的损伤，显著提高了用药安全性。
[0069]
5、骨髓抑制毒性评价选取9只体重为20
±
2g的健康c57小鼠并随机分为生理盐水组、重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)组和重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)组，以10mg/kg的等效长春瑞滨剂量静脉注射vnb和vnb-vnp，每三天给药一次，共给药四次，治疗结束后眼球取血进行小鼠血常规检测来观察白细胞、中性粒细胞、血小板等的变化以评价骨髓抑制毒性。结果如图6所示，vnb导致c57小鼠的白细胞计数(wbc)(图6a)、血小板计数(plt)(图6b)以及中性粒细胞计数(neμ#)(图6c)降低，表现出骨髓抑制毒性，相比之下静脉注射vnb-vnp对骨髓损伤较轻，表明本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球可以降低化疗期间的骨髓抑制毒性，具有更高的安全性。
[0070]
6、体内安全性评价选取体重约为200g左右的6只sd大鼠，随机分为重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)组和重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)组，每组3只，以10mg/kg/周长春瑞滨的剂量经尾静脉给药，每天对大鼠进行一次称重，并记录死亡情况。结果如图7所示，即相比较vnb，vnb-vnp在给药期间对大鼠体重影响较小，减少了死亡情况的发生，明显降低了全身毒性，再次证明了本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的高安全性。
[0071]
实施例3一种本发明提供的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的应用，在高ros环境中实现药物的响应性释放。
[0072]
将重酒石酸长春瑞滨脂质微球在匀速搅拌的条件下用不同浓度的h2o2(0.01mm、0.1mm、1mm、10mm)在37℃下孵育72小时，于2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h的时间点取样并测定释放介质中的游离药物浓度，以此来探究其ros响应性释放的能力。结果如图8所示，当h2o2的浓度为0.1mm(类似于癌细胞中ros的水平)时，脂质微球释放了近45％的药物，当ros的浓度进一步增加到1mm、10mm时，药物的最终释放量分别增加到65％和71％，表明本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球能够响应肿瘤高ros的环境从而高效释放药物，最终增加肿瘤组织中的药物浓度，增强抗肿瘤效果。
[0073]
实施例4一种本发明提供的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的应用，能够减少化疗时ros的累积。
[0074]
为了检测在不同刺激条件下肿瘤细胞中ros的产生情况，将a549细胞分别用重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)和重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)以5μg/ml的等效长春瑞滨浓度孵育24小时，未处理的细胞用作对照。随后，用ros探针dcfh-da(10μm)在37℃的黑暗环境中孵育各组细胞20分钟以标记ros，最后在荧光显微镜下观察荧光信号强弱并拍照记录，image j软件被用来定量荧光强度。结果如图9所示,vnb导致肿瘤细胞中的ros显著增加，而vnb-vnp组最终的ros水平较低，表明本发明制备的脂质微球可以避免化疗时活性氧的累积，从而抑制其下游信号通路的激活。
[0075]
实施例5一种本发明提供的重酒石酸长春瑞滨脂质微球的应用，具有优良的体内外抗肿瘤能力。
[0076]
拟证明本发明中ve的协同作用并考察重酒石酸长春瑞滨脂质微球的抗肿瘤效果及机制，以实施例1(vnb-np)和实施例2(vnb-vnp)的重酒石酸长春瑞滨脂质微球为例进行以下方面的考察。
[0077]
1、体外抗肿瘤能力
[0078]
采用非小细胞肺癌细胞系llc和a549，通过cck8法来评价重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体外抗肿瘤效果。首先，胰酶消化对数期细胞并制备成浓度为5～10
×
10^4个细胞/ml的细胞悬液，轻轻混匀，96孔板中每孔加入100μl，边缘孔用无菌pbs填充。12小时后用vnb、vnb-np和vnb-vnp分别按以下浓度梯度处理，分别是0μg/ml、0.01μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和250.0μg/ml，每组6个复孔。在5％co2，37℃条件下孵育48小时后用cck8检测其细胞活性。结果如图10所示，相比较不含ve的体系即vnb-np和vnb，vnb-vnp具有更高的肿瘤杀伤效果，在最低浓度时就可以造成50％左右的a549细胞死亡，说明在体系中将维生素e作为注射用油可以对重酒石酸长春瑞滨产生增效作用，增强其抗肿瘤能力。
[0079]
2、体内抗肿瘤能力
[0080]
采用a549模型来评价重酒石酸长春瑞滨脂质微球的体内抗肿瘤效果。健康balb/c裸鼠28只，于右侧上肢腋下接种a549肿瘤组织块，待肿瘤组织块稳定生长且长到绿豆大小时，将小鼠分为4组，每组8只，详细分组及给药情况如表5所示,各组每三天给药一次，共给药四次。结果如图11所示，在所有治疗组中，vnb-vnp具有最优的抑制肿瘤生长的能力(图11a)，对小鼠体重影响也更小(图11b)，表明ve在提高疗效和降低毒性方面发挥着重要作用。治疗结束后对各组小鼠的肝脏和肺脏进行细胞增殖抗原ki67免疫组化染色和h&e染色，结果表明vnb和vnb-np的治疗会导致小鼠上述脏器中的异常细胞增殖增加，同时出现了多个癌细胞巢，而vnb-vnp治疗有效避免了上述过程(图11c和图11d)，表明ve的加入能够有效避免化疗过程中远端转移的发生从而阻止癌症恶化。综上所述，本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球不仅能够显著抑制肿瘤生长，还能预防治疗期间肿瘤远端转移的发生，具有巨大的临床应用潜力。
[0081]
表5组别给药注意生理盐水组每次0.2ml/vnb10mg/kg稀释至2.5mg/mlvnb-np10mg/kg稀释至2.5mg/mlvnb-vnp10mg/kg稀释至2.5mg/ml
[0082]
3、vnb-vnp通过缓解化疗时enpp2基因的过度上调而抑制肿瘤转移。
[0083]
为了探究vnb-vnp的作用机制，我们将a549细胞分别用0.05μg/ml的重酒石酸长春瑞滨注射液(vnb)和重酒石酸长春瑞滨脂质微球(vnb-vnp)处理3天后进行转录组分析。结果显示，用vnb-vnp处理的细胞有109个基因的活性低于用vnb处理的细胞，其中最为显著的基因为enpp2，而该基因是vnb刺激a549细胞之后被显著上调的基因之一(图12a、b)，这表明用vnb-vnp治疗可以有效缓解重酒石酸长春瑞滨治疗过程enpp2活性的过分升高。enpp2负责细胞自分泌运动因子(atx)的表达，因此通过western blot实验也验证了转录组分析的结果(图12c)，用不含ve的体系即vnb和vnb-np处理细胞后会引起atx表达增加，而用vnb-vnp处理的细胞atx的表达没有受到显著影响。研究表明atx活性的过分升高与癌症转移和不良进展有关，而本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球可以通过缓解enpp2基因的上调最终抑制化疗时肿瘤侵袭和转移的发生。
[0084]
实施例6
[0085]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表6)
[0086]
表6表6
[0087]
将vnb、大豆磷脂、mct和α-生育酚溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和谷氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0088]
实施例7
[0089]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表7)
[0090]
表7处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1α-生育醋酸酯15中链甘油三酯(mct)15dspc5大豆磷脂6赖氨酸3.5乳糖25无水乙醇30注射用水180
[0091]
将vnb、磷脂、mct和α-生育醋酸酯溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和赖氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm
的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0092]
实施例8
[0093]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表8)
[0094]
表8处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1α-生育琥珀酸酯10中链甘油三酯(mct)12d0pc5大豆磷脂5谷氨酸2.5乳糖25无水乙醇30注射用水180
[0095]
将vnb、α-生育琥珀酸酯、mct和磷脂溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和谷氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0096]
实施例9
[0097]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表9)
[0098]
表9表9
[0099]
将vnb、ve、mct和磷脂溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和精氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0100]
实施例10
[0101]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表10)
[0102]
表10处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1维生素e(ve)5α-生育酚5中链甘油三酯(mct)5蛋黄卵磷脂(pl-100m)10精氨酸(l-arg)2.5乳糖25无水乙醇30注射用水180
[0103]
将vnb、ve、α-生育酚、mct和pl-100m溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和精氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0104]
实施例11
[0105]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表11)
[0106]
表11
[0107]
将vnb、ve、α-生育醋酸酯、mct和磷脂溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖和精氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0108]
实施例12
[0109]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表12)
[0110]
表12处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1维生素e(ve)5中链甘油三酯(mct)5蛋黄卵磷脂(pl-100m)10精氨酸(l-arg)2乳糖5蔗糖20无水乙醇30注射用水180
[0112]
将vnb、ve、mct和pl-100m溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将乳糖、蔗糖和精氨酸溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0113]
实施例13
[0114]
一种本发明提供的注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球的组成(见表13)
[0115]
表13处方组成重量比重酒石酸长春瑞滨(vnb)1维生素e(ve)5中链甘油三酯(mct)2蛋黄卵磷脂(pl-100m)6大豆磷脂4精氨酸(l-arg)0.5蔗糖30无水乙醇30注射用水180
[0116]
将vnb、ve、mct和磷脂溶于无水乙醇中，而后除去乙醇，得油相。另外，将精氨酸和蔗糖溶于注射用水中，充分溶解后得水相。将水相缓慢加入油相中，高速剪切10min即得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳。将初乳转至均质机，加压循环均质，得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳，采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次之后0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0117]
对于上述实施例6～13所制得的重酒石酸长春瑞滨脂质微球，对其外观、包封率以及粒径进行了考察，具体结果示于表14。
[0118]
表14表14
[0119]
由表14可知，对于实施例6～13中制得的重酒石酸长春瑞滨脂质微球来说，其外观良好，均为半透明乳状液体，并未发生分层破乳等现象，另外，其粒径较小且分布窄，均未检出大于5μm的微乳粒子。但当满足以下条件时，实现了重酒石酸长春瑞滨的超高包封：1)ve
及其衍生物：mct＝5～15：5～15；2)磷脂：注射用油＝5～11：2～20；3)磷脂为蛋黄卵磷脂(pl-100m)；4)ph调节剂为精氨酸(l-arg),且其重量比为0.5～2。
[0120]
本发明采用恰当的处方成分及比例，将重酒石酸长春瑞滨有效包封，从而制得了具有高包封率、高稳定性的重酒石酸长春瑞滨脂质微球。
[0121]
本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球具有高于重酒石酸长春瑞滨注射液的安全性，降低了化疗期间的全身毒性和骨髓抑制毒性，可显著减轻患者不适而提高治疗依从性。
[0123]
在本发明中，ve赋予了重酒石酸长春瑞滨脂质微球优异的抗氧化能力，能够中和化疗过程中产生的ros，从而避免了化疗期间因ros累积而引起的一系列氧化应激相关通路的激活，并且ve的存在也增强了重酒石酸长春瑞滨的体内外抗肿瘤效果。更重要的是，本发明制备的重酒石酸长春瑞滨脂质微球可以缓解治疗期间enpp2基因的上调，最终避免了肿瘤侵袭和转移的发生，具有巨大的临床应用潜力。
[0124]
综上所述，本发明为开发出安全、稳定、有效且具备超高包封率的重酒石酸长春瑞滨纳米制剂提供了全新的思路，在重酒石酸长春瑞滨的临床应用方面具有极为重要的意义。

技术特征：
1.一种超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球，其特征在于，所述脂质微球由重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂、ph调节剂以及稳定剂组成，其中重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂、ph调节剂及稳定剂按重量比计为0.5～5：2～30：5～11：0.5～2：20～40。2.根据权利要求1所述的脂质微球，其特征在于，所述注射用油为中链甘油三酯和至少一种维生素e及其衍生物，其中维生素e及其衍生物与中链甘油三酯以重量比为5～20：1～17。3.根据权利要求2所述的脂质微球，其特征在于，维生素e及其衍生物与中链甘油三酯以重量比为5～15：2～15。4.根据权利要求1所述的脂质微球，其特征在于，所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或多种，其中乳化剂与注射用油以重量比为3～15：1～37。5.根据权利要求4所述的脂质微球，其特征在于，乳化剂与注射用油以重量比为5～11：2～30。6.根据权利要求1中所述的脂质微球，其特征在于，所述ph调节剂选自谷氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的脂质微球，其特征在于，所述ph调节剂选为精氨酸，精氨酸与重酒石酸长春瑞滨以重量比计为0.1～5：0.1～10，优选为0.5～2：0.5～5。8.根据权利要求1所述的脂质微球，其特征在于，所述稳定剂选自蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。9.根据权利要求1所述的脂质微球的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)油相制备：将注射用油、乳化剂及重酒石酸长春瑞滨溶于有机溶剂，真空挥发除去有机溶剂，形成油相，有机溶剂选用无水乙醇；(2)水相制备：向注射用水中加入ph调节剂和稳定剂，充分溶解后得水相；(3)初乳制备：油相在一定转速下剪切，将水相缓慢加入到油相中，继续剪切得重酒石酸长春瑞滨脂质微球初乳液；(4)终乳制备：将初乳转至均质机，加压循环均质得重酒石酸长春瑞滨脂质微球终乳。(5)分装灭菌及冻干：采用滤芯材质为pes的0.45μm的微孔滤膜过滤一次，再采用同样材质的0.22μm的微孔滤膜过滤第二次，过滤完成后将其分装于西林瓶，经高压蒸汽灭菌即得注射用重酒石酸长春瑞滨脂质微球或再经冻干得重酒石酸长春瑞滨脂质微球冻干粉。10.权利要求1所述的脂质微球在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤是非小细胞肺癌，所述应用是通过调控肿瘤氧化应激和外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2基因来抑制化疗过程中肿瘤细胞侵袭和转移的发生。

技术总结
本发明提供超高包封率的重酒石酸长春瑞滨脂质微球及制备与应用，脂质微球由重酒石酸长春瑞滨、注射用油、乳化剂、pH调节剂以及稳定剂组成，将重酒石酸长春瑞滨、注射用油和乳化剂溶解于有机溶剂，减压蒸发得到油相，然后将含有pH调节剂和稳定剂的水相在剪切条件下加入到油相得初乳，初乳经高压均质后得到脂质微球。本发明脂质微球具有超高药物包封率和长期血清稳定性的特点，同时安全性较高，可显著降低重酒石酸长春瑞滨引起的全身毒性和骨髓抑制毒性，其一方面能够响应肿瘤微环境高效释放药物，提高化疗的疗效；另一方面通过调控氧化应激和外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)基因来抑制化疗过程中肿瘤细胞侵袭和转移的发生。发生。


技术研发人员：游剑 赵小奇 张俊镭
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/14