一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法

1.本发明涉及组织培养技术领域，特别是涉及一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法。


背景技术：

2.色木槭无性繁殖生根比较困难,制约了其良种繁育和工厂化生产。目前色木槭研究较多的是种子催芽、扦插繁殖和苗木的培育，但是繁殖系数低且性状不稳定，不能满足苗木生产需求；通过组织培养手段来繁殖色木槭苗木尚处在起步阶段。现有色木槭带腋芽茎段伸长培养的萌发率为63.3％，而本试验采用经过复幼处理的带芽茎段萌发率为83.33％，比之前萌发率提高20％左右。茎段增殖阶段筛选不同激素配方，现有色木槭增殖系数为3.19，本方案增殖系数最大可达到4。目前色木槭繁殖采用间接器官发生途径，通过诱导愈伤在经过分化诱导出不定芽和不定根，获得的再生植株存在一定比例的变异。本方案主要采用腋芽增生途径以带腋芽茎段为外植体进行离体快繁研究，获得的组培再生植株遗传稳定。以往研究大多停留在消毒、伸长和增殖阶段，少数学者对生根培养进行了研究，但并未建立完整色木槭组培体系。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供了一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明提供了一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法，包括以下步骤：
6.1)将带色木槭腋芽茎段依次清洗、乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒，得到消毒外植体；
7.所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量百分含量为2％；
8.2)将所述步骤1)得到的消毒外植体进行芽伸长培养，得到芽伸长培养物；
9.所述芽伸长培养使用的培养基包括：ms+6-ba和/或naa；
10.所述6-ba的含量为0.1～0.5mg/l，所述naa的含量为0.1～0.5mg/l；
11.3)将所述步骤2)得到的芽伸长培养物处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行定芽诱导分化培养，得到嫩茎；
12.所述芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l6-ba+0.01～0.05mg/l naa；
13.4)将所述步骤3)得到的嫩茎进行增殖培养，得到茎丛；
14.所述增殖培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l 6-ba+0.02～0.05mg/lnaa；
15.5)将所述步骤4)得到的茎丛处理成微枝，将所述微枝进行生根培养，得到色木槭幼苗；
16.所述生根培养使用的培养基包括：1/2ms+0.5mg/l naa。
17.优选的，所述步骤1)带色木槭腋芽茎段的获取方法包括：将成年色木槭母树的当
年生幼嫩枝条或休眠枝条处理成2～3cm段，每段上带有1个腋芽。
18.优选的，所述休眠枝条的获取时间为当年4月初；
19.所述当年生幼嫩枝条的获取方法包括：将所述成年色木槭母树在当年经过复幼处理；
20.所述复幼处理包括：距地上0.5m处进行截干，截干的次数为1～2次，间隔时间为60d。
21.优选的，所述步骤1)次氯酸钠溶液消毒的时间为10～20min。
22.优选的，所述步骤2)6-ba的含量为0.5mg/l，所述naa的含量为0.5mg/l；
23.所述芽伸长培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。
24.优选的，所述步骤3)所述芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+2mg/l6-ba+0.05mg/l naa；
25.所述芽诱导分化培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。
26.优选的，所述步骤4)增殖培养使用的培养基包括：ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/l naa；
27.所述增殖培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。
28.优选的，所述步骤5)生根培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。
29.优选的，得到色木槭幼苗后还包括炼苗和移栽。
30.优选的，所述移栽使用的基质包括草炭和蛭石，所述草炭和蛭石的体积比为1:1。
31.本发明的有益效果为：
32.(1)4月初休眠芽长度、宽度数值较大，重量最重，形态最饱满，在此时间采集休眠芽枝条进行试验效果最好。
33.(2)选择色木槭带休眠芽茎段为外植体进行离体快繁，2％次氯酸钠溶液消毒15min消毒效果最好，存活率最高，污染率和褐化率相对较低，是色木槭带休眠芽芽茎段最佳消毒方法。
34.(3)在茎段的启动培养阶段，若需要萌发率高，选择培养基：ms+0.5mg/l6-ba；需要嫩茎高度最高，选择培养基：ms+0.5mg/l naa；根据出愈率大小及生长状态好坏，若需要大量愈伤，选择培养基：ms+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/lnaa。
35.(4)采集不同复幼措施处理的色木槭萌蘖枝条的带芽茎段为外植体进行组培，结果表明在0.5m处截干处理的色木槭植株产生的萌蘖枝条组培效果最好。
36.(5)以茎段为外植体，最佳芽诱导培养基激素配方为6-ba的浓度为1.5mg/l，naa浓度为0.05mg/l。通过极差分析和方差分析发现，各因素对试验指标影响力大小的排序为：外植体类型＞6-ba浓度＞naa浓度。
37.(6)6-ba处理对外植体增殖率的影响大于naa处理；最佳增殖培养基：ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/l naa，其增殖率和增殖系数都是最高的，分别为66.65％、4；
38.(7)选择1/2ms作为生根培养的基本培养基，效果最好。1/2ms+0.5mg/lnaa为最佳
生根培养基。
39.(8)对生根苗进行炼苗移栽，移栽成活率为66.67％。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
41.图1为不同消毒方法对外植体生长状况的影响；
42.图2为添加0.2mg/l 6-ba的ms培养基培养21d的色木槭茎段的生长状况；
43.图3为在添加0.2mg/l naa的ms培养基培养21d的色木槭茎段的生长状况；
44.图4为在添加0.2mg/l naa和0.5mg/l 6-ba的ms培养基培养7d的色木槭茎段的生长状况；
45.图5为不同复幼措施处理对色木槭外植体生长状况的影响；
46.图6为添加0.05mg/l naa和1.5mg/l 6-ba的ms培养基培养21d的色木槭茎段诱导分化不定芽；
47.图7为在添加0.05mg/l naa和2.5mg/l 6-ba的ms培养基培养21d的色木槭茎段增殖培养；
48.图8为在添加0.5mg/l naa的1/2ms培养基培养21d的色木槭茎段生根培养。
具体实施方式
49.本发明提供了一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法，包括以下步骤：
50.1)将带色木槭腋芽茎段依次清洗、乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒，得到消毒外植体；
51.所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量百分含量为2％；
52.2)将所述步骤1)得到的消毒外植体进行伸长培养，得到伸长培养物；
53.所述伸长培养使用的培养基包括：ms+6-ba和/或naa；
54.所述6-ba的含量为0.1～0.5mg/l，所述naa的含量为0.1～0.5mg/l；
55.3)将所述步骤2)得到的伸长培养物处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行芽诱导分化培养，得到嫩茎；
56.所述芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l6-ba+0.01～0.05mg/l naa；
57.4)将所述步骤3)得到的嫩茎进行增殖培养，得到芽苗；
58.所述增殖培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l 6-ba+0.02～0.05mg/lnaa；
59.5)将所述步骤4)得到的芽苗处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行生根培养，得到色木槭幼苗；
60.所述生根培养使用的培养基包括：1/2ms+0.5mg/l naa。
61.本发明将带色木槭腋芽茎段依次清洗、乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒，得到消毒外植体；所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量百分含量为2％。
62.在本发明中，所述清洗优选使用洗衣液上清液在搅拌下清洗5min，再用流水冲洗2h。在本发明中，所述乙醇溶液的体积百分含量优选为75％，消毒时间优选为30s。在本发明
中，所述次氯酸钠溶液消毒的时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述带色木槭腋芽茎段的获取方法优选包括：将成年色木槭母树的当年生幼嫩枝条或休眠枝条处理成2～3cm段，每段上带有1个腋芽。在本发明中，所述休眠枝条的获取时间优选为当年4月初。在本发明中，所述休眠枝条经培养萌发新的嫩茎后，再用于后续组织培养。在本发明中，所述当年生幼嫩枝条的获取方法优选包括：将所述成年色木槭母树在当年经过复幼处理。在本发明中，所述复幼处理优选包括：距地上0.5m处进行截干，截干的次数为1～2次，间隔时间为60d。
63.本发明将得到的消毒外植体进行伸长培养，得到伸长培养物；所述伸长培养使用的培养基包括：ms+6-ba和/或naa；所述6-ba的含量为0.1～0.5mg/l，所述naa的含量为0.1～0.5mg/l。在本发明中，所述6-ba的含量优选为00.5mg/l，所述naa的含量优选为0.5mg/l。在本发明中，所述伸长培养的条件优选包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。在本发明中，所述伸长培养的时间优选为21d。
64.本发明将得到的伸长培养物处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行芽诱导分化培养，得到嫩茎；所述芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l6-ba+0.01～0.05mg/l naa。在本发明中，所述带芽茎段优选至少带1个芽，所述带芽茎段的长度优选为2～3cm。在本发明中，所述芽诱导分化培养使用的培养基优选包括：ms+2mg/l 6-ba+0.05mg/l naa。在本发明中，所述芽诱导分化培养的条件优选包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。在本发明中，所述芽诱导分化培养的时间优选为21d。
65.本发明将得到的嫩茎进行增殖培养，得到茎丛；所述增殖培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l 6-ba+0.02～0.05mg/l naa。在本发明中，所述增殖培养使用的培养基优选包括：ms+2.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa。在本发明中，所述增殖培养的条件优选包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。在本发明中，所述增殖培养的时间优选为21d。
66.本发明将得到的茎丛处理成微枝，将所述微枝进行生根培养，得到色木槭幼苗；所述生根培养使用的培养基包括：1/2ms+0.5mg/l naa。在本发明中，所述微枝优选至少带1个芽，所述微枝的长度优选为2～3cm。在本发明中，所述生根培养的条件优选包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。在本发明中，所述生根的时间优选为21～30d。
67.本发明得到色木槭幼苗后还优选包括炼苗和移栽。在本发明中，所述移栽使用的基质优选包括草炭和蛭石，所述草炭和蛭石的体积比优选为1:1。在本发明中，所述炼苗的条件优选包括：将株高4cm以上根系发达、叶片展开的健壮幼苗在培养室内敞口炼苗3～5d，逐天增加光照至全光照，一般需4d～5d。
68.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
69.实施例1
70.1材料与方法
71.1.1试验材料
72.试验所用材料为色木槭成年母树的当年生幼嫩枝条和休眠枝条。枝条取自黑龙江
省尚志市东北林业大学帽儿山实验林场老山实验站苗圃培育的复幼处理的色木槭母树。休眠枝条于2021年3月至4月每周取材一次，置于室内水培萌发，取新抽取嫩茎为外植体，进行组织培养。当年生幼嫩枝条取自2022年6月，取材后置于4℃冰箱保存备用。
73.1.2试验方法
74.1.2.1不同时间对休眠芽形态大小的影响
75.自2021年3月初到4月末，每隔7～10d采集一次带休眠芽茎段，测量其休眠芽的长度、宽度及重量。
76.1.2.2不同消毒方法对外植体存活率的影响
77.带休眠芽茎段消毒灭菌方法：试验前用试管刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗枝条，然后用水冲洗干净，剪成2～3cm小段，每段具1个腋芽。将茎段放入洗衣液上清液，在磁力搅拌器上搅拌5分钟，冲洗干净后将茎段在流水下冲洗2h。洗干净后置于超净工作台上用75％酒精消毒30s，分别用以下消毒方法：
78.(1)0.1％氯化汞溶液(质量百分含量)处理(2、4、6、8min)，用无菌水冲洗4到5次后剥去种鳞，裸露芽原基接种到不含激素ms培养基上，记作处理1、2、3、4；
79.(2)2％次氯酸钠溶液(质量百分含量)消毒(5、10、15、20min)，用无菌水冲洗4到5次，休眠芽剥去种鳞，露出芽原基，剥离茎段接入到不含激素ms培养基上，记作处理5、6、7、8。
80.7d后统计污染率、褐化率，21d后统计存活率、死亡率。
81.幼嫩茎段消毒灭菌方法：取嫩枝切成2-3cm带芽茎段，在清水中洗去嫩茎浮尘后在水流下冲洗1h。洗干净后放进超净工作台中，然后用1％次氯酸钠溶液处理4min进行体表灭菌，无菌水冲洗3-4次后，接种到伸长培养基中。
82.培养条件：试验所用培养基均附加蔗糖20g/l，琼脂7g/l，ph值为5.8，培养室培养温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。
83.计算公式如下：
84.污染率(％)＝外植体污染个数
×
100/接种外植体总数
85.死亡率(％)＝外植体死亡个数
×
100/接种外植体总数
86.褐化率(％)＝外植体褐化个数
×
100/接种外植体总数
87.存活率(％)＝外植体存活个数
×
100/接种外植体总数
88.1.2.3不同外源激素处理对外植体伸长培养的影响
89.将带芽茎段接种到含有不同浓度的6-ba(0、0.1、0.2、0.5mg/l)和naa(0、0.1、0.2、0.5mg/l)组合的基本培养基上，共16个处理。每种处理10个外植体，每组重复三次。培养条件同1.2.2。培养21d后观察统计各个处理的腋芽存活率、萌发率、嫩茎平均高度和生长状况。
90.萌发率(％)＝外植体萌发个数
×
100/接种外植体总数
91.平均高度＝萌发苗高度之和/萌发苗的总数
92.1.2.4不同复幼处理对外植体生长状况的影响
93.以不同复幼措施处理的幼嫩枝条的带芽嫩茎为外植体。接种到最优配方伸长培养基中，共6个处理，每个处理10个外植体，每组重复3次。培养条件1.2.2。培养21d后观察统计各个处理的腋芽存活率、萌发率。
94.色木槭母树的复幼措施处理
95.于2021年4月28日选取帽儿山实验林场老山实验站试验林地中生长健壮、长势基本一致的7a生色木槭植株通过截干(距地面距离0.5m、1.0m、1.5m)、环剥、喷施激素(200mg/l 6-ba)等措施对色木槭进行复幼处理，共8种处理，如表1所示。
96.截干处理是指留取色木槭植株地上部分所需要的高度，将上部枝干全部剪掉；环剥处理是于主干(永久枝)基部10cm处进行全周环剥，即剥去1圈1cm宽的树皮，环剥深度以刚切断皮层、恰至木质部(不伤木质部)为宜；喷施外源激素是每隔60d对萌发枝条或当年生枝条的叶子表面喷施一次。每种处理方式8棵植株，每组重复3次。之后每隔60d进行一次复幼处理，如表1。60d后观察统计色木槭萌蘖枝条长度、数量、宽度。到次年4月为止，可进行三次处理，分别与7.3、9.4日共采集两次枝条。
97.表1色木槭植株的复幼处理方式
98.处理截干(m)环剥200mg/l6-ba10.5————21.0————31.5————4——环剥——5————喷施激素6——————
99.4月底对色木槭植株进行第一次截干，60d后进行第二次截干。
100.1.2.5不同外源激素处理对外植体诱导分化的影响
101.将带芽茎段分割成叶柄、叶片、不带芽茎段三种外植体，接种到含有不同浓度的6-ba(1.5、2.0、2.5mg/l)和naa(0.01、0.02、0.05mg/l)组合的基本培养基上，共9个处理。每种处理10个外植体，每组重复三次。培养条件同1.2.2。培养21d后观察统计各个处理的出愈率、分化率。
102.出愈率(％)＝外植体产生愈伤个数
×
100/接种外植体总数
103.分化率(％)＝外植体分化不定芽个数
×
100/接种外植体总数
104.1.2.6不同外源激素处理对外植体增殖培养的影响
105.将带芽茎段接种到含有不同浓度的6-ba(1.5、2.0、2.5mg/l)和naa(0.02、0.05mg/l)组合的基本培养基上，共6个处理。每种处理10个外植体，每组重复三次。培养条件同1.2.2。培养21d后观察统计各个处理的嫩茎增殖率、增殖系数。
106.增殖率(％)＝外植体产生有效苗个数
×
100/接种外植体总数
107.芽苗的增殖系数＝有效苗总数/接种苗总数
108.1.2.7不同外源激素处理对外植体生根培养的影响
109.取经继代培养后健壮的芽苗，切割成2～3cm带芽茎段，接种到不同的基本培养基(1/2ms、ms)和naa(0.1、0.2、0.5mg/l)组合的培养基上进行生根培养，共6个处理，每组处理10个外植体，每组重复三次。培养条件同1.2.2。培养21d后观察统计各个处理试管苗的生根率、平均生根数、平均根长。
110.生根率(％)＝生根的苗数
×
100/接种生根培养的苗数
111.平均根数＝生根苗所有根数之和/生根苗的总数
112.平均根长＝生根苗所有根长度之和/生根苗的总数
113.1.2.8炼苗移栽
114.生根培养30d后，将株高4cm以上根系发达、叶片展开的健壮幼苗在培养室内敞口炼苗3～5d，之后放于散射光下逐天增加光照至全光照。炼苗结束后用清水洗净苗基部培养基，移植到草炭∶蛭石＝1∶1(体积比)的营养基质上，浇透水并用塑料薄膜，遮阴7d～10d，并保持空气湿度。定时用喷雾器喷洒。15d后统计移栽成活率。
115.成活率(％)＝外植体成活苗数
×
100/移栽炼苗总数
116.1.2.9数据统计与分析
117.使用microsoft excel 2019进行数据统计及整理；ibm spss statistics 25软件进行数据分析，主要使用单因素方差分析和duncan多重比较分析；sigmaplot12.5软件绘图。
118.2结果与分析
119.不同时间对休眠芽形态大小的影响
120.从3月到4月，每隔一周左右对色木槭休眠芽形态大小进行测量，结果如表2所示：
121.在不同的时间里，色木槭休眠芽的长度、宽度和重量均差异显著(p《0.05)。3月分的休眠芽长度显著小于4月份，在4月18日采集的休眠芽长度最长，为6.37mm，比休眠芽长度最短的3.10日高出65.88％。3月26日的芽宽度最宽为2.87mm，高于休眠芽宽度最短的3.10日为23.70％。3月份各时间休眠芽重量差异不显著，4月18日与4月份其他时间休眠芽重量差异显著(p《0.05)，4月2日休眠芽重量最重为27.95mg，高于重量最轻的3.10日为109.21％，且4月2日休眠芽重量与三月份的休眠芽重量有显著化差异。
122.表2不同时间对休眠芽形态大小的影响
[0123][0124][0125]
注：不同小写字母表示不同时间的长度、宽度和重量差异显著(p《0.05)
[0126]
从总体上来看，休眠芽长度随着时间增长逐渐变长；芽宽度在3月份先逐渐变大，到4月份逐渐变小；休眠芽重量先逐渐变重，在4月2日后逐渐变轻。产生此种结果的原因可能是因为在3月份环境比较冷，休眠芽不能萌发，一直在积累营养物质，所以长度、宽度和重量逐渐增加；自4.2日起，环境变暖，休眠芽准备萌发，消耗营养物质，长度变长，宽度和重量变小。4月18日以后，休眠芽萌发，色木槭生长季开始。综上所述，4月初休眠芽形态最饱满，在此时间采集休眠芽枝条进行试验。
[0127]
2.2不同消毒方法对外植体生长状况的影响
[0128]
消毒剂类型和消毒时间不同，对外植体消毒效果也不同，消毒方法对外植体生长状况的影响，其结果如图1所示：
[0129]
2％次氯酸钠溶液对色木槭外植体的消毒效果要好于0.1％氯化汞溶液的，其污染率、死亡率都比氯化汞溶液处理的要低很多。当用2％次氯酸钠消毒15min时，存活率最高为50％，污染率为17.85％，污染率和褐化率均处于较低水平。在两种不同的消毒剂的处理中，污染率均随着消毒时间的增加而逐渐降低；从存活率来看，次氯酸钠溶液的消毒效果要明显优于氯化汞溶液，存活率呈现先高后低的趋势，在15min时达到最大；氯化汞溶液则呈现一直增大的趋势，在8min后达到峰值，但仍然比次氯酸钠溶液处理15min的存活率要低。
[0130]
结果表明，在用0.1％氯化汞溶液消毒时，随着消毒时间的增加，其污染率和死亡率均逐渐降低，存活率逐渐增加，说明本实验筛选的消毒时间还没有到最佳消毒时间，消毒时间还可以继续增加，消毒效果可能会更好；在用2％次氯酸钠溶液消毒时，随着消毒时间的增加，污染率逐渐降低，但褐化率逐渐升高，说明对外植体的毒害效果会增加，而时间过短，会使外植体消毒不彻底，造成污染率过高，所以本实施例选择6号处理，即2％次氯酸钠溶液消毒15min作为色木槭带芽茎段最佳消毒方法。
[0131]
2.3不同外源激素处理对外植体伸长培养的影响
[0132]
2.3.16-ba浓度对外植体伸长培养的影响
[0133]
将消毒后的带芽茎段接种到含有不同浓度6-ba的ms培养基上，21d后观察统计外植体的生长情况，其结果如表3所示：
[0134]
通过试验观察可知，在7d内，外植体在含有不同浓度6-ba的培养基上均有不同程度的愈伤产生，且腋芽逐渐开始萌发(图2)。外植体的腋芽萌发率及出愈率随着6-ba浓度的增加而逐渐升高，当6-ba的浓度达到0.5mg/l时，萌发率最大为47.83％，出愈率也达到最大为100％，且此处理下的嫩茎平均高度与其他处理之间差异不显著。此时茎段生长状况为腋芽萌发产生丛生苗，嫩叶深绿且小，数量多，茎段基部膨大产生致密愈伤；ck的萌发率和出愈率最低，分别为30.77％和10％。嫩茎平均高度随着6-ba浓度增加呈现出先增后减的趋势，在6-ba浓度达到0.1mg/l时，嫩茎平均高度最高为7.52mm，此时茎段腋芽萌发丛生苗，叶片绿色舒展，长势好，基部产生少量绿色致密愈伤；ck的嫩茎平均高度最短为2.77mm。
[0135]
结果表明，低浓度的6-ba促进嫩茎生长，高浓度的6-ba抑制生长。若需要高萌发率及出愈率，选择含有0.5mg/l 6-ba的ms培养基；若需要茎段长势好，选择含有0.1mg/l 6-ba的ms培养基。
[0136]
表3 6-ba对色木槭嫩茎生长状况的影响
[0137][0138]
注：不同小写字母表示不同处理的嫩茎平均高度差异显著(p《0.05)
[0139]
2.3.2 naa浓度对外植体伸长培养的影响
[0140]
将消毒后的带芽茎段接种到含有不同浓度naa的ms培养基上，21d后观察统计外植体的生长情况，其结果如表4所示：
[0141]
不同浓度的naa对腋芽的萌发率及出愈率有很大的影响，随着激素浓度的增加，茎段的萌发率逐渐增大；出愈率明显升高，愈伤组织由基部略膨大到产生致密绿色愈伤；嫩茎平均高度也显著增加，外植体长势也受到很大影响(图3)。
[0142]
当naa浓度为0.5mg/l时，萌发率最高为30.77％，出愈率和嫩茎平均高度均为最高，分别为70％、12.75mm，此时茎段基部长大量颗粒状愈伤，部分愈伤脱分化成根。
[0143]
茎段生长状况与激素浓度变化有关，高浓度比低浓度长势要好，说明高浓度naa促进色木槭腋芽萌发和生长。
[0144]
表4 naa对色木槭嫩茎生长状况的影响
[0145][0146]
注：不同小写字母表示不同处理的嫩茎平均高度差异显著(p《0.05)
[0147]
2.3.3 naa和6-ba组合对外植体伸长培养的影响
[0148]
将带芽茎段接入含有不同浓度naa和6-ba的ms培养基中观察其生长状况，结果如表5所示：
[0149]
21d后可以观察到外植体萌发和生长状况各有不同，随着激素浓度不断升高，外植体产生的愈伤组织生长速度快且生长量大，但愈伤组织褐化速度也变快(图4)。当6-ba浓度为0.5mg/l时，随着naa浓度的增加，茎段出愈率逐渐增加，且当naa浓度为0.1mg/l时，腋芽萌发率为19.05％，但是出愈率时所有处理中最小的，为82.14％。
[0150]
表5 naa和6-ba组合对色木槭嫩茎生长状况的影响
[0151][0152][0153]
对不同浓度的naa和6-ba组合处理进行主体间效应检验，表现了外源激素naa和6-ba对外植体萌发率的影响结果，结果如表6所示：
[0154]
naa对外植体萌发率有极显著影响(p《0.01)，而6-ba对外植体萌发率无显著影响，说明naa对萌发率的影响较大，是影响萌发率的主要因素。再结合表4综合分析，外源激素naa促进带芽茎段的萌发，且影响极大。综上所述，若需要萌发率高，选择培养基：ms+0.5mg/l 6-ba；若需要嫩茎高度最高，选择培养基：ms+0.5mg/l naa；根据出愈率大小及生长状态好坏分析，若需要大量愈伤，选择培养基：ms+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/l naa。
[0155]
表6主体间效应检验
[0156]
因变量:萌发率iii类平方和自由度均方f显著性修正模型4079.501a6679.9178.176.003截距3461.26313461.26341.623.000ba316.7763105.5921.270.342naa3762.72531254.24215.083.001误差784.416983.157————总计8288.18116——————修正后总计4827.91715——————
[0157]
a.r方＝.792(调整后r方＝.653)
[0158]
2.4不同复幼措施处理对外植体生长状况的影响
[0159]
采集不同复幼措施处理的幼嫩枝条，以其带芽茎段为外植体接入最优伸长培养基中进行培养，观察其生长状况，结果如图5所示：
[0160]
0.5m截干处理的外植体存活率和萌发率都是最高的，分别为83.33％和75％；其次为1.0m截干处理，分别为75％和62.5％。从截干处理来看，随着截干高度的升高，产生的外
植体组培存活率和萌发率逐渐降低，组织培养效果越来越差。原因可能是截干高度距离基部越近，基部萌蘖枝条内部越幼态，促使植物细胞幼化程度加深，分化潜力提高，组培效果越好。复幼处理对外植体组培效果的影响大小排序为：0.5m截干＞1.0m截干＞环剥＞1.5m截干＞喷施外源激素6-ba＞ck，所以综合分析，选择在0.5m处进行截干处理的色木槭植株基部萌蘖的当年生枝条的带芽茎段为外植体，组培效果最好。
[0161]
2.5不同外源激素处理对外植体诱导分化的影响
[0162]
将不同类型的外植体接入到含有不同浓度的6-ba和naa的ms培养基中，21d后对外植体进行统计观察。其结果如表7所示：
[0163]
以添加不同浓度6-ba和naa的ms培养基为基本培养基，以不同器官为外植体进行正交试验，采用l_9(3^3)正交表设计试验，得到不同处理的外植体出愈率和分化率，进行极差分析。
[0164]
比较各水平均值k1、k2、k3发现，外植体类型、6-ba浓度和naa浓度三个因素的最佳水平组合为ⅰ3+ⅱ2+ⅲ3，即6-ba的浓度为2.0mg/l，naa浓度为0.05mg/l，外植体类型为茎段的处理效果最佳。但是该组合并没有出现在9个处理中，可以体现正交试验的全面性和科学性，可以不用将所有组合全部列出，只需要对部分组合进行试验就可以。在进行试验的9个处理中，7号处理的试验效果最好，诱导率很高，分化率也不低。愈伤组织呈深绿色，不致密，分化出的芽长势也很好(图6)。
[0165]
极差r反映各因素对试验统计指标的影响大小，与其成正相关关系。极差排序大小为：rⅰ＞rⅱ＞rⅲ，即各因素对试验指标影响力大小的排序为：外植体类型＞6-ba浓度＞naa浓度，说明外植体为该试验的主要影响因子，在外源激素的选择中，6-ba相较于naa更具有决定性作用。对试验结果进行方差分析，三种因素的f值排序分别为fⅰ＞fⅱ＞fⅲ，与极差r值的排序结果一致。
[0166]
表7naa和6-ba组合对外植体诱导分化的影响
[0167]
[0168][0169]
2.6不同外源激素处理对外植体增殖培养的影响
[0170]
嫩茎接种21d后长出新的嫩茎，将嫩茎切去基部接入含有不同浓度的6-ba和naa的ms培养基中进行增殖培养，21d后统计各处理的增殖率和增殖系数，结果如表8所示：
[0171]
处理6的增殖效果最好，即ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/l naa，增殖率和增殖系数都是最高的，分别为66.65％、4；其次是处理3，增殖率和增殖系数分别为61.51％、3。
[0172]
表8不同外源激素处理对外植体增殖培养的影响
[0173][0174][0175]
注：不同小写字母表示不同处理的增殖系数差异显著(p《0.05)
[0176]
对两种激素进行主体间效应检验，结果如表9所示，不同浓度的6-ba和naa对嫩茎增殖率的影响差异都极显著(p＜0.01)，这是因为naa能促进植物生长，促进腋芽萌发；6-ba促进细胞分裂，促进茎和叶的生长。两种生长调节剂搭配使用有一定的协同作用，间接促进嫩茎生长(图7)。
[0177]
表9主体间效应检验
[0178][0179]
b.r方＝.947(调整后r方＝.867)
[0180]
比较方差大小可知，6-ba处理对外植体增殖率的影响大于naa处理，随着6-ba浓度的增加，增殖率逐渐升高，增殖系数叶逐渐变大。当6-ba浓度为2.5mg/l时，增殖率和增殖系数最高，分别为64.08％、3.5。naa对外植体增殖也有极显著影响(p＜0.01)，随着naa浓度增加，增殖率和增殖系数也逐渐变大。综合以上结果可知，带芽茎段最优增殖培养基：ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/l naa。
[0181]
不同外源激素处理对外植体生根培养的影响
[0182]
取健壮的芽苗，切割成2～3cm带芽茎段，接种到不同的生根培养基上进行生根培养，其结果如表10所示：21d后对试验结果进行观察分析发现，6种处理的芽苗生根方式均为愈伤生根，愈伤组织随着naa浓度增加，组织量逐渐变大。处理6即1/2ms+0.5mg/l naa的生根效果最好(图8)，产生的根基部泛红，根数量较小，长度比较短，少量根粗，白，嫩，且只生成一级根，不产生二级根；生根率最高为37.5％，平均生根数也比较多，有2.45个，平均根长最长为1.67cm。处理1即ms+0.1mg/l naa生根效果最差，生根率只有2.7％，生根数和根长也最低，分别为0.33个和0.5cm，因此，选择1/2ms作为生根培养的基本培养基。
[0183]
表10不同外源激素处理对外植体生根培养的影响
[0184][0185]
注：不同小写字母表示不同处理的生根数和根长差异显著(p《0.05)
[0186]
结果如表11所示，基本培养基种类和naa浓度对色木槭嫩茎生根影响显著，培养基种类对生根效果的影响大于naa浓度。当naa浓度为0.2mg/l时，生根数最多为2.83个；平均根长最长为1.67cm。综合以上结果，最优生根培养基：1/2ms+0.5mg/l naa。
[0187]
表11主体间效应检验
[0188][0189][0190]
2.8炼苗移栽培养
[0191]
生根培养30d后，将株高4cm以上根系发达、叶片展开的健壮幼苗在培养室内敞口
炼苗3～5d，逐天增加光照至全光照，一般需4d～5d。炼苗结束后取出小苗，用清水洗净苗基部及根部培养基，移植到草炭∶蛭石＝1∶1(体积比)的营养基质上，浇透水并用塑料薄膜，遮阴7d～10d(视天气情况定)，并保持空气湿度。定时用喷雾器喷洒。移栽15d后成活率为66.67％。
[0192]
而由不定芽器官发生途径产生的不定芽无法长成健壮的幼苗，所以无法移栽驯化。
[0193]
由以上实施例可以得出：
[0194]
(1)4月初休眠芽长度、宽度数值较大，重量最重，形态最饱满，在此时间采集休眠芽枝条进行试验效果最好。
[0195]
(2)选择色木槭带休眠芽茎段为外植体进行离体快繁，2％次氯酸钠溶液消毒15min消毒效果最好，存活率最高，污染率和褐化率相对较低，是色木槭带休眠芽芽茎段最佳消毒方法。
[0196]
(3)在茎段的启动培养阶段，若需要萌发率高，选择培养基：ms+0.5mg/l6-ba；需要嫩茎高度最高，选择培养基：ms+0.5mg/l naa；根据出愈率大小及生长状态好坏，若需要大量愈伤，选择培养基：ms+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/lnaa。
[0197]
(4)采集不同复幼措施处理的色木槭萌蘖枝条的带芽茎段为外植体进行组培，结果表明在0.5m处截干处理的色木槭植株产生的萌蘖枝条组培效果最好。
[0198]
(5)以茎段为外植体，最佳芽诱导培养基激素配方为6-ba的浓度为1.5mg/l，naa浓度为0.05mg/l。通过极差分析和方差分析发现，各因素对试验指标影响力大小的排序为：外植体类型＞6-ba浓度＞naa浓度。
[0199]
(6)6-ba处理对外植体增殖率的影响大于naa处理；最佳增殖培养基：ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/l naa，其增殖率和增殖系数都是最高的，分别为66.65％、4；
[0200]
(7)选择1/2ms作为生根培养的基本培养基，效果最好。1/2ms+0.5mg/l naa为最佳生根培养基。
[0201]
(8)对生根苗进行炼苗移栽，移栽成活率为66.67％，由不定芽器官发生途径产生的不定芽无法长成健壮的幼苗，所以无法移栽驯化。
[0202]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将带色木槭腋芽茎段依次清洗、乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒，得到消毒外植体；所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量百分含量为2％；2)将所述步骤1)得到的消毒外植体进行芽伸长培养，得到芽伸长培养物；所述芽伸长培养使用的培养基包括：ms+6-ba和/或naa；所述6-ba的含量为0.1～0.5mg/l，所述naa的含量为0.1～0.5mg/l；3)将所述步骤2)得到的芽伸长培养物处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行定芽诱导分化培养，得到嫩茎；所述定芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l6-ba+0.01～0.05mg/lnaa；4)将所述步骤3)得到的嫩茎进行增殖培养，得到茎丛；所述增殖培养使用的培养基包括：ms+1.5～2.5mg/l6-ba+0.02～0.05mg/lnaa；5)将所述步骤4)得到的茎丛处理成微枝，将所述微枝进行生根培养，得到色木槭幼苗；所述生根培养使用的培养基包括：1/2ms+0.5mg/lnaa。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)带色木槭腋芽茎段的获取方法包括：将成年色木槭母树的当年生幼嫩枝条或休眠枝条处理成2～3cm段，每段上带有1个腋芽。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述休眠枝条的获取时间为当年4月初；所述当年生幼嫩枝条的获取方法包括：将所述成年色木槭母树在当年经过复幼处理；所述复幼处理包括：距地上0.5m处进行截干，截干的次数为1～2次，间隔时间为60d。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)次氯酸钠溶液消毒的时间为10～20min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)6-ba的含量为0.5mg/l，所述naa的含量为0.5mg/l；所述伸长培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)所述芽诱导分化培养使用的培养基包括：ms+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa；所述芽诱导分化培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)增殖培养使用的培养基包括：ms+2.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa；所述增殖培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)生根培养的条件包括：温度为25℃，光照为16h/d，光照强度为40μmol
·
m-2
·
s-1
，相对湿度为60％。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，得到色木槭幼苗后还包括炼苗和移栽。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述移栽使用的基质包括草炭和蛭石，所
述草炭和蛭石的体积比为1:1。

技术总结
本发明提供了一种利用色木槭腋芽离体快繁的方法，属于组织培养技术领域。包括：将带色木槭腋芽茎段依次清洗、乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒，得到消毒外植体；将消毒外植体进行芽伸长培养，得到芽伸长培养物；将伸长培养物处理成带芽茎段，将所述带芽茎段进行芽诱导分化培养，得到嫩茎；将嫩茎进行增殖培养，得到茎丛；将茎丛处理成微枝，将所述微枝进行生根培养，得到色木槭幼苗。采用本发明提供的方法移栽组培苗后，成活率达到66％以上。成活率达到66％以上。成活率达到66％以上。


技术研发人员：杨玲 李茹月 周鑫鑫 沈海龙
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/14