一种慢性肾病类器官的体外构建方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种慢性肾病类器官的体外构建方法及应用。


背景技术：

2.类器官(organoids)是一种利用组织或干细胞体外培养的3d细胞培养物，用于重现来源组织的结构、生理特征和遗传特征，可广泛应用于人源化、个性化的类器官生物样本活库构建，以在兼顾不同人群生理与遗传背景异质性的情况下实现多靶点、高通量的药物药效活性评价。
3.慢性肾病是一种肾脏逐渐失去清除血液中代谢产物的病理过程。慢性肾病的主要病理学过程之一是肾小球损伤。肾小球是肾脏中的过滤单位，通过肾小球滤过的血液中的废物、毒素和多余的水分被排出体外，形成尿液，肾小球损伤会导致肾小球滤过率下降，从而导致肾脏功能逐渐恶化。目前，治疗慢性肾病的方法主要通过对症治疗，透析和肾移植等。然而，目前尚无可以有效预防和减缓肾小球损伤，从而降低慢性肾病的发病率和肾功能损伤程度的药物，因此，开发出一种能防止肾小球损伤的药物对预防及控制慢性肾病来说至关重要。
4.目前，通常采取体外和体内实验结合的方式在临床前研究对有潜力的先导化合物进行药效活性初筛。由于慢性肾病的病理学过程较为复杂，病理机制尚未得到充分解析，缺乏可靠的体外模型以进行大规模药物初筛。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的是提供一种构建慢性肾病类器官构建用的完全培养基，并利用该完全培养基构建所需的类器官。
6.本发明是采用以下技术方案实现的：
7.本发明一种慢性肾病类器官的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)对慢性肾病组织进行分离，得到肾小球组织；
9.(2)将所述肾小球组织置于完全培养基中进行体外培养，得到初代肾小球类器官；其中完全培养基是在基础培养基中添加牛血清，其中所述基础培养基与牛血清的体积比为9:1；
10.(3)将所述初代肾小球类器官进行体外扩增培养，得到本发明所述的慢性肾病类器官。
11.优选的，步骤(1)是对慢性肾病的小鼠进行肾脏取材，获取慢性肾病组织；将所得的肾组织置于盛有hbss溶液的烧杯中浸泡10min，分离去除肾脏皮质成分，冲洗后将肾组织剪成肉糜样小颗粒，置于离心管中并加入2倍体积质量浓度为0.1％ⅰ型胶原酶，37℃恒温摇床消化120min，离心后除去上清液，收集沉淀得到肾小球组织。
12.其中腺嘌呤饮食诱导慢性肾病小鼠模型的构建方法如下：选用10周龄c57bl/6j小
鼠，第一周给予酪蛋白基础饲料(20％酪蛋白)饲养，第二周给予0.2％腺嘌呤酪蛋白基础饲料饲养以诱导肾小管损伤；第3-9周，给予0.15％腺嘌呤酪蛋白基础饲料饲养以建立慢性肾病模型。
13.优选的，步骤(2)所述的体外培养方法包括以下步骤：
14.在所述肾小球组织与所述完全培养基进行混匀，然后添加matrigel基质胶，混合均匀后得到细胞悬液，所述matrigel基质胶体积分数为10％；
15.将所述细胞悬液滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟；
16.取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱中继续培养，离心分离，收集沉淀得到初代肾小球类器官；培养期间每3天向培养板中添加或更换所述完全培养基。
17.优选的，步骤(3)所述体外扩增培养的方法包括以下步骤：
18.在初代肾小球类器官中添加类器官传代酶解轻柔吹打，分散类器官团块，37℃孵育同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3～5个细胞的小细胞团状态；
19.然后加入5ml所述完全培养基，混匀后离心分离，收集沉淀，并在沉淀中添加完全培养基，充分混匀获得类器官悬液；
20.再添加120ul 10％体积分数的matrigel基质胶，充分混合后滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟，取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱继续培养至类器官数大于500个/孔，得到慢性肾病类器官。
21.本发明还提供了所构建的慢性肾病类器官的应用方法，所述应用是对治疗慢性肾病药物的药效进行评价，并且该评价方法是利用免疫荧光染色法评价药物干预所述慢性肾病类器官后的药效。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明通过利用完全培养基在体外构建慢性肾病类器官，并利用该类器官对治疗慢性肾病药物进行药效评价，从而提高了药物的使用安全性以及药效测定的准确性。
附图说明
24.图1为本发明构建的慢性肾病类器官在不同时间下的形态；
25.图2为基于酶联免疫吸附测定评定乌药提取物干预慢性肾病类器官后的药效。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
27.实施例1
28.本发明慢性肾病类器官的构建方法如下：
29.首先，配制完全培养基，其中各成分的质量浓度如表1所示：
30.表1
[0031][0032]
然后，对慢性肾病组织进行分离，得到肾小球组织；具体操作如下：
[0033]
对慢性肾病的小鼠解剖，获取慢性肾病组织；将所得的肾组织置于盛有hbss溶液的烧杯中浸泡10min，分离去除肾脏皮质成分，冲洗后将肾组织剪成肉糜样小颗粒，置于离心管中并加入2倍体积质量浓度为0.1％ⅰ型胶原酶，37℃恒温摇床消化120min，离心后除去上清液，收集沉淀得到肾小球组织。
[0034]
其次，将所述肾小球组织置于本发明完全培养基中进行体外培养，得到初代肾小球类器官；具体体外培养方法如下：
[0035]
在所述肾小球组织与所述完全培养基进行混匀，然后添加matrigel基质胶，混合均匀后得到细胞悬液，所述matrigel基质胶体积分数为10％，所述matrigel基质胶的添加量占所述肾小球组织质量的10％；
[0036]
将所述细胞悬液滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟；
[0037]
取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱中继续培养至体积大于300um，离心分离，收集沉淀得到初代肾小球类器官；培养期间每3天向培养板中添加或更换所述完全培养基。
[0038]
最后，将所述初代肾小球类器官进行体外扩增培养，得到本发明所述的慢性肾病类器官。其中所述体外扩增培养的方法步骤如下：
[0039]
在初代肾小球类器官中添加1.5-2ml类器官传代酶解轻柔吹打，分散类器官团块，37℃孵育同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3～5个细胞的小细胞团状态；
[0040]
然后加入5ml所述完全培养基，混匀后离心分离，收集沉淀，并在沉淀中添加1.lml所述完全培养基，充分混匀获得类器官悬液；
[0041]
再添加120ul 10％体积分数的matrigel基质胶，充分混合后滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟，取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱继续培养至类器官数大于500个/孔，得到慢性肾病类器官
[0042]
实施例2
[0043]
利用实施例1构建的慢性肾病类器官评定乌药醇提取物干预慢性肾病类器官的药效，具体操作如下：
[0044]
首先制备乌药醇提物，具体步骤如下：
[0045]
将乌药块根用清水洗净，自然风干，切薄片，50℃下真空干燥12h，粉碎后过0.45mm金属网筛。然后精密称取药材粉末1.0g，加80％乙醇50ml，60℃回流提取3次，每1h。旋转蒸发浓缩干燥成浸膏备用，临用前用含0.1％dmso的水溶液溶解成1mg/ml乌药提取物母液。
[0046]
然后，将乌药提取物母液滴加到慢性肾病类器官培养液中至其终浓度分别达到200ug/ml和500ug/ml，静置0-24h后，观察慢性肾病类器官的组织形态，如图1所示。
[0047]
实施例3
[0048]
基于酶联免疫吸附测定评定乌药提取物干预实施例1构建的慢性肾病类器官的药效，具体如下：
[0049]
用酶联免疫吸附测定法对炎症标志物il-6、il-10和tnf-α进行检测。具体检测方法是采用购自艾博抗(上海)贸易有限公司的小鼠tnf alpha elisa试剂盒(ab208348)、小鼠il-10elisa试剂盒(ab255729)、小鼠il-6elisa试剂盒(ab222503)进行检测。
[0050]
取类器官培养上清加至酶标板中，将包被液100μl/孔加至酶标板中。盖上板盖或用封板膜封板，2-8℃孵育过夜。洗涤液300μl/孔，洗板5次。封闭液100μl/孔加至酶标板中。盖上板盖或用封板膜封板，室温封闭2h/1h。将标准品用稀释液稀释至起始浓度3000ng/ml，3倍梯度稀释共11个浓度点。供试品稀释过程同标准品，如表2所示。
[0051]
表2标准品和供试品稀释方法
[0052][0053][0054]
封闭结束后，洗涤液300μl/孔，洗板5次。将稀释好的标准品和供试品100μl/孔转移至酶标板中，每个浓度2个复孔。板布局如表3所示。
[0055]
表3酶标板布局
[0056]
123456789101112ast1st2st3st4st5st6st7st8st9st10st11bst1st2st3st4st5st6st7st8st9st10st11
cc-1c-2c-3lh-1lh-2lh-3ll-1ll-2ll-3dc-1c-2c-3lh-1lh-2lh-3ll-1ll-2ll-3efgh
[0057]
盖上板盖或用封板膜封板，室温封闭2h/1h。洗液300μl/孔，洗板5次。将hrp用稀释液稀释100000倍，100μl/孔加至酶标板中。盖上板盖或用封板膜封板，室温避光孵育2h。洗液300μl/孔，洗板5次。tmb(提前平衡至室温)100μl/孔加至酶标板中。盖上板盖，室温避光孵育5-10min。终止液50μl/孔加入酶标板终止反应，温柔轻拍酶标板混合均匀。如图2所示，使用酶标仪读取测定数值，并依据标准曲线换算目标因子在每个样本的确切浓度。
[0058]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种慢性肾病类器官的体外构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对慢性肾病组织进行分离，得到肾小球组织；(2)将所述肾小球组织完全培养基中进行体外培养，得到初代肾小球类器官；所述完全培养基是在基础培养基中添加牛血清，其中所述基础培养基与牛血清的体积比为9:1；(3)将所述初代肾小球类器官进行体外扩增培养，得到本发明所述的慢性肾病类器官。2.根据权利要求1所述慢性肾病类器官的体外构建方法，其特征在于，步骤(1)是对慢性肾病的小鼠进行肾脏取材，获取慢性肾病肾小球组织；将所得的肾小球组织置于盛有hbss溶液的烧杯中浸泡10min，分离去除肾脏皮质成分，冲洗后将组织剪成肉糜样小颗粒，置于离心管中并加入2倍体积质量浓度为0.1％ⅰ型胶原酶，37℃恒温摇床消化120min，离心后除去上清液，收集沉淀得到肾小球组织。3.根据权利要求1所述慢性肾病类器官的体外构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的体外培养方法包括以下步骤：在所述肾小球组织与所述完全培养基进行混匀，然后添加matrigel基质胶，混合均匀后得到细胞悬液，所述matrigel基质胶体积分数占体系总体积为10％；将所述细胞悬液滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟；取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱中继续培养至体积大于300um，离心分离，收集沉淀得到初代肾小球类器官；培养期间每3天向培养板中添加或更换所述完全培养基。4.根据权利要求1所述慢性肾病类器官的体外构建方法，其特征在于，步骤(3)所述体外扩增培养的方法包括以下步骤：在初代肾小球类器官中添加类器官传代酶解轻柔吹打，分散类器官团块，37℃孵育同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3～5个细胞的小细胞团状态；然后加入5ml所述完全培养基，混匀后离心分离，收集沉淀，并在沉淀中添加所述完全培养基，充分混匀获得类器官悬液；再添加120ul 10％体积分数的matrigel基质胶，充分混合后滴入培养板中，置于37℃培养箱中，静置30-50分钟，取出培养板并沿培养板壁缓慢加入所述完全培养基，随后置于37℃、体积百分数为5％co2培养箱继续培养至类器官数大于500个/孔，得到慢性肾病类器官。5.一种慢性肾病类器官，其特征在于，利用权利要求1～3任意一种方法构建得到。6.根据权利要求4所述慢性肾病类器官的应用，其特征在于，所述应用对治疗慢性肾病药物的药效进行评价。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述评价方法是利用免疫荧光染色法评价药物干预所述慢性肾病类器官后的药效。

技术总结
本发明公开了一种慢性肾病类器官的体外构建方法及应用，涉及类器官构建技术领域。本发明是对慢性肾病组织进行分离，得到肾小球组织；然后将所述肾小球组织完全培养基中进行体外培养，得到初代肾小球类器官；最后将所述初代肾小球类器官进行体外扩增培养，得到本发明所述的慢性肾病类器官。本发明利用类器官对治疗慢性肾病药物进行药效评价，从而提高了药物的使用安全性以及药效测定的准确性。的使用安全性以及药效测定的准确性。的使用安全性以及药效测定的准确性。


技术研发人员：彭昕 黄敏聪 赵宇翔 林晓蒙 黄义凯 蔡旭东
受保护的技术使用者：宁波市中医院
技术研发日：2023.02.27
技术公布日：2023/9/13