穿膜环肽及其应用

1.本发明涉及一类穿膜环肽及其用途，属于药物化学技术领域。


背景技术：

2.结肠癌起源于正常的结肠上皮细胞病源性地转变为腺瘤息肉，进而转变为侵染性的肿瘤。早期的研究发现腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，apc)基因的突变不仅与家族性结肠腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis，fap)有着紧密的联系，而且在散发性结肠癌中也发挥着重要的作用。在超过85％的先天性结肠癌病人和80％的后天结肠癌病人中，apc基因都发生移码突变或缺失突变，表达截短型的apc蛋白。截短型的apc蛋白n端的arm结构域彻底暴露，不再发挥正常生理功能，却能够有效的结合apc刺激的鸟苷酸交换因子(apc-stimulated guanine nucleotide exchange factor，asef)。正常生理状态下asef处于自身抑制状态，被截短型的apc结合后，asef蛋白构象发生变化，自身抑制被释放造成鸟苷酸交换因子活性被激活，apc激活asef后，使得asef可以与cdc42结合，从而形成apc/asef/cdc42三元复合物，激活rho家族的gtpase-cdc42将gtp换为gdp，通过jnk通路上调基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，mmp9)，从而引发异常的细胞扁化、细胞膜皱褶化、假足产生，细胞间黏附力降低，促进细胞迁移和血管生成，形成息肉从而导致结肠癌细胞的增殖和侵袭。因此病理状态下的截短型apc蛋白/asef蛋白相互作用(“下文简称为apc/asef相互作用”)在结肠癌的发生发展中发挥着重要作用，阻断apc/asef相互作用是结肠癌治疗中的新靶标。
3.基于此，人们尝试寻找特异性的活性多肽能够阻断apc/asef相互作用，并且使这些多肽作为癌症治疗药物，以解决当前耐药性及有效治疗药物不足的现状。然而，多肽药物透膜性差、稳定性差等问题亟需解决。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是，提供一种穿膜环肽及其用途，通过将多肽药物进行环化修饰，提高其穿膜效率和体外血浆稳定性。
5.本发明的第一个目的在于提供一种穿膜环肽，所述穿膜环肽包含如式i所示的结构及其盐：
[0006][0007]
式i：
[0008]
其中r1是式ii、式iii及式iv中之一者所示的基团：
[0009]
式ii：-cor
a1
；
[0010]
式iii：-so2r
a1
；
[0011]
式iv：-co-r
a1ra2
；
[0012]
其中，r
a1
及r
a2
表示一氢原子、一任意取代的烃基团、一任意取代的杂环基团或一任意取代的苯环；
[0013]
r2是异丙基(isopropyl)、环丙基(cyclopropyl)、2-甲基丙基(2-methylpropyl)、3-甲基丁基(3-methylbutyl)、环戊基(cyclopentyl)、环己基(cyclohexyl)、环戊基甲基(cyclopentylmethyl)或环己基甲基(cyclohexylmethyl)。
[0014]
作为一个优选方案，r1是4-甲氧基苯甲酰基(4-methoxybenzoyl)或4-苯氧基苯甲酰基(4-phenoxybenzoyl)。
[0015]
作为一个优选方案，r2是2-甲基丙基、3-甲基丁基、环戊基甲基或环己基甲基。
[0016]
优选的，所述环肽结构如式v、式vi、式vii、式viii、式ix、或式x所示：
[0017]
式v：式vi：
式vii：式viii：式ix：式x：
[0018]
本发明的第二个目的在于提供一种穿膜环肽在制备抑制腺瘤性息肉蛋白与腺瘤性息肉蛋白刺激的鸟苷酸交换因子之间的相互作用的药物组合物的用途，所述穿膜环肽为根据本发明所述的穿膜环肽。
[0019]
本发明的第三个目的在于提供一种穿膜环肽在制备治疗癌症相关疾病的药物组合物的用途，所述穿膜环肽为根据本发明所述的穿膜环肽。
[0020]
作为一个优选方案，所述癌症是直肠癌或结肠癌。
[0021]
本发明的第四个目的在于提供一种预防或治疗结肠癌的药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的穿膜环肽或其盐，或含有包含本发明所述的穿膜环肽或其盐的一混合物，及一药学上可接受的载体。
[0022]
本发明的优点在于：本发明提供了一种新型穿膜环肽，通过抑制结肠癌细胞中apc/asef相互作用起到抗结肠癌转移作用。它来源于apc/asef相互作用多肽抑制剂，我们通过二硫键缩合，最终得到了本发明的抗肿瘤穿膜环肽。该环肽立体构型能够与apc蛋白口袋契合，因此能够强烈的阻断apc/asef相互作用，抑制结肠癌细胞的迁移，从而起到对结肠癌的治疗效果。本发明穿膜环肽靶标特异性高，透膜性强，而且稳定不易失活。
附图说明
[0023]
图1是穿膜环肽式v至x的体外结合亲和力实验。
[0024]
图2是等温量热滴定法(isothermal titration calorimetry，itc)测定穿膜环肽式x与apc的亲和力结果。
[0025]
图3是免疫沉淀法(immunoprecipitation，ip)测定穿膜环肽式v、vii、viii、ix和x对apc/asef相互作用的抑制作用。
[0026]
图4是transwell测定穿膜环肽式ix和x对细胞迁移和侵袭的抑制作用。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028]
本发明的药物组合物可以制成本领域公知的各种常规剂型，包括但不限于，适于口服的片剂(包括各种包衣片剂、缓释或控释片剂)、锭剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒剂、可分散粉末、水性或油性混悬剂、乳剂、酏剂或糖浆剂等等；适于局部使用的霜剂、软膏剂、凝胶、水性或油性溶液或混悬剂等等；适于吸入使用的粉末或液体气雾剂、适于经胃肠外给药的无菌水性或油性的静脉内、皮下或肌内注射剂、栓剂等等。
[0029]
于本发明中，视给药途径及/或给药形式而定，可选用一合宜的药学上可接受的载体以提供本发明的穿膜环肽，另外，亦可于本发明药物组合物中包含一药学上可接受的载体。举例言之，所述药学上可接受的载体的例子包含但不限于：溶剂(缓冲液、水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、及前述之组合)、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、增溶剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂、固体载剂(例如淀粉、及皂土(bentonite))。
[0030]
本领域技术人员知晓在本发明的药物组合物中，作为活性成分的穿膜环肽和药学上可接受的载体的合适用量，能够根据本领域的常规方法确定。本领域技术人员同样知晓如何制备含有本发明的穿膜环肽的药物组合物。
[0031]
本发明的穿膜环肽可以采用本领域技术人员已知的固相合成方法合成，并采用本领域技术人员已知的方法，例如高效液相色谱法进行纯化。
[0032]
实施例1：穿膜环肽式v的固相合成、切割、环化、纯化以及鉴定
[0033]
1.1穿膜环肽式v的固相合成
[0034]
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成穿膜环肽式v：以二甲基甲醯胺(dimethylformamide，dmf)为溶剂，配置各种α-氨基被芴苄氧羰基(fmoc)保护的氨基酸溶液(浓度为0.25mol/l)，苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)溶液、1-羟基苯并三唑(hobt)溶液(浓度为0.33mol/l)，哌啶溶液(浓度为200ml/l)，n,n-二异丙基乙基胺(diea)溶液(浓度为174.2ml/l)。
[0035]
1.1.1活化树脂
[0036]
取1g fmoc(芴苄氧羰基)保护的丁苯酰胺树脂放入反应釜并加入适量二氯甲烷膨胀树脂，抽滤除去所述反应釜中多余二氯甲烷并将所述膨胀树脂重新置入所述反应釜中。加入6.00ml含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液振荡5分钟，继续抽滤除去溶剂，再加入
6.00ml含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液振荡15分钟，再次抽滤除去溶剂，用甲醇洗涤三次后再用二氯甲烷洗涤三次，再次抽滤除去溶剂，取15颗树脂用茚三酮检测，如检测结果显示为蓝色则停止上述步骤，若不变色则重复上述步骤。
[0037]
1.1.2多肽的缩合
[0038]
称取1.12g的芴甲氧羰基-s-三苯甲基-l-半胱氨酸(fmoc-cys(trt)-oh)与0.14g hobt加入所述反应釜中。将含有0.33ml的2,4,6-三甲基吡啶和0.16ml的n,n-二异丙基碳二亚胺的6.00ml的n,n-二甲基甲酰胺溶液加入所述反应釜中，密封后于35℃下振荡反应1小时。反应结束后，将反应液抽滤干净，依次用n,n-二甲基甲酰胺、甲醇以及二氯甲烷洗涤，完毕后取15颗树脂用茚三酮检测，若呈蓝色则重复上述过程直到检测结果显无色。接着加入6.00ml含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液振荡5分钟，抽滤除去溶剂，再加入6.00ml含20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液振荡15分钟，再次抽滤除去溶剂，抽滤完后分别用n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷对所述树脂分别洗涤三次。抽滤除去滤液后，取15颗树脂用茚三酮检测，若为蓝色则停止上述步骤，若无色则重复以上脱fmoc基步骤。按照上述方法逐一从c端到n端缩合。待缩合完毕后，用对甲氧基苯甲酰基封端。再将所述树脂分别用n,n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷先后洗涤，并置于真空干燥箱内于50℃下干燥48小时备用。
[0039]
1.2多余基团及树脂的切割
[0040]
将干燥后的所述树脂用刮刀切开连接处，并将其投放于一25ml茄形瓶中，冰水浴下缓慢滴入15ml的树脂切割液(含92.5％三氟乙酸、2.5％水、2.5％对甲酚和2.5％1,2-乙二硫醇)，升温至室温下振荡60分钟，以紫外光检测反应是否完成。待反应完成后将反应液连同所述树脂一同转移至一抽滤装置中抽滤掉所述树脂，并将收集到的滤液置于所述茄形瓶内，以冰乙醚沉降并在4℃、7 000
×
g冷冻离心15分钟，除去上清液，重复操作三次，最后在真空干燥烘箱内于50℃下干燥48小时即得0.2g的肽粗品。
[0041]
1.3链肽纯化
[0042]
用反相高效液相色谱法对所述肽粗品进行纯化。固定相为c18半制备柱，流动相由水相和有机相组成，水相：去离子水(含质量浓度0.1％三氟乙酸)；有机相：含80％乙腈水溶液(含质量浓度0.1％的三氟乙酸)；流速：6.00ml/分钟；洗脱梯度：水相(55％
→
10％，1％/分钟)，有机相(45％
→
90％，1％/分钟)。采集高效液相色谱图中最高峰的洗脱液，于50℃旋转蒸发仪除去洗脱液中的乙腈，并将剩余的水溶液迅速冷冻后用冷冻干燥机除去水分，得到白色固体。
[0043]
1.4二硫键环化及纯化、鉴定
[0044]
将上述白色固体溶于纯水中，将1％的i2/meoh溶液(1g的i2溶解于100ml的meoh中)缓慢滴加到溶液中，使两个cys形成二硫键成环。用二氯甲烷萃取水溶液，用反相高效液相色谱法纯化得到白色粉末状的穿膜环肽式v。高性能液相层析串联质谱仪(hplc-ms)验证固体纯度为96％，esi:888.01[m-h]-。
[0045]
实施例2：按照实施例1相同的方法制备穿膜环肽式vi，固体纯度为95％，esi:914.05[m-h]-；
[0046]
实施例3：按照实施例1相同的方法制备穿膜环肽式vii，固体纯度大于95％，esi:902.04[m-h]-；
[0047]
实施例4：按照实施例1相同的方法制备穿膜环肽式viii，固体纯度大于95％，esi:
950.3[m-h]-；
[0048]
实施例5：按照实施例1相同的方法制备穿膜环肽式ix，固体纯度大于95％，esi:976.1[m-h]-；
[0049]
实施例6：按照实施例1相同的方法制备穿膜环肽式x，固体纯度大于95％，esi:964.1[m-h]-；
[0050]
实施例7：穿膜环肽式v至x分子水平抑制apc/asef相互作用实验。
[0051]
1.1利用荧光偏振(fluorescence polarization，fp)实验建立apc/asef相互作用抑制剂体外筛选体系，评价穿膜环肽分子水平抑制apc/asef相互作用的能力。
[0052]
(1)表达纯化apc(303-739)和asef(170-271)。构建原核表达载体pet28a-apc和pet28a-asef并在菌株bl-21中大量表达apc和asef，然后应用亲和离子交换，凝胶过滤等层析方法得到重组质粒表达的纯化蛋白apc和asef；
[0053]
(2)母液配置：各称取上述穿膜环肽1mg并用二甲基亚砜(dmso)溶解至100mm初始浓度。配制荧光肽母液浓度为100μm。
[0054]
(3)反应条件：用一反应缓冲液(50mm羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)7.5、300mm nacl、1mm乙二胺四乙酸(edta)、1mm二硫苏糖醇(dtt))稀释apc(303-739)和荧光肽(tracer)至各自相应浓度。在室温下一96孔板中进行反应。每个实验组做3个复孔。
[0055]
(4)梯度稀释：在a行各孔加入8μl穿膜环肽，b至h各行加入4μl dmso。从a行各取4μl穿膜环肽加入b行稀释后再取出4μl加入c行，以此类推直到g行，g行稀释之后取出4μl穿膜环肽丢掉。
[0056]
(5)加入91μl apc蛋白稀释液，室温条件孵育1.5小时。加入5μl荧光肽稀释液，室温条件下继续孵育1.5小时。
[0057]
(6)信号值检测：用一多功能酶标仪(synergy h4hybrid reader)来检测荧光偏振值。激发光为485nm，发射光为525nm，g因子为1，灵敏度设置为65。
[0058]
(7)数据处理：1)计算样本的平均荧光值，包含作为阳性对照的“蛋白+荧光肽”和作为阴性对照的“tracer”；2)然后按照以下公式进行计算抑制率(％)＝100*(阳性对照的荧光值-样本的荧光值)/(阳性对照的荧光值-阴性对照的荧光值)。以穿膜环肽终浓度的log值为横坐标，抑制率(％)为纵坐标，用graphpad prism 7软件拟合出抑制曲线并求出ic
50
值，结果如下表1所示。绘制相应的亲和力曲线，结果如图1所示。
[0059]
表1穿膜环肽v至x抑制apc/asef相互作用的ic
50
(单位：μm)
[0060]
多肽名称ic
50
(μm)穿膜环肽式v0.47
±
0.06穿膜环肽式vi0.27
±
0.34穿膜环肽式vii0.36
±
0.08穿膜环肽式viii0.32
±
0.06穿膜环肽式ix0.16
±
0.14穿膜环肽式x0.11
±
0.01
[0061]
实施例8：利用等温滴定微量热实验(itc)测定活性穿膜环肽的亲和力常数。
[0062]
使用bio-rad的实时合酶连锁反应(polymerase chain reaction，pcr)检测系统进行了等温滴定微量热实验。相同批次的蛋白质和穿膜环肽被用于热转移实验。通过对蛋
白的荧光检测，检测apc蛋白在温度从20℃提高到85℃过程中蛋白的量热曲线。将apc(407-751)蛋白解冻后，以12,000r.p.m.离心5分钟，在4℃储存。然后apc蛋白与穿膜环肽分别单独混合在冰上孵育2小时。接下来在12000r.p.m.离心5分钟。所有的样本都准备一式三份,包含25μm apc蛋白、250μm肽(2％最终dmso浓度)，ph＝8.0。将穿膜环肽缓慢滴入到蛋白中，记录480nm激发后的荧光。获得生物分子相互作用的完整热力学参数包括结合常数、摩尔结合焓(δh)、摩尔结合熵(δs)，如图2所示。图2显示，穿膜环肽式x能有效的结合apc蛋白，kd＝0.4μm，该穿膜环肽通过高亲和力抑制apc/asef相互作用。
[0063]
实施例9：穿膜环肽式v、vii、viii、ix和x在细胞中水平抑制apc/asef相互作用活性检测。
[0064]
构建flag-apc(303-876)和ha-asef(170-632)质粒，瞬时转染293t细胞，(组1)转染ha-asef+vector；(组2)转染ha-asef和flag-apc；(组3)转染ha-asef和flag-apc。转染48小时后，加入不同浓度的小分子抑制剂孵育6小时。细胞裂解后，加入anti-flag m2 affinity gel孵育过夜。之后以免疫印迹法(western blot)用相应的抗体检测被apc拉下来的asef量的变化情况。如图3所示，穿膜环肽式v、vii、viii、ix和x在10μm明显抑制细胞内apc/asef相互作用。
[0065]
实施例10：transwell实验测定穿膜环肽式ix和x对结肠癌细胞的迁移抑制作用。
[0066]
在一10公分的培养皿中培养结肠癌细胞sw480，于实验前更换培养基为无血清dmem培养基，进行血清饥饿8小时。向一24孔板的transwell小室的上室加入100μl的无血清dmem培养基，置于培养箱中预平衡1小时。用0.05％的胰酶/edta溶液消化sw480细胞，再用胰蛋白酶抑制剂dti终止消化，然后用无血清dmem培养基清洗细胞两次，最后用无血清dmem培养基重悬细胞，进行细胞计数。利用无血清dmem培养基配制含不同化合物的细胞悬液，按5
×
104细胞/孔的密度将200μl的细胞悬液加入到所述预平衡的transwell小室的上室。然后，向下室加入600μl的含相同化合物的完全培养基(含10％ fbs的dmem培养基)，静置10分钟，再置于培养箱中培养48小时。弃去上室和下室的培养基，用冰pbs清洗两次，然后用棉签轻轻擦拭除去上室的细胞，再用pbs清洗一次。向下室加入600μl的甲醇，静置10分钟，对迁移至下室的细胞进行固定和透化。弃去甲醇，待transwell膜干燥后，向下室加入600μl的0.2％结晶紫溶液，置于4℃过夜。然后，弃去结晶紫溶液，并用大量蒸馏水反复漂洗，用棉签将上室的细胞进一步擦拭完全，将小室置于烘箱中烘干。最后，将小室放置在载玻片上，用倒置显微镜进行拍照，分别在4倍镜下拍摄整个视野以及在10倍镜下拍摄上下左右中五个不同视野。在imagej软件中对10倍镜下细胞进行计数，并计算平均值和标准差，利用单因素方差分析进行统计学分析。如图4所示，穿膜环肽式ix和x在10μm可以明显抑制结肠癌细胞sw480的迁移。
[0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种穿膜环肽，其特征在于，所述穿膜环肽包含如式i所示的结构及其盐：式i：其中r1是式ii、式iii及式iv中之一者所示的基团：式ii：-cor
a1
；式iii：-so2r
a1
；式iv：-co-r
a1
r
a2
；其中，r
a1
及r
a2
表示一氢原子、一任意取代的烃基团、一任意取代的杂环基团或一任意取代的苯环；r2是异丙基、环丙基、2-甲基丙基、3-甲基丁基、环戊基、环己基、环戊基甲基或环己基甲基。2.根据权利要求1所述的穿膜环肽，其特征在于，r1是4-甲氧基苯甲酰基或4-苯氧基苯甲酰基。3.根据权利要求1所述的穿膜环肽，其特征在于，r2是2-甲基丙基、3-甲基丁基、环戊基甲基或环己基甲基。4.根据权利要求1所述的穿膜环肽，其特征在于，所述穿膜环肽包含如式v至式x所示的结构及其盐：式v：式vi：
式vii：式viii：式ix：式x：5.一种穿膜环肽在制备抑制腺瘤性息肉蛋白与腺瘤性息肉蛋白刺激的鸟苷酸交换因子之间的相互作用的药物组合物的用途，其特征在于，所述穿膜环肽为根据权利要求1至4任一项所述的穿膜环肽。6.一种穿膜环肽在制备治疗癌症相关疾病的药物组合物的用途，其特征在于，所述穿膜环肽为根据权利要求1至4任一项所述的穿膜环肽。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌症是直肠癌或结肠癌。8.一种预防或治疗结肠癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1至4任一项所述的穿膜环肽或其盐，或含有包含权利要求1至4任一项所述的穿膜环肽或其盐的一混合物，及一药学上可接受的载体。

技术总结
本发明提供一种穿膜环肽，所述穿膜环肽包含如式I所示的结构及其盐：式I：。本发明还涉及包含该穿膜环肽的组合物、及其制备方法和医药用途。本发明提供的穿膜环肽能够通过靶向抑制结肠癌细胞中腺瘤性息肉蛋白(APC)与腺瘤性息肉蛋白刺激的鸟苷酸交换因子(Asef)之间的相互作用而起到抗结肠癌转移的效果。互作用而起到抗结肠癌转移的效果。互作用而起到抗结肠癌转移的效果。


技术研发人员：张健 杨秀岩 钟杰 兰小兵
受保护的技术使用者：宁夏医科大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/14