一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术技术领域，具体为一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法。


背景技术：

2.当归补血颗粒是陕西盘龙药业集团股份有限公司新开发的一款妇科经典名方创新药，本中成药由黄芪、酒当归等多味名贵道地中药组成，具有补气生血之功效，主治血虚发热证，症见肌热，燥热，烦渴引饮，目赤面红，昼夜不息，脉洪大而虚，重按无力。用法用量：口服，每日三次、每次1袋；规格：每袋10g。
3.本产品由我公司组织相关技术人员开展了药材基原研究、处方研究、药材质量研究、工艺研究、质量标准研究、稳定性研究等药学研究以及药理毒理等非临床研究，为了有效控制产品质量，保证产品疗效，按照《药品注册管理办法》及《中国药典》等相关要求，制定了本药品质量标准，主要内容包括处方、制法、性状、鉴别、检查、含量测定（阿魏酸、黄芪甲苷）、功能与主治、用法与用量、规格、贮藏等。
4.经查阅文献和资料，有多种药材和药品、食品中阿魏酸的含量测定方法，但没有一种专门针对当归补血颗粒中阿魏酸含量的专用检测方法，现有的方法用在当归补血颗粒中，专属性和准确性都较差，不能满足本产品的检测要求，为了准确检测当归补血颗粒中阿魏酸含量，从而保证当归补血颗粒的质量，为此，我们提出了一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法，可以有效解决背景技术中的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验、测定法；该一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法包括以下步骤：步骤一，供试品溶液的制备：取当归补血颗粒适量，研细，取约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；步骤二，对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加75%甲醇制成每lml含9ug的溶液，即得；步骤三，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm,内径为2.lmm,粒径为2.2μm)；以乙腈-0.085%磷酸溶液(35 : 65 )为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于8000；
7.步骤四，测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1u1，注入液相色谱仪，
测定，即得。
8.优选的，所述每袋含阿魏酸（c29h50o）计，含量应为2.50
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5.68mg；超声处理的功率为400w，频率为40khz；阿魏酸色谱峰分离度应符合要求。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过“供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验、测定法”实现含量检测，采用高效液相色谱法测定本样品中的阿魏酸限量测定方法合理可行，建立的当归补血颗粒中阿魏酸的含量测定方法合理、简单可行，准确度高。
附图说明
10.图1为本发明一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法的流程图；图2为本发明中阿魏酸对照品线性图；图3为本发明中精密度试验结果的示意图；图4为本发明中重复性试验结果的示意图；图5为本发明中样品的回收率试验结果的示意图；图6为本发明中阿魏酸对照品线性考察结果的示意图；图7为本发明中对照品溶液的稳定性试验结果的示意图；图8为本发明中供试品的稳定性试验结果的示意图；图9为本发明中色谱条件耐用性试验结果的示意图；图10为本发明中15批当归补血颗粒中阿魏酸测定情况汇总表的示意图。
具体实施方式
11.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
12.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.实施例11、仪器与试药仪器：赛默飞vanquishf高效液相色谱仪（uv检测器，chromeleon7色谱工作站），赛默飞世尔科技有限公司生产evolution201紫外-可见分光光度计，美国赛默飞公司生产；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；sqp型1mg分析天平，赛多利斯公司生产；quintix213-1cn；sqp型0.1mg分析天平，赛多利斯公司生产；secura224-1cn；sqp型0.01mg分析天平，赛多利斯公司生产；secura125-1cn；arium
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pro超纯水机，赛多利斯公司生产；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；
阿魏酸对照品，批号：110773-201915，hplc法纯度99.4%，50mg/支，产于中国食品药品检定研究院。
14.乙腈，色谱纯，阿斯顿生物工程技术（上海）有限公司甲醇，安徽天地高纯溶剂有限公司生产；甲醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司公司生产；水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。
15.2、对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1ml约含9ug的溶液，即得。
16.3、最大吸收波长的确定精密称取阿魏酸对照品9.46mg，加75%甲醇溶解并稀释制成浓度为9.40ug/ml对照品溶液，在190nm～1100nm的波长范围内用紫外-可见分光光度计扫描，结果显示阿魏酸在313nm波长处有最大吸收，故以313nm作为阿魏酸含量测定的测定波长。
17.4、色谱条件与系统适用性试验阿魏酸，照高效液相色谱法（通则0512）测定。
18.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm,内径为2.lmm,粒径为2.2μm)；以乙腈-0.085%磷酸溶液(35:65)为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于8000。
19.5、供试品溶液的制备供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
20.6、专属性试验按照当归补血颗粒质量标准【制法】项下的工艺方法制备缺酒当归的阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成酒当归阴性供试品溶液，在拟定的色谱条件下进样10μl测定，结果阿魏酸色谱峰相应的位置上，阴性样品无色谱峰被检出，由此说明在上述色谱条件下处方中其它药材的成分对酒当归中的阿魏酸的测定无干扰，专属性良好。
21.7、精密度试验仪器重复性按上述拟定的液相色谱方法，配制对照品溶液，分别取对照品溶液连续进样5次，在上述色谱条件下进行检测，以阿魏酸峰面积（ax）进行考察，结果5次进样测定后的相对标准偏差rsd为0.39％，说明仪器的精密度良好，见附图3。
22.8、重复性：按上述拟定的液相色谱方法，配制批号为20220802当归补血颗粒阿魏酸含量测定样品溶液6份，由同一测定人员在同一实验室按上述色谱条件进行检测，计算每份样品中的阿魏酸的含量结果进行考察。结果6份样品测定结果的平均值为4.44mg/袋，相对标准偏差rsd为1.80％，小于标准规定的2.0％，说明方法的重复性良好，见附图4。
23.9、准确度供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
24.对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品9.46mg（纯度为99.4%），精密称定，置50ml棕色量瓶中，作为对照品储备液。精密量取0.5ml对照品储备液，置20ml棕色量瓶中，加75%甲醇制成每lml含9.40ug的溶液，即得。
25.准确度的样品准备：取本品适量，研细，取约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，共9份，分为低、中、高三个不同水平。低水平三组，分别加入188.06ug/ml的对照品溶液0.60ml,再量取24.40ml的75%甲醇；中水平三组，分别加入上述对照品储备液1.25ml,再量取23.75ml的75%甲醇；高水平三组，分别加入上述对照品储备液1.90ml,再量取23.10ml的75%甲醇，密塞，称定重量，超声处理(功率400w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
26.按上述色谱条件进行检测，并根据下列公式计算回收率，计算rsd，结果见附图5；回收率试验表明，加入阿魏酸对照品设计的高、中、低三个不同水平的回收率在94.15%～104.01%之间，平均回收率99.77，在标准规定的80～115％范围内，试验结果符合规定，说明该方法准确可靠，误差在允许的范围内。
27.10、检测限与定量限取阿魏酸对照品9.46mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，加75%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为阿魏酸对照品储备液。取阿魏酸对照品储备液0.25ml，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，作为对照品溶液。
28.定量限溶液：将上述对照品溶液稀释进样至峰高约为噪音值10倍，即为定量限溶液。
29.检测限溶液：将上述对照品溶液稀释进样至峰高约为噪音值3倍，即为检测限溶液。
30.测定：分别精密吸取上述定量限溶液和检测限溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
31.结果：阿魏酸对照品溶液检出限浓度为0.00940ug/ml（9.40ng）；阿魏酸对照品溶液定量限浓度为0.00282ug/ml（2.82ng）。
32.11、线性取阿魏酸对照品，制成浓度为150.4ug/ml的对照品溶液，分别稀释成浓度为37.6ug/ml、18.8ug/ml、9.4ug/ml、4.7ug/ml、2.35ug/ml、1.175ug/ml的对照品溶液，分别进样1μl，记录色谱图及峰面积积分值，平行进样三次。以阿魏酸的进样量（μg）作为横坐标（x），以阿魏酸峰面积积分值作为纵坐标（y），绘制标准曲线，并对所测得的数据进行回归分析，得回归方程为
33.y=0.9355x-0.0003，相关系数r2=0.9999。说明阿魏酸的进样量在1.175ug～37.6ug之间时，进样量与峰面积积分值之间呈现良好的线性关系，结果见附图6（阿魏酸对照品线性考察结果）以及附图2（阿魏酸对照品线性考察结果）。
34.12、范围根据分析方法的线性、精密度、准确度的试验结果，确定分析方法的浓度范围为1.18ug/ml～37.60ug/ml，对应的量的范围为1.175μg～37.60μg。
35.13、稳定性试验按拟定的检测方法，制备对照品溶液；取当归补血颗粒批号20220802样品0.5g，按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，取对照品溶液和供试品溶液各1μl，在上述色谱条件下每隔一定时间测定一次，考察对照品溶液和供试品溶液的稳定性情况，测定结果见附图7和附图8。
36.14、耐用性在上述确定的色谱条件下，取同一份对照品和供试品溶液，分别对流动相的配比、缓冲盐的浓度进行微调，考察供试品在不同条件下的含量变化情况，结果见附图9。
37.在方法耐用性实验中，进样量在拟定的基础上上下浮动10%进样；检测波长在拟定的313nm基础上，上下浮动3nm检测；柱温在拟定的30℃的基础上，上下浮动2℃检测；流动相流速在拟定的0.5ml/min基础上上下浮动10%检测；使用同型号不同厂家的色谱柱检测，最终结果的的rsd为1.02%，符合小于2%的规定。
38.综上，以色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm,内径为2.lmm,粒径为2.2μm)；以乙腈-0.085%磷酸溶液(35:65)为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于8000的色谱条件是合适的，并且有一定的耐用性。
39.15、样品含量测定按上述方法对本品多批次样品测定的含量数据如下，见附图10；用本次拟定的方法对上述15批当归补血颗粒样品中的阿魏酸含量测定，测定结果每袋在2.78mg～5.16mg之间。根据15批当归补血颗粒中阿魏酸含量测定结果，阿魏酸含量暂定按最低值下浮10%计，高值上浮10%计；本品每袋含阿魏酸含量以阿魏酸（ｃ10h10o4）计，应为2.50-5.68mg。
40.通过上述的方法学试验结果表明，采用高效液相色谱法测定本样品中的阿魏酸限量测定方法合理可行。
41.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验、测定法；该一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法包括以下步骤：步骤一，供试品溶液的制备：取当归补血颗粒适量，研细，取约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；步骤二，对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加75%甲醇制成每lml含9ug的溶液，即得；步骤三，色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm,内径为2.lmm,粒径为2.2μm)；以乙腈-0.085%磷酸溶液(35 : 65 )为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于8000；步骤四，测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1u1，注入液相色谱仪，测定，即得。2.根据权利要求1所述的一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法，其特征在于,所述每袋含阿魏酸（c29h50o）计，含量应为2.50
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5.68mg；超声处理的功率为400w，频率为40khz；阿魏酸色谱峰分离度应符合要求。

技术总结
本发明公开了一种经典名方当归补血颗粒中阿魏酸的含量检测方法，包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验、测定法。本发明通过“供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验、测定法”实现含量检测，采用高效液相色谱法测定本样品中的阿魏酸限量测定方法合理可行，建立的当归补血颗粒中阿魏酸的含量测定方法合理、简单可行，准确度高。准确度高。准确度高。


技术研发人员：郝海源 张德柱 王鹏利 周绪华 任娅妮 高哲
受保护的技术使用者：陕西盘龙医药研究院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/9/14