一种贝莱斯芽孢杆菌SCUEC9菌株及其应用

一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株及其应用。


背景技术：

2.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)是一类在自然界水体、土壤、空气中广泛分布的芽孢杆菌，可分泌蛋白酶、纤维素酶等多种活性成分，在动物病害防控、动物饲料、食品加工应用、水产养殖等方面发挥重要作用。如贝莱斯芽孢杆菌具有显著的角蛋白溶解活性、蛋白酶水解活性和纤维素酶活性，在工业生产上具有应用潜力；贝莱斯芽孢杆菌还可成功定殖至植物根际、体表或体内，有效帮助植物抵御病原微生物的侵染，达到生防的目的，用于农作物的病虫害防治。
3.玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)是一种间苯环酸内酯的非甾体雌激素真菌毒素，通过聚酮化物途径由多种镰刀菌属(fusarium)真菌生物合成，如禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、黄色镰刀菌(fusarium culmorum)、半裸镰刀菌(fusarium semitectum)和克鲁克威尔镰刀菌(fusarium crookwellense)。玉米赤霉烯酮的摄入会引起多种毒性作用，包括生殖毒性、肝毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。目前已知部分贝莱斯芽孢杆菌具有生物转化玉米赤霉烯酮的功能，然而仍存在降解时间长、降解率低等问题，不利于生产应用的缺陷。
4.地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。该细菌可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病，且能分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分，刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力。然而，目前也未见过贝莱斯芽孢杆菌能促进地衣芽孢杆菌生长的相关报道。
5.哮喘是由多种炎性细胞参与的慢性气道炎症，其发作时会引起乙酰胆碱(ach)的大量释放，诱导气管平滑肌细胞膜上的钙离子通道开发，引起ca
2+
内流、气管收缩和气管腔缩窄，造成呼吸困难。目前常用的激素类药物会产生炎症的耐药性，因此开发新的可舒张气管的药物具有重要意义。而目前对于贝莱斯芽孢杆菌在舒张气管环中的应用还未见相关研究报道。


技术实现要素：

6.本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株及其应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
7.为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌
scuec9菌株于2023年05月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 2023730。
9.第二方面，本发明公开了一种菌剂，所述菌剂包括：将如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株进行发酵获得的发酵菌液，或将所述发酵菌液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
10.第三方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在生物转化玉米赤霉烯酮中的应用。
11.优选的，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株将玉米赤霉烯酮生物转化为磷酸化玉米赤霉烯酮；其中，磷酸化玉米赤霉烯酮细胞毒性和雌激素活性均极显著低于玉米赤霉烯酮。
12.第四方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在抑制病原菌中的应用。
13.优选的，所述病原菌包括：灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌。
14.第五方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在农作物病害防治中的应用。
15.第六方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在促进地衣芽孢杆菌生长中的作用。
16.第七方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在饲料或食品脱毒中的应用。
17.进一步的，将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的干粉菌剂和/或发酵菌液接种至饲料中，然后接种地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌，控制含水量为50％，密封包装。
18.第八方面，本发明公开了一种如第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在制备舒张气管环药物中的应用。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
20.1、本发明贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株具有高效的生物转化玉米赤霉烯酮的能力，培养时间为12h时，玉米赤霉烯酮转化效率达到95％以上，生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)细胞毒性和雌激素活性均极显著低于玉米赤霉烯酮(zen)；可应用于玉米赤霉烯酮生物转化，或者应用于饲料或食品工业领域中；
21.2、本发明的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株生长能力强，对较高浓度nacl具有较高的耐受性，在nacl浓度达到5％时，scuec9菌株仍然可以生长，od
600
为3.186，在nacl浓度达到7.0-8.0％，scuec9菌株生长受到抑制，但仍然有生长，od
600
为0.226-0.234；因此可应用高nacl浓度的发酵scuec9菌株，减少发酵过程中杂菌污染，降低发酵成本，此外，也可以将该菌株发展成为发酵工业的底盘菌株，降低无菌要求，减少发酵成本；
22.3、本发明贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对多种病原菌都具有抑制作用，可抑制灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌在内的多种植物病原菌，因此可用于农作物的病害防治；
23.4、本发明的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株具有促进地衣芽孢杆菌生长的特性，利用该特性可将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株应用于添加地衣芽孢杆菌的养殖水体中，以增加水体中地衣芽孢杆菌的含量；
24.5、本发明还发现所述贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的发酵液对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环具有舒张作用，舒张比率达到44.87％，因此可将其制备成舒张气管环的药物，用于治疗或缓解哮喘等疾病。
附图说明
25.图1为不同培养时间贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株玉米赤霉烯酮(zen)转化率图；
26.图2为贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株转化玉米赤霉烯酮(zen)的高效液相色谱图；图中，a：10μg/ml zen标准品；b：scuec9菌株在含10μg/ml zen培养基中培养0h；
27.c：scuec9菌株在含10μg/ml zen培养基中培养12h；
28.图3为贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)的生物转化产物质谱图；图中，a：zen质荷比分析；b：zen生物转化产物质荷比分析；c：zen生物转化产物二级质谱图；
29.图4为不同浓度的玉米赤霉烯酮(zen)和磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对hek 293t细胞活力的影响图；“##”表示单独zen处理组与阴性对照组相比差异极其显著，p《0.01；
[0030]“a”表示单独zean-p处理组与阴性对照组相比差异显著，p《0.05；“**”表示相同浓度时，zen处理组与zen-p处理组相比差异极其显著，p《0.01；
[0031]
图5为不同浓度的玉米赤霉烯酮(zen)和磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对ipec-j2细胞活力的影响图；“##”表示单独zen处理组与阴性对照组相比差异极其显著，p《0.01；“a”表示单独zean-p处理组与阴性对照组相比差异显著，p《0.05；“**”表示相同浓度时，zen处理组与zen-p处理组相比差异极其显著，p《0.01；
[0032]
图6为不同浓度的玉米赤霉烯酮(zen)和磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对mcf-7细胞活力的影响图；“##”表示单独zen处理组与阴性对照组相比差异极其显著，p《0.01；“a”表示单独zean-p处理组与阴性对照组相比差异显著，p《0.05；“**”表示相同浓度时，zen处理组与zen-p处理组相比差异极其显著，p《0.01。
具体实施方式
[0033]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
实施例1贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的定向富集分离和鉴定
[0035]
1、scuec9菌株的定向富集分离
[0036]
取被霉菌污染严重的玉米粉10g，加入90ml ph5.0含50μg/ml制霉菌素的zen液体培养基(zenb)，37℃富集培养12小时，用无菌水10倍梯度逐级稀释(10-1
～10-5
)，取200μl稀释液均匀涂布于zen固体培养基(zena)平板中，37℃培养24h，挑取菌落，再多次划线分离纯化，获得22株微生物。
[0037]
以10μg/ml玉米赤霉烯酮(zen)为唯一碳源的mm培养基对22株微生物进行测定，于30℃，180r/min摇床中培养48h后，利用hplc检测玉米赤霉烯酮(zen)剩余含量，确定菌株转化玉米赤霉烯酮(zen)的能力。11株微生物具有转化玉米赤霉烯酮(zen)能力，其中4株菌株具有较高的玉米赤霉烯酮(zen)转化能力，转化效率都在70％以上，其中1株的玉米赤霉烯
酮(zen)转化率最高达到100％，命名为scuec9菌株。
[0038]
zen液体培养基(zenb)：蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.3g，氯化钠5g，加蒸馏水定容至1l，ph 7.0-7.3。
[0039]
zen固体培养基(zena)：蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.3g，氯化钠5g，琼脂18g，加蒸馏水定容至1l，ph 7.0-7.3。
[0040]
无机盐液体基础培养基(mm)：na2hpo41.6 g，kh2po41.0 g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，cacl
2 0.0215g，nano
3 0.5g，加蒸馏水定容至1l，ph 7.0。
[0041]
2、scuec9菌株的鉴定
[0042]
将所述scuec9菌株进行常规革兰氏染色，结果呈阳性，即为革兰氏阳性菌。其在zen固体培养基(zena)平板上菌落呈黄白色、圆形、边缘不规则、易挑起、无色素产生。
[0043]
采用常规的吲哚试验、硫化氢试验、甲基红试验、伏-普试验、柠檬酸盐利用试验对scuec9菌株的生理生化特性进行鉴定，结果如表1所示。scuec9菌株的吲哚试验、硫化氢试验和甲基红试验结果呈阴性，伏-普试验和柠檬酸盐利用试验结果均呈阳性。
[0044]
表1scuec9菌株生理生化特性
[0045][0046]
对scuec9菌株的16srdna进行克隆和测序，其16s rdna序列如序列表seq id no：1所示。序列比对分析表明，scuec9菌株的16s rdna与贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)相似性最高，结合形态和生理生化特性，初步鉴定scuec9菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
[0047]
所述贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株(bacillus velezensis scuec9)已于2023年05月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc m2023730。
[0048]
实施例2贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)的生物转化特性与生物转化产物鉴定
[0049]
将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株按体积比1％接种量添加到10μg/ml zen的无机盐液体基础培养基(mm)中，37℃振荡培养，按照不同培养时间(0、1、2、4、6、8、12、18、24h)取样，通过hplc对该菌株zen生物转化能力进行了为期24h的测定。由图1可以看出，zen的转化效率在最初的2h内上升迅速，在培养时间为8h时，zen转化效率可升至80％以上；当培养时间延长到12h时，zen转化效率达到95％以上(如图2所示)。通过lc-ms/ms对生物转化产物进行分析，结果如图3所示，(a)根据负离子esi-ms，zen实际测得m/z＝317.1402，高分辨率质谱仪计算的c18h22o5[m-h]-为317.1389；(b)测定的zen生物转化产物分子量m/z＝397.1075；(c)分析该产物的二级质谱也显示了具有相应分子量的磷酸基团特定峰m/z＝
78.9597，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)生物转化产物为磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)。即所述scuec9菌株具有高效的zen转化活性，因此可应用于zen生物转化，或者应用于饲料或食品工业领域中。
[0050]
实施例3贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株生物转化玉米赤霉烯酮产物的细胞毒性
[0051]
(1)细胞的培养
[0052]
将人胚肾细胞(hek 293t)、猪肠上皮细胞(ipec-j2)和人乳腺癌细胞(mcf-7)从-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴锅中融化，轻轻摇晃1min，800r/min离心10min，收集细胞沉淀，加入4ml dmem完全培养基，放入37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每天进行一次换液，当细胞密度达到80％以上，用胰蛋白酶消化传代。
[0053]
(2)细胞活力的测定
[0054]
人胚肾细胞(hek 293t)、猪肠上皮细胞(ipec-j2)和人乳腺癌细胞(mcf-7)密度长到80％左右时，通过胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度。取细胞悬液100μl接种于96孔板中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，弃去96孔板中的培养基，并用pbs将孔中的细胞洗3次，加入100μl处理好的含不同浓度样品的完全培养基，每组设置4个复孔。继续培养48h，弃上清液，加入100μl培养基后，再加入10μl cck-8溶液，继续培养1.5h，利用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光度值，计算细胞活力。
[0055]
细胞活力(％)＝[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]
×
100％。
[0056]
将scuec9菌株按1％的接种量接种到终浓度分别为0μm、3μm、15μm、30μm、50μm、75μm、150μm、300μm玉米赤霉烯酮(zen)的mm培养基中，在30℃，180r/min摇床恒温培养，通过hplc检测培养液中zen剩余含量，zen的峰面积减少到0mau
·
s，测定zen生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)的细胞毒性和雌激素活性。
[0057]
(3)玉米赤霉烯酮生物转化产物对hek 293t细胞活力的影响
[0058]
不同浓度玉米赤霉烯酮(zen)及生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对人胚肾细胞(hek 293t)的细胞活力影响如图4所示，在3～300μm zen处理组中，与0μm zen处理组相比，hek 293t细胞活力均有显著性差异(p《0.01)。在3～75μm zen-p处理组中，与0μm zen-p处理组相比，hek 293t细胞活力无显著性差异，在150～300μm zen-p处理组中，与0μm zen-p处理组相比，hek 293t细胞活力略有影响(p《0.05)。在3～300μmzen-p处理组，与3～300μm zen处理组相比，hek 293t细胞活力均显著升高(p《0.01)。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)在3～75μm浓度下对hek 293t细胞无细胞毒性，但在150～300μm浓度下对其有较低的细胞毒性，且在3～300μm浓度下zen-p的细胞毒性均极显著低于zen。
[0059]
(4)玉米赤霉烯酮生物转化产物对ipec-j2细胞活力的影响
[0060]
不同浓度玉米赤霉烯酮(zen)及生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对猪肠上皮细胞(ipec-j2)细胞活力的影响如图5所示，在3～300μm zen处理组中，与0μm zen处理组相比，ipec-j2细胞活力均有显著性差异(p《0.01)。在3～50μm zen-p处理组中，与0μm zen-p处理组相比，ipec-j2细胞活力无显著性差异，在75～300μm zen-p处理组中，与0μm zen-p处理组相比，ipec-j2细胞活力略有影响(p《0.05)。在3～300μm zen-p处理组，与3～300μm zen处理组相比，ipec-j2细胞活力均显著升高(p《0.01)。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)在3～50μm浓
度下对ipec-j2细胞无细胞毒性，但在75～300μm浓度下对其有较低的细胞毒性，且在3～300μm浓度下zen-p的细胞毒性均极显著低于zen。
[0061]
(5)玉米赤霉烯酮生物转化产物对mcf-7细胞活力的影响
[0062]
不同浓度玉米赤霉烯酮(zen)及生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)对人乳腺癌(mcf-7)细胞活力的影响如图6所示，在3～300μm zen处理组中，与0μm zen处理组相比，mcf-7细胞活力均显著提升(p《0.01)。在3～75μm zen-p处理组中，与0μm zen-p处理组相比，mcf-7细胞活力无显著性差异，在150～300μm zen-p处理组中，与0μmzen-p处理组相比，mcf-7细胞活力略有影响(p《0.05)。在3～300μm zen-p处理组，与3～300μm zen处理组相比，mcf-7细胞活力均显著降低(p《0.01)。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)在3～75μm浓度下对mcf-7细胞无雌激素活性，但在150～300μm浓度下对其有较低的雌激素活性，且在3～300μm浓度下zen-p的雌激素活性均极显著低于zen。
[0063]
综上所述，用人胚肾细胞(hek 293t)、猪肠上皮细胞(ipec-j2)和人乳腺癌细胞(mcf-7)，通过cck-8法测定玉米赤霉烯酮(zen)及生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)的细胞毒性和雌激素活性。贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的玉米赤霉烯酮(zen)生物转化产物磷酸化玉米赤霉烯酮(zen-p)在3～75μm浓度下对hek 293t细胞无细胞毒性，在150～300μm浓度下对其有较低的细胞毒性。在3～50μm浓度下对ipec-j2细胞无细胞毒性，在75～300μm浓度下对其有较低的细胞毒性。在3～75μm浓度下对mcf-7细胞无雌激素活性，在150～300μm浓度下对其有较低的雌激素活性。且在3～300μm浓度下zen-p的细胞毒性和雌激素活性均极显著低于zen。
[0064]
实施例4贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对nacl的耐受特性
[0065]
在zenb培养基中加入一定比例的nacl，浓度分别为0.0％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、8.0％，按体积比1.0％将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株和贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株分别接种到上述培养基中，37℃培养12h，测定od
600
，结果如表2所示，nacl浓度为0.0-5.0％时，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株od
600
由初始的0.02增加到3.186-3.691之间，nacl浓度增加到7.0-8.0％，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株生长受到抑制，但仍然有生长，od
600
为0.226-0.234；而贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株在nacl浓度为0.0-3.0％时，od
600
由初始的0.02增加到2..225-2.471之间，nacl浓度增加到5.0-8.0％，贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株生长受到抑制，od
600
为0.022-0.264。
[0066]
表2不同浓度nacl对贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株生长的影响
[0067][0068]
由表2结果可知，本发明的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株生长能力强，对较高浓度nacl具有较高的耐受性，在nacl浓度达到5％时，scuec9菌株可以生长，od
600
为3.186；在nacl浓度达到7.0-8.0％，scuec9菌株生长受到抑制，但仍然有生长，od
600
为0.226-0.234；而贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株的生长能力较弱，对nacl耐受性较差。即可以利用scuec9菌株对nacl的耐受特性，在高nacl浓度的条件下发酵贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株，减少发酵过程中杂菌污染，降低发酵成本。此外，也可以将该菌株发展成为发酵工业的底盘菌株，降低无菌要求，减少发酵成本。
[0069]
实施例5贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的病原菌抑制活性
[0070]
以灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌为指示菌，研究贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对不同植物病原菌的抑菌活性。
[0071]
贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株接种zenb培养基上，37℃培养12h，得到培养液，然后将培养液8000r/min离心10min，取5μl培养物的上清液进行抑菌实验，并测定抑菌圈的直径，并以常规的贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株作为对照，测定结果如表3所示：贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株上清液对灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌抑菌圈直径分别为：28.3、24.1、15.2、18.3、24.1和13.3mm。而常规的贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株仅对灰霉病菌具有抑菌效果，其对灰霉病菌抑菌圈直径10.8mm，，而对其他植物病原菌则不具有抑制效果。因此本发明筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株相比于常规的贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株，对灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌的抑制效果显著，可广泛应用于多种不同的农作物病害防治。
[0072]
表3贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株和nf002菌株培养物上清液的抑菌效果
[0073][0074]
注：牛津杯的外径为8mm
[0075]
实施例6贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对地衣芽孢杆菌生长的促进作用
[0076]
向50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种地衣芽孢杆菌，并添加不同体积的培养12h的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液和zenb液体培养基，使添加总体积为2500μl，同时，以添加不同体积的培养12h的贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株培养物上清液和zenb液体培养基，使添加总体积为2500μl，作为对照，于28℃条件下培养12h，测定菌液的od
600
值用作地衣芽孢杆菌的生长量，结果如表4所示，与不添加贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液相比，添加贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株培养物上清液，地衣芽孢杆菌od
600
呈现下降趋势，由1.467下降至1.307。而添加贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液中的地衣芽孢杆菌生长明显加快。在50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，添加250μl贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液，地衣芽孢杆菌的生长速度是未添加的1.3倍，而添加2500μl贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液，地衣芽孢杆菌生长速度是未添加的1.7倍，表明贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株具有促进地衣芽孢杆菌生长的特性，利用该特性可将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株应用于添加地衣芽孢杆菌的养殖水体中，以增加养殖水体中的地衣芽孢杆菌的含量。
[0077]
表4贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液对地衣芽孢杆菌生长的影响
[0078][0079]
实施例7贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在饲料脱毒中的应用
[0080]
1、贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的活化
[0081]
将斜面保存的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株活化，接种于zen固体培养基(zena)上，在30℃条件下恒温培养12h；挑取活化培养基上的菌种，接种于zen液体培养基(zenb)中，培养温度为30℃，培养24h，获得培养液。或进一步经喷雾干燥获得干粉菌剂，其喷雾干燥优选工艺条件为：玉米淀粉作为喷雾干燥的载体，进风温度160℃，物料浓度15％，进料速度20ml/min，使其含贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株活菌数在1
×
10
11
cfu/g～1
×
10
12
cfu/g。
[0082]
2、贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株用于饲料脱毒
[0083]
(1)贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株用于饲料脱毒的使用方法：以千分之一的接种量接种scuec9菌株菌液或菌粉(即一吨饲料加1公斤干粉菌剂或1升scuec9菌株培养液)，适量接种地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌，含水量在50％左右，用封口机密封包装。并以贝莱斯芽孢杆菌nf002替代scuec9菌株作为对照组，以不添加贝莱斯芽孢杆菌，只接种地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌的作为空白组。
[0084]
(2)饲料的脱毒效果检测：脱毒饲料在发酵期间，分别于0d，5d和10d取样测定饲料中贝莱斯芽孢杆菌数量(表5)、地衣芽孢杆菌活菌数(表6)以及脱毒饲料的营养成分和微生物数量(表7)。
[0085]
由表5可知，与对照组相比，添加scuec9菌株的发酵饲料在发酵10d时贝莱斯芽孢杆菌的数量为11.08log cfu/g，显著高于对照组的8.07log cfu/g，表明贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在脱毒饲料中生长速度快。
[0086]
表5不同时间的脱毒饲料中的贝莱斯芽孢杆菌数量变化
[0087][0088]
由表6可知，发酵4天，相比于不添加贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的空白组，添加贝莱斯芽孢杆菌nf002的对照组地衣芽孢杆菌数量显著下降，仅为6.36log cfu/g，而添加有贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的脱毒饲料中地衣芽孢杆菌数量显著增多，高达9.19log cfu/g，即在脱毒饲料中添加了贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株后，脱毒饲料中地衣芽孢杆菌的生长速率显著加快，从而可极大地提高脱毒饲料中地衣芽孢杆菌含量。
[0089]
表6脱毒饲料中贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对地衣芽孢杆菌的生长作用
[0090][0091]
由表7可知，相比于空白组，添加有贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的脱毒饲料中玉米赤霉烯酮含量由60.9μg/g下降到2.3μg/g，粗纤维含量由4.2％下降到3.2％，添加有贝莱斯芽孢杆菌nf002菌株的脱毒饲料中玉米赤霉烯酮含量没有变化，粗纤维含量由4.2％下降到3.5％，即在脱毒饲料发酵过程中，通过添加贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株，显著去除饲料中玉米赤霉烯酮含量。
[0092]
表7脱毒饲料营养成分和玉米赤霉烯酮检测结果
[0093][0094]
实施例8贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用
[0095]
1、预处理：取8～10周龄spf级balb/c小鼠15只，购于湖北省实验动物中心。静脉注射戊巴比妥钠150mg/kg处死小鼠，剪下气管，去除附着组织，剪成3～4mm长的气管环。将气管环套入张力换能器的三角形挂钩中，挂钩上端连接张力换能器，下端固定于氧气出口上方的挂钩上，浸泡于通氧的37℃的pss灌流槽中。将气管环前负荷设置为0.3g。每15min更换高钙液(pss)一次，共换液4次，完成预平衡。用100μmol/l乙酰胆碱(ach)对气管环进行预刺激，待张力达到平台期后，以pss洗脱起乙酰胆碱(ach)，等气管环张力达到基线，完成1次预刺激。预刺激3次后开始正式实验。
[0096]
2、实验过程：气管环经平衡和预刺激后，向灌流槽中加入100μmol/l乙酰胆碱(ach)，刺激气管环使其收缩达到最大值，并进入平台期，读取张力换能器显示的肌张力数值。然后分别加入100μl、200μl、300μl培养12h的有贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液和菌悬液，用于舒张气管环。待舒张作用达到稳定后，读取肌张力数值，并测定舒张比率，肌张力数值和舒张比率的统计结果如表8所示，贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的培养物上清液和菌悬液对气管环均具有一定的舒张作用，并且菌悬液的效果优于培养物上清液，其中300μl培养12h的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的菌悬液对于气管环的舒张效果最好，舒张比率达到了44.87％。因此该菌的菌悬液或培养物上清液可制备成舒张气管环的药物，用于治疗或缓解哮喘等疾病。
[0097]
表8贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株培养物上清液和菌悬液对乙酰胆碱(ach)预收缩的气管环的舒张作用
[0098][0099][0100]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株于2023年05月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 2023730。2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括：将如权利要求1中所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株进行发酵获得的发酵菌液，或将所述发酵菌液经喷雾干燥获得干粉菌剂。3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在生物转化玉米赤霉烯酮中的应用。4.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在抑制病原菌中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括：灰霉病菌、腐霉病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、桑轮纹病菌和禾谷镰刀菌。6.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在农作物病害防治中的应用。7.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在促进地衣芽孢杆菌生长中的作用。8.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在饲料或食品脱毒中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株的干粉菌剂和/或发酵菌液接种至饲料中，然后接种地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌，控制含水量为50％，密封包装。10.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株在制备舒张气管环药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌SCUEC9菌株及其应用，涉及微生物技术领域。所述SCUEC9菌株于2023年05月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2023730。本发明提供的SCUEC9菌株高效地将ZEN生物转化为ZEN-P，生物转化产物细胞毒性和雌激素活性均极显著低于ZEN；对较高浓度NaCl具有耐受性，在NaCl浓度达到5％时，SCUEC9菌株可以生长，在NaCl浓度达到7.0-8.0％，SCUEC9菌株生长受到抑制；SCUEC9菌株具有抗多种植物病原菌的能力，可用于农作物病害防治；同时，SCUEC9菌株还可促进地衣芽孢杆菌的生长，可以增加水体中地衣芽孢杆菌的含量；且本发明还发现了SCUEC9菌株对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环具有舒张作用，因此可制备成气管环舒张药物，用于哮喘等疾病的治疗。用于哮喘等疾病的治疗。用于哮喘等疾病的治疗。


技术研发人员：李晓华 王萌蕾 俸婷 郭晨雨 徐玉荣 姜媛媛
受保护的技术使用者：中南民族大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/14