文库制备方法和测序方法与流程

1.本技术涉及测序技术领域，尤其是涉及文库制备方法和测序方法。


背景技术：

2.单分子测序技术主要包括单分子实时(single molecule real-time，smrt)测序技术和单分子纳米孔(nanopore)测序技术。其中，nanopore测序技术的原理是纳米孔(微型小孔，本质上是在膜上形成通道)嵌入合成膜，并浸没在离子溶液中，使离子电流通过纳米孔。当dna或rna链通过纳米孔时，会对电流产生干扰，引起电流信号的改变，且不同的碱基会引起不同的电流信号变化。因此，与基于光信号的测序技术不同，nanopore测序技术通过解码核酸通过纳米孔时的电流信号来确定碱基序列。
3.ngs测序技术中文库制备所需的建库时间长，而且文库长度短，但nanopore测序技术则能够有效解决这一问题，其文库制备时间更短，且文库的读长相对较长。然而，现有nanopore测序时主要采用单一拷贝的碱基序列进行测序，dna链穿孔的速率过快，超过了现有光学和电子技术的检测分辨率，造成测序的准确率偏低。为此，部分研究尝试通过环化的方式构建多拷贝纳米孔文库来实现单一样本的多次测序，提高其准确率。但这类方法对于拷贝长度的要求较高，且环化效率不足。


技术实现要素：

4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种文库制备方法和测序方法。
5.本技术的第一方面，提供文库制备方法，该文库制备方法包括以下步骤：
6.s100：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；
7.s200：所述片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；
8.s300：所述接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；
9.s400：所述消化产物经滚环扩增，得到文库；
10.其中，所述接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列和所述第三序列至少部分反向互补，使所述接头形成茎环结构。
11.在本技术的一些实施方式中，双链核酸分子为双链dna分子。
12.在本技术的一些实施方式中，接头序列包括自5
′
端依次的第一序列、第二序列和第三序列，第一序列和第三序列反向互补形成茎环结构的茎，并在接头的3
′
端产生突出的碱基t，而第二序列成环。这样，末端修复时，双链dna的3
′
端加上a尾后，可以与接头形成a-t连接，从而使接头的两端分别与双链核酸分子的两条链连接，环化形成由两条互补链形成的单链核酸分子。
13.在本技术的一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列反向互补的碱基。在其中一些实施方式中，第三序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个与第一序列反向互补的碱基。在其中一些实施方式中，第三序列包含5～15、6～
14、7～13、8～12、9～11个与第一序列反向互补的碱基。
14.在本技术的一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端1～10个突出的碱基t。在其中一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个突出的碱基t。在其中一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端1～8、1～6、1～4、1～3、1～2个突出的碱基t。
15.在本技术的一些实施方式中，第二序列包括0～30个碱基。在其中一些实施方式中，第二序列包括1～30、2～30、5～30、8～30、10～30、20～30个碱基。可以理解的是，第二序列中不包括可以互补配对的碱基。
16.在本技术的一些实施方式中，接头的第一序列包括atctctctc，第三序列包括gagagagatt。
17.在本技术的一些实施方式中，接头的第二序列包括ttttcctcctcctccgttgttgttgtt。
18.在本技术的一些实施方式中，接头的序列如下所示：
19.atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt(seq id no.1)。
20.在本技术的一些实施方式中，s100中，利用g-tube将双链核酸分子打断。其中，g-tube打断双链核酸分子是指提供具有孔口的g-tube和离心机，通过离心力推动双链核酸分子通过孔口，对通过中的双链核酸分子产生剪切力，而使双链核酸分子发生片段化而被打断。在其中一些具体的实施方式中，调整离心机转速、离心时间以及通过孔口的流量等因素，改变片段化产物的长度。
21.在本技术的一些实施方式中，片段化产物的长度为1～50kbp，例如可以是1kbp、2kbp、3kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp、25kbp、30kbp、35kbp、40kbp、45kbp、50kbp。在其中一些实施方式中，片段化产物的长度为5～40kbp，10～30kbp。
22.在本技术的一些实施方式中，利用g-tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～15000rpm，例如可以是3000rpm、5000rpm、8000rpm、10000rpm、12000rpm、15000rpm。在其中一些实施方式中，利用g-tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～10000rpm，3000～8000rpm。
23.在本技术的一些实施方式中，利用g-tube将双链核酸分子打断的离心时间为10s～10min，例如可以是10s、20s、30s、40s、50s、60s、2min、3min、5min、8min、10min。在其中一些实施方式中，利用g-tube将双链核酸分子打断的离心时间为30s～8min，1～5min。
24.在本技术的一些实施方式中，利用g-tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～15000rpm，离心时间为10s～10min。
25.在本技术的一些实施方式中，s100中，片段化产物经纯化处理，具体的纯化方法可以包括磁珠处理、过柱处理等其中至少一种。
26.在本技术的一些实施方式中，纯化处理为磁珠纯化。
27.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理的步骤包括将片段化产物与磁珠混合孵育，随后磁吸弃上清，洗涤后洗脱得到纯化产物。
28.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用乙醇洗涤。
29.在本技术的一些实施方式中，洗涤用乙醇为60％以上的乙醇，例如可以是70％以上的乙醇、85％以上的乙醇。
30.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用乙醇洗涤1～3次。
31.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用缓冲液洗脱。
32.在本技术的一些实施方式中，洗脱所用的缓冲液例如可以是te缓冲液。
33.在本技术的一些实施方式中，s300中，消化产物经纯化处理，具体的纯化方法可以包括磁珠处理、过柱处理等其中至少一种。
34.在本技术的一些实施方式中，纯化处理为磁珠纯化。
35.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理的步骤包括将消化产物与磁珠混合孵育，随后磁吸弃上清，洗涤后洗脱得到纯化产物。
36.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用乙醇洗涤。
37.在本技术的一些实施方式中，洗涤用乙醇为60％以上的乙醇，例如可以是70％以上的乙醇、85％以上的乙醇。
38.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用乙醇洗涤1～3次。
39.在本技术的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用缓冲液洗脱。
40.在本技术的一些实施方式中，洗脱所用的缓冲液例如可以是te缓冲液。
41.在本技术的一些实施方式中，外切酶包括exoⅰ和exoⅲ。
42.在本技术的一些实施方式中，滚环扩增使用phi29 dna聚合酶、bstdna聚合酶、klenow酶中的至少一种。
43.根据本技术实施例的文库制备方法，至少具有如下有益效果：
44.本方案中将双链核酸分子制备成环形dna，并通过滚换扩增得到多拷贝文库，实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度。采用这一文库制备方法，由于特定的接头结构的选择，可以将打断后的长度控制在较长水平，减少拼接成本，节省内存和计算时间。经接头连接环化后，由双链dna所生成的单链dna分子涵盖有原有的两条互补链，长度为原分子的2倍左右，保证了测序质量。同时采用滚环扩增的方式在作用原理上也避免了pcr扩增引入错误。
45.此外，由于文库制备中环化方法和所选的环化试剂，其环化效率相比于现有的常规方法高20％左右。
46.本技术的第二方面，提供一种测序文库，该测序文库采用前述的文库制备方法制得。
47.本技术的第三方面，提供一种测序方法，包括对前述文库制备方法制得的文库进行测序的步骤。
48.在本技术的一些实施方式中，测序为纳米孔测序。
49.在本技术的一些实施方式中，纳米孔测序包括将核酸分子穿过定位在膜中的纳米孔，检测纳米孔上产生的具有序列依赖性的电流，从而判断穿过纳米孔的核苷酸碱基类型，确定核酸分子的序列。
50.在本技术的一些实施方式中，纳米孔测序中所使用的纳米孔包括跨膜孔蛋白。
51.在本技术的一些实施方式中，跨膜孔蛋白包括α-溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌孔蛋白(包括mspa、mspb、mspc、mspd)、胞溶素、外膜孔蛋白f(ompf)、外膜孔蛋白g(ompg)、外膜磷脂酶a、奈瑟球菌属自转运脂蛋白(nalp)、大肠杆菌膜蛋白(csgg)、胰泌素(gspd)、曲霉毒素c(frac)、气单胞菌溶素(aerolysin)等其中至少一种。
52.在本技术的一些实施方式中，纳米孔测序所用的膜为两亲性分子膜。
53.在本技术的一些实施方式中，纳米孔测序所用的膜为单层或双层的脂质层。在其中一些实施方式中，脂质层经过进一步化学修饰或官能化。
54.在本技术的一些实施方式中，纳米孔测序包括纳米孔边合成边测序。
55.在本技术的一些实施方式中，纳米孔边合成边测序包括提供修饰有特异性电活性基团的碱基、核酸分子、dna聚合酶以及纳米孔，当修饰有特异性电活性基团的碱基经dna聚合酶作用掺入到核酸分子时，不同的特异性电活性基团与纳米孔作用发出不同的电信号，从而判断穿过纳米孔的碱基类型，确定核酸分子的序列。
56.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
57.图1是本技术的实施例中电泳结果照片。其中，泳道m1为marker，泳道m2为1kb plus，泳道1为磁珠纯化后的lambda dna，泳道2为磁珠纯化后的e.coli dna，泳道3为磁珠纯化后的人类基因组dna，泳道4为加接头后得到的双链lambda dna环化后的单链dna，泳道5为加接头后得到的双链人类基因组dna环化后的单链dna，泳道6为双链lambda dna环化后的单链dna纯化产物，泳道7为双链人类基因组dna环化后的单链dna纯化产物，泳道8为滚环扩增后的lambda dna，泳道9为滚环扩增后的人类基因组dna。
具体实施方式
58.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
59.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
60.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数，约的含义是指在本数
±
20％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等的范围内。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
61.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
62.实施例1
63.本实施例提供一种dna文库制备方法，包括以下步骤：
64.s100、dna提取，打断，纯化
65.取1000ng lambda dna(neb，n3011l)，加入到g-tube(美国covaris公司)中，6000rpm离心2min后，将g-tube倒置，再次6000rpm离心2min，取出打断后的lambda dna，得到片段化产物，转移到样品管中，琼脂糖凝胶电泳验证是否打断。
66.将ampure xp磁珠(贝克曼库尔特生命科学，目录号a63880)预先室温平衡30min，向样品管中加入1.8倍体积的磁珠，混匀后室温静置5min，随后将离心管置于磁力架上5min至液体澄清，吸弃上清，加入70％乙醇洗涤两次，晾干后，加入30μl te缓冲液，混匀后室温静置5min，置于磁力架上3min至液体澄清，上清转入离心管中，得到片段化的纯化产物。检测纯化产物的浓度，通过0.6％的碱性胶进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果如图1所示，图中泳道m为marker，其中m1(thermo，sm1351)、m2(全式金，bm211-01)，泳道1为纯化后的lambda dna片段化产物(fr pure lambda)。
67.s200、末端修复和接头连接
68.将s100中制备好的lambda基因组dna取500ng与10μl末端修复试剂盒(包括ultraⅱend prep enzyme mix和ultraⅱend prep reaction buffer，neb，e7546)，混匀后反应程序为20℃，30min；65℃，30min，冷却到4℃下保存，得到末端修复后的lambda dna。
69.制备500μl的50μm h-adaptor(100μm h-ada，10
×
annealing buffer，nf water)，95℃，20min；70℃，15min，室温，60min，得到制备好的h-adaptor。h-adaptor的序列如下：
[0070]5′‑
atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt-3
′
(seq id no.1)。其中，下划线部分为第一序列和第三序列，中间部分为第二序列。
[0071]
将上述制备好的h-adaptor，以10μm的终浓度取2.5μl，加到60μl末端修复后的lambda基因组dna中混匀，加入40μl ligation mix(包括ultra ii ligation mix和ligation enhancer，neb，e7595l)，将h-adaptor与末端修复后的基因组进行连接，反应程序为20℃，60min；65℃，10min，冷却至4℃下保存，得到环化的接头产物。结果如图1所示，泳道4为加接头后的lambda dna(+adaptor lambda)。
[0072]
s300、dna消化和纯化
[0073]
接头产物加入外切酶exoⅰ(10u)和外切酶exoⅲ(100u)，混匀后37℃处理60min。采用与前文相同的方法使用ampure xp磁珠(贝克曼库尔特生命科学，目录号a63880)纯化消化后的lambda基因组dna，得到消化产物。结果如图1所示，泳道6为纯化后的lambda基因组dna(dscdnalambda(h-adaptor))。
[0074]
s400、制备模板复合物，滚环扩增，验证单链环质量
[0075]
取s300得到的消化产物作为单链环状模板，与特异性引物、phi29缓冲液按照终浓度为30nm单链环状模板、100nm引物和10
×
phi29 buffer(neb，b0269)混合，在95℃加热3min后，室温放置25min，制备成模板复合物。引物序列如下：
[0076]
bvi-10primer 5
′‑
aacaacaacaacggaggaggagg-3
′
(seq id no.2)。
[0077]
质量验证按照终浓度为3nm的模板复合物、0.1mg/ml的bsa、200μm的dntp以及phi29和phi29 buffer得到rca反应体系，30℃加热60min，得到滚环扩增产物。结果如图1所示，泳道8为滚环扩增后的单链环lambda基因组dna模板(rca dscdna lambda(h-adaptor))。
[0078]
实施例2
[0079]
本实施例提供一种文库制备方法，与实施例1的区别在于，其双链核酸分子为人类
基因组dna，部分实验结果如图1的泳道3、5、7、9所示，分别为磁珠纯化后的人类基因组dna(fr pure human genomic)、加接头后得到的双链人类基因组dna环化后的单链dna(+adaptor human genomic)、双链人类基因组dna环化后的单链dna纯化产物(dscdna human genomic(h-adaptor))、滚环扩增后的人类基因组dna(rca dscdna human genomic(h-adaptor))。
[0080]
实施例3
[0081]
本实施例提供一种文库制备方法，与实施例1的区别在于，其双链核酸分子为大肠杆菌(e.coli)dna分子，部分实验结果如图1的泳道2所示，为磁珠纯化后的e.coli dna(fr pure e.coli)。
[0082]
实施例4
[0083]
本实施例提供一种纳米孔测序方法，包括以下步骤：
[0084]
按照实施例1～3任一种所提供的方法将dna制备成dna文库，将制备得到的dna文库通过axp100测序仪进行纳米孔测序。
[0085]
上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.文库制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s100：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；s200：所述片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；s300：所述接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；s400：所述消化产物经滚环扩增，得到文库；其中，所述接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列和所述第三序列至少部分反向互补，使所述接头形成茎环结构。2.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述接头的序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述外切酶包括exoⅰ和exoⅲ。4.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述片段化产物的长度为1～50kbp。5.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，s100中，所述片段化产物经纯化处理，和/或，s300中，所述消化产物经纯化处理。6.根据权利要求5所述的文库制备方法，其特征在于，所述纯化处理为磁珠纯化。7.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，s100中，利用g-tube将所述双链核酸分子打断。8.测序文库，其特征在于，采用权利要求1至7任一项所述的文库制备方法制得。9.测序方法，其特征在于，包括对权利要求1至7任一项所述的文库制备方法制得的文库进行测序的步骤。10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，所述测序为纳米孔测序。

技术总结
本申请公开了文库制备方法和测序方法。本申请的第一方面提供一种文库制备方法，该文库制备方法包括以下步骤：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；消化产物经滚环扩增，得到文库；接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，第一序列和第三序列至少部分反向互补，使接头形成茎环结构。本方案中将双链核酸分子制备成环形DNA，并通过滚换扩增得到多拷贝文库，实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度。采用这一文库制备方法，由于特定的接头结构的选择，可以将打断后的长度控制在较长水平，减少拼接成本，节省内存和计算时间。节省内存和计算时间。节省内存和计算时间。


技术研发人员：弗拉基米尔
受保护的技术使用者：安序源生物科技（深圳）有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/14