一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.口腔白斑病是口腔黏膜最常见最多发的疾病之一，是世界公认的口腔癌前病变、口腔潜在恶性疾患(oral potentially malignant disorders，opmd)，是口腔上皮鳞癌的重要来源。国外流行病学数据显示，口腔白斑病患病率1-5％，癌变率高达10-36％，随着上皮异常增生程度的加重口腔白斑病的癌变率级数上升。我们以opmd为关键词，在scopus数据库进行全面的检索分析，结果显示对opmd的高危病例进行早期干预依旧是降低口腔鳞癌发病例和死亡率的首要任务。
3.光动力治疗是指将光照射与光敏剂相结合，产生单线态氧或活性氧，从而氧化破坏生物大分子，最终引起细胞的坏死和凋亡的一项新技术。相比较手术治疗，光动力治疗可以很好地保留口腔正常组织结构，功能不受影响。近年来陆续出现以5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ala)为光敏剂的光动力(photodynamic therapy,pdt)治疗口腔白斑病的报道。
4.近年来缺氧制约光动力治疗在肿瘤领域越来越受到关注。光动力治疗的效果和光敏剂产生单线态氧的量直接相关。肿瘤缺氧微环境以及光动力介导的氧气消耗和微血管破坏进一步加剧组织缺氧，改善缺氧微环境是目前肿瘤光动力治疗领域的难点和热点。血管结构异常是形成肿瘤缺氧微环境的一个重要原因。本技术发明人研究发现，与正常良性新生血管相比，口腔黏膜癌变过程中新生血管结构逐渐出现扭曲、扩张、不成熟的无效血管，最终形成低ph和缺氧微环境，治疗前口腔白斑组织中hif-1α的表达与光动力治疗的预后明显负相关，基于口腔癌前病变和肿瘤微环境的特征，通过抑制异常血管生成，诱导血管结构正常化，重塑病变组织微环境，保持自身持续的氧气供给，是有望突破光动力治疗技术瓶颈的新方法，鉴于此，本发明提出了一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂及其制备方法和应用，所述光敏剂不仅具有光敏特性，还具有精确的药物释放能力、对光刺激的有效反应和更高的活性氧产率，具有改善缺氧微环境增强光动力治疗口腔白斑病的潜能。
6.本发明第一方面提供了一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂，所述光敏剂包括5-氨基酮戊酸、丹酚酸b及脂质体，所述5-氨基酮戊酸和所述丹酚酸b包载于所述脂质体中形成所述光敏剂，对所述5-氨基酮戊酸的包封率为63％-82％、载药量为5.4％-6.3％，对所述丹酚酸b的包封率为74％-75％、载药量为5.5％-6.7％。
7.本发明第二方面提供了上述用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，
包括以下步骤：
8.s1、将脂质体溶解于氯仿中，旋转蒸发成膜，加入5-氨基酮戊酸、丹酚酸b，补充去离子水，超声处理，使用脂质体挤出器过200nm滤膜挤出，得到脂质体混悬液a；
9.s2、使用纳米透析装置对步骤s1中所得脂质体混悬液进行透析，除去未负载于脂质体中的5-氨基酮戊酸和丹酚酸b，补充去离子水定容至10ml，得到脂质体混悬液b；
10.s3、将步骤s2中所得脂质体混悬液b加入曲拉通x-100破膜，即得用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。
11.在本发明的一实施方式中，步骤s1中，在超声功率为120w、频率为40khz下进超声处理1～2min。
12.在本发明的一实施方式中，步骤s1中，脂质体、5-氨基酮戊酸、丹酚酸b之间的质量比为1：1：1。
13.在本发明的一实施方式中，步骤s1中，脂质体包括spc、胆固醇及dspe-peg2000，spc、胆固醇、dspe-peg2000的质量比为80:10:10。
14.在本发明的一实施方式中，步骤s3包括以下步骤：将步骤s2中所得脂质体混悬液b加入曲拉通x-100破膜，加入冻干保护剂，冻干，即得用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。
15.本发明第三方面提供了一种药物，所述药物包括上述用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂或按照权上述的制备方法而制得的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。
16.本发明第四方面提供了上述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂在制备治疗口腔癌前病变药物中的应用。
17.本发明第五方面提供了上述的药物在制备治疗口腔癌前病变药物中的应用。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明实施例提供的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂不仅具有光敏特性，还具有精确的药物释放能力、对光刺激的有效反应和更高的活性氧产率，具有改善缺氧微环境增强光动力治疗口腔白斑病的潜能。
附图说明
19.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
20.图1为sosg实验测定单线态氧释放量图；
21.图2为cck8实验测定细胞存活率和流式细胞术测定细胞凋亡率图；其中，图2a为cck8实验测定nano-salb-ala、nano-salb、nano-ala对cal27细胞存活率影响图，图2b为cck8实验测定nano-salb-ala、nano-salb、nano-ala对leuk1细胞存活率影响图，图2c、2e为流式细胞术测定nano-salb-ala、nano-salb、nano-ala对cal27细胞凋亡率影响图，图2d、2f为流式细胞术测定nano-salb-ala、nano-salb、nano-ala对leuk1细胞凋亡率影响图；
22.图3为共聚焦显微镜下的细胞摄取丹酚酸b和纳米丹酚酸b图；
23.图4为mtt测定细胞存活率图；
24.图5为纳米丹酚酸b对4nqo诱导的口腔癌变的影响、纳米丹酚酸对细胞增殖和细胞周期标记物的影响的试验中六组实验方案图；
25.图6为第18周、第22周、停药4周后实验组癌变率的增长速度图；
sal b-ala不仅具有光敏特性，还具有精确的药物释放能力、对光刺激的有效反应和更高的活性氧产率，具有改善缺氧微环境增强光动力治疗口腔白斑病的潜能。
33.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
34.实施例1
35.本实施例提供了一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂(nano-salb-ala)的制备方法，包括以下步骤：
36.(1)、将300mg脂质体溶解于3ml氯仿中，并转移至茄形烧瓶中，旋转蒸发在瓶底成膜，加入ala(5-氨基酮戊酸)和salb(丹酚酸b)溶液，并补充去离子水2ml；在超声功率为120w、频率为40khz下进超声处理1～2min，使用脂质体挤出器过200nm滤膜挤出1次，得到脂质体混悬液a；其中，脂质体由spc、胆固醇、dspe-peg2000组成，spc、胆固醇、dspe-peg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000)的质量比为80:10:10；脂质体、5-氨基酮戊酸、丹酚酸b的质量比为1：1：1。
37.(2)、使用纳米透析装置对步骤s1中所得脂质体混悬液a进行透析，除去未负载于脂质体中的5-氨基酮戊酸和丹酚酸b，补充去离子水定容至10ml，得到脂质体混悬液b；
38.(3)、取步骤s2中所得脂质体混悬液b10ul，加入曲拉通x-100破膜，通过紫外分光光度计测定脂质体中ala和丹酚酸b含量，5-氨基酮戊酸含量为5.4％，丹酚酸b含量为6.7％；
39.(4)、加入冻干保护剂，冻干，即得用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。
40.本实施例中制备所得光敏剂中，5-氨基酮戊酸和所述丹酚酸b包载于脂质体中形成所述光敏剂，5-氨基酮戊酸的包封率为63％、载药量为5.4％，对丹酚酸b的包封率为75％、载药量为6.7％。
41.载药量：利用曲拉通进行破膜处理后测试紫外吸收或者液相；载药量＝(投药量-剩余量)/载体质量
×
100％；包封率＝(投药量-剩余量)/投药量
×
100％。
42.实施例2
43.本实施例提供了一种nano-salb的制备方法，包括以下步骤：
44.(1)、将300mg脂质体溶解于3ml氯仿中，并转移至茄形烧瓶中，旋转蒸发在瓶底成膜，加入salb溶液，并补充去离子水2ml；在超声功率为120w、频率为40khz下进超声处理1～2min，使用脂质体挤出器过200nm滤膜挤出1次，得到脂质体混悬液a；其中，脂质体由spc、胆固醇、dspe-peg2000组成，spc、胆固醇、dspe-peg2000的质量比为80:10:10；脂质体、丹酚酸b的质量比为1：1。
45.(2)、使用纳米透析装置对步骤s1中所得脂质体混悬液a进行透析，除去未负载于脂质体中的丹酚酸b，补充去离子水定容至10ml，得到脂质体混悬液b；
46.(3)、取步骤s2中所得脂质体混悬液b10ul，加入曲拉通x-100破膜，通过紫外分光光度计测定脂质体中丹酚酸b含量，测得丹酚酸b载药量为6.4％，包封率73％。
47.(4)、加入冻干保护剂，冻干，即得nano-salb。
48.本实施例中通过上述方法制备所得nano-salb，包括丹酚酸b，所述丹酚酸b包载于
所述脂质体中。
49.实施例3
50.本实施例提供了一种nano-ala的制备方法，包括以下步骤：
51.(1)、将300mg脂质体溶解于3ml氯仿中，并转移至茄形烧瓶中，旋转蒸发在瓶底成膜，加入ala溶液，并补充去离子水2ml；在超声功率为120w、频率为40khz下进超声处理1～2min，使用脂质体挤出器过200nm滤膜挤出1次，得到脂质体混悬液a；其中，脂质体由spc、胆固醇、dspe-peg2000组成，spc、胆固醇、dspe-peg2000的质量比为80:10:10；脂质体、5-氨基酮戊酸的质量比为1：1。
52.(2)、使用纳米透析装置对步骤s1中所得脂质体混悬液a进行透析，除去未负载于脂质体中的ala，补充去离子水定容至10ml，得到脂质体混悬液b；
53.(3)、取步骤s2中所得脂质体混悬液b10ul，加入曲拉通x-100破膜，通过紫外分光光度计测定脂质体中ala含量，ala载药量为5.8％，包封率为65％。
54.(4)、加入冻干保护剂，冻干，即得nano-ala。
55.本实施例中通过上述方法制备所得nano-ala，包括5-氨基酮戊酸，所述5-氨基酮戊酸包载于所述脂质体中。
56.试验例1
57.一、细胞培养
58.在37℃、5％二氧化碳环境中，使用含有10％牛血清和100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素的dmed(dulbecco
′
s modifed eagle
′
s medium,dmed)培养基，培养cal27细胞和leuk1细胞。
59.二、sosg测定单线态氧
60.用sosg法测定单线态氧的生成。将leuk1细胞以5
×
106/ml的浓度接种在含有k-sfm培养基的96孔板中，然后将细胞培养基替换为含有nano-salb-ala、nano-salb或nano-ala的培养基(ala终浓度均为1mm)。孵育24h后，用pbs洗涤细胞，用pbs溶液中的sosg(0.5mm)替换培养基，孵育10min。最后，用波长635nm、功率0.1w/cm2的激光照射板上每孔10min，记录sosg荧光强度。
61.三、cck8实验
62.将cal27细胞和leuk1细胞接种到96孔板中，分别加入nano-salb-ala、nano-salb和nano-ala(0.25、0.5、0.75、1和2mm)，孵育24h后，使用635nm、2mw/cm2的激光照射细胞。使用cck-8试剂盒测得分别运用nano-salb-ala、nano-salb和nano-ala的pdt对细胞增殖的影响。
63.四、用annexin-v细胞凋亡检测试剂盒检测cal27细胞和leuk1细胞的凋亡，对细胞进行清洗、固定和渗透。然后用nano-salb-ala、nano-salb和nano-ala(0.25、0.5、0.75、1和2mm)处理细胞，孵育24小时。用635nm、2mw/cm2的激光处理2分钟后，所有样品均使用guava easycyte流式细胞仪进行分析和定量。
64.五、数据分析
65.所有数据均使用spss 22.0(spss,usa)和graphpad prism version 9.0(graphpad software,san diego,ca,usa)软件进行分析。数据以均数
±
标准差或数字(百分比)的形式呈现。连续变量比较采用普通单因素方差分析和双尾t检验。p值小于0.05为有
统计学差异。
66.六、结果
67.(1)nano-salb-ala提高单线态氧的释放
68.sosg法能与溶液中的单线态氧结合，生成具有显著荧光特性的sosg-ep。在504nm的光激发下，sosg-ep能产生525nm的荧光，强度与单线态氧呈正相关。如图1所示，sosg实验显示与nano-ala和nano-salb相比，nano-salb-ala能更有效地释放单线态氧。
69.(2)nano-salb-ala对细胞增殖的影响
70.cck8法检测pdt中使用的nano-salb-ala、nano-salb、nano-ala对cal27细胞(图2a)和leuk1细胞(图2b)增殖的影响。两种细胞的存活率随着三种纳米制剂浓度的增加而降低，说明pdt加三种纳米制剂对细胞增殖有剂量依赖性抑制作用。在相同的激光照射下，nano-salb-ala对cal27和leuk1细胞的抑制作用明显强于nano-salb和nano-ala(图2a和2b)(two-tailed test,p《0.05)。nano-salb-ala组对两种细胞的抑制作用均强于nano-salb组，差异有统计学意义(two-tailed test,p《0.05)。如图2a和2b所示，经nano-salb-ala、nano-salb或nano-ala处理后，cal27和leuk1细胞的细胞活力随着浓度的增加而降低。当cal27细胞中浓度高于0.5mm时，nano-ala组细胞活力显著低于nano-salb-ala组(two-tailed test,p《0.05)。同样，当leuk1细胞中浓度高于1mm时，nano-ala组细胞活力显著低于nano-salb-ala组(two-tailed test,p《0.05)。
71.(3)nano-salb-ala对细胞凋亡的影响
72.流式细胞仪检测0.25、0.5、0.75、1、2mm浓度，635nm波长激光照射15min对cal27细胞和leuk1细胞凋亡的影响(图2e和2f)。两种细胞的凋亡率随三种纳米制剂浓度的增加呈剂量-反应关系。nano-salb-ala组细胞凋亡率高于nano-ala组和nano-salb组，但差异无统计学意义(two-tailed test,p《0.05)(图2c和2d)。
73.试验例2
74.本试验例中验证了丹酚酸b对口腔白斑病癌变过程显示出显著的阻断作用，纳米化能明显提高其生物利用度、靶向性和抗肿瘤活性。
75.一、本试验例对纳米化增强了丹酚酸b的细胞摄取、纳米丹酚酸b对细胞存活率的影响进行了研究。
76.在37℃、5％二氧化碳环境中，用含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素的dmed培养基，培养hn13和hn30细胞；用k-sfm培养基培养leuk1细胞。
77.1、细胞摄取实验
78.根据中国药典，丹酚酸b是自荧光物质，故无需荧光标记即直接应用于本实验。hn13、hn30和leuk1细胞以2
×
104的密度在24孔板中培养过夜，加入200ug/ml的丹酚酸b和纳米丹酚酸b；培养2小时后，用pbs洗涤并用4％甲醛固定后，再次用pbs洗涤；然后，每孔加入200ul鬼笔环肽，黑暗下培养30分钟后，用pbs洗涤三次并用50％甘油固定。最后，用激光扫描共聚焦显微镜测定。细胞内的丹酚酸b激发波长是405nm，发射波长是400
–
550nm，鬼笔环肽激发波长是488nm，发射波长是520
–
670nm。
79.2、细胞存活率测定
80.hn13、hn30和leuk1细胞以每孔3
×
103的密度培养在96孔板中24小时，依照24h,48h,72h,96h的时间梯度，用有25,50,100,200ug/ml浓度梯度的丹酚酸b和纳米丹酚酸b的
培养基培养细胞。随后，mtt实验测定细胞存活率。用酶联免疫吸附测定仪490nm测定样品的吸光度。所有样品均重复三次，每个实验至少进行三次。
81.结果
82.1、纳米化增强了丹酚酸b的细胞摄取(图3)
83.图3为共聚焦显微镜下的细胞摄取图；(a)hn13，(b)hn30，(c)leuk1细胞经200ug/ml的丹酚酸b和纳米丹酚酸b处理2小时。细胞内的丹酚酸b发蓝色荧光，显示细胞骨架的鬼笔环肽发绿色荧光。在合并的图片中，在三个细胞系中，纳米丹酚酸b的细胞内积累明显强于丹酚酸b；比例尺＝20um。
84.经药物处理的细胞质和细胞核中看到了增强的荧光，说明丹酚酸b进入了细胞。如图3所示，用纳米丹酚酸b处理的细胞内荧光比丹酚酸b处理的细胞内荧光明显更强，说明细胞摄取纳米丹酚酸b多于丹酚酸b。
85.2、纳米丹酚酸b对细胞存活率的影响(图4)
86.图4为mtt测定细胞存活率图；采用24h,48h,72h,96h的时间梯度和25,50,100,200ug/ml丹酚酸b和纳米丹酚酸b的浓度梯度处理(a)hn13细胞(b)hn30细胞(c)leuk1细胞(***,p《0.001)。
87.hn13细胞200ug/ml的丹酚酸b和纳米丹酚酸b处理48小时，使用纳米丹酚酸b的细胞抑制率是84.7％，高于使用丹酚酸b的细胞抑制率28.6％(p《0.001)。hn30细胞200ug/ml的丹酚酸b和纳米丹酚酸b处理96小时，使用纳米丹酚酸b的细胞抑制率是79.4％，高于使用丹酚酸b的细胞抑制率50.1％(p《0.001)。因此，在有效浓度下，纳米丹酚酸b使hn13和hn30细胞的存活率分别显著降低了56.1％和29.3％，与等量的丹酚酸b相比，其抗增殖活性显著提高。此外，与同浓度(200ug/ml)的丹酚酸b处理相比，纳米丹酚酸b处理的leuk1细胞在96h时的存活率下降。相反，与同浓度的丹酚酸b处理相比，纳米丹酚酸b对leuk1细胞的影响在48小时增加。
88.二、本试验研究了纳米丹酚酸b对4nqo诱导的口腔癌变的影响、纳米丹酚酸对细胞增殖和细胞周期标记物的影响。
89.1、试剂、动物和实验设计
90.将100ug/ml的4nqo加入c57bl/6j雌性小鼠的饮用水中。将小鼠安置在标准的温度和湿度条件下，并交替进行12小时的明暗循环，并喂食正常的颗粒饮食和水。适应1周后，将小鼠随机分为6组(六组实验方案图见图5)：4nqo(组a，n＝35)、4nqo+丹酚酸b(组b，n＝30)、4nqo+纳米丹酚酸b(组c，n＝30)、水(组d，n＝5)、水+丹酚酸b(组e，n＝5)、水+纳米丹酚酸b对照(组f，n＝5)。组a-c小鼠给予4nqo(100μg/ml)饮用水，组d-f小鼠给予正常饮用水，连续22周。组b和组c小鼠给丹酚酸b和纳米丹酚酸b(均为16.6mg/kg/d)灌胃，同时给药4nqo。为了确定纳米制剂是否能在蓄积18周后增强药物的持续释放，组b和组c在研究的最后4周(第19周至第22周)停止使用丹酚酸b和纳米丹酚酸b治疗。组d、组e和组f小鼠分别给予正常饮水、丹酚酸b、纳米丹酚酸b作为对照。每组小鼠每周进行一次体重评估，每两周对所有小鼠进行一次全口腔宏观检查。为了确定多阶段干预对丹酚酸b和纳米丹酚酸b抗口腔癌变活性的影响，在第8、14、18和22周对组a-c的7-10只小鼠实施安乐死，取舌组织。在指定的时间点采集组织样本进行组织病理学和免疫化学检查。
91.2、组织病理学和免疫组织化学
92.全舌标本用福尔马林固定，石蜡包埋，h&e染色切片进行常规组织病理学检查。基于世界卫生组织的标准和先前关于c57bl/6j小鼠口腔癌模型的报告，诊断上皮良性增生、不同程度的异常增生和癌。最严重的组织学分级由单盲的口腔病理学家确定和诊断。通过18周内实验组a-c口腔上皮异常增生/癌的聚集性发病率(cumulative incidence，ci)来测定药物的预防癌变效果。依据最严重的组织学报告上皮异常增生/癌的小鼠所占百分比，在指定时间点累加小鼠数量得到每组的总发病率从而得出异常增生/癌的ci。进一步处理5微米厚的组织切片进行免疫组化分析。以抗ki67(ab16667,1:100)和pcna(ab92729,1:50)单克隆抗体作为细胞增殖标记，以抗周期蛋白d1(ab134175,1:10)和p16(ab54210,1:500)单克隆抗体作为细胞周期标记，进行切片染色。pcna在细胞增殖和细胞周期调控中起着重要作用，而ki-67参与除g1早期外的所有细胞周期阶段。cyclin d1是参与细胞周期g1/s转变的核蛋白，而p16是细胞周期g1期的调节因子。所有载玻片均采用先前优化的条件进行染色，并进行适当的阳性和阴性对照。用dp 70ccd相机(olympus,tokyo,japan)随机抓拍5张免疫染色切片的400倍图像，用image pro-plus软件(version 6.0,media cybernetics,rockville,md,usa)计数阳性细胞。
93.结果：
94.1.纳米丹酚酸b对4nqo诱导的口腔癌变的影响(图6，图7)
95.为了评估纳米丹酚酸b对oscc多阶段发展的化学预防作用，我们在实验a-c组18周的试验中检查了口腔发育不良/癌的累积发病率。
96.图6为、第18周、第22周、停药4周后实验组癌变率的增长速度。星号(*)表示在指定的时间点(第8、14、18或22周)处死小鼠。4nqo：4-硝基喹啉-1-氧化物；salb:丹酚酸b；salb-plc-np：纳米丹酚酸b。
97.图7为小鼠正常黏膜、异常增生和鳞状细胞癌的代表性免疫组化图片(放大倍数：
×
100)。(a)ki67,(b)pcna,(c)cyclin d1。
98.在第18周治疗结束后，4nqo暴露组的癌发生率(16.0％)高于丹酚酸b处理组和纳米丹酚酸b处理组(均为4.5％)(图6)。a-c组中度或重度发育不良的发生率从4nqo暴露组(64.0％)到丹酚酸b(45.5％)和纳米丹酚酸b(36.3％)组呈下降趋势(p＝0.059，单因素方差分析)。正常对照组、丹酚酸b和纳米丹酚酸b对照组小鼠(d-f组)均未发现组织学异常。此外，在整个试验过程中，药物对照小鼠(e组，f组)未观察到毒性的临床迹象。为了评估纳米丹酚酸b积累18周后持续释放药物对口腔癌变的影响，我们在实验a-c组的22周试验中重点研究了口腔上皮异常增生/癌的累积发病率(图6)。第22周4nqo治疗结束后，丹酚酸b组(16.7％)和纳米丹酚酸b组(10.0％)的癌发生率明显低于4nqo暴露组(34.3％)(p《0.05，χ2检验)。与上述结果一致，丹酚酸b组(60.0％)和纳米丹酚酸b组(46.7％)中度或重度发育不良的发生率显著低于4nqo暴露组(74.3％)(p《0.05，χ2检验)。有趣的是，即使在研究的最后4周停药后，a-c组(图6)中4nqo暴露组的癌生长率(18.3％)高于丹酚酸b组(12.2％)和纳米丹酚酸b组(5.5％)。具有代表性的宏观病变及显微组织学图像如图7所示。
99.2、纳米丹酚酸对细胞增殖和细胞周期标记物的影响(图8)
100.为了探究纳米丹酚酸b对4nqo诱导的小鼠舌部癌变过程中细胞增殖和细胞周期的进展，我们检测了细胞增殖标记物ki67和pcna和细胞周期标记物cyclin d1和p16。
101.图7是小鼠正常黏膜、异常增生和鳞状细胞癌的代表性免疫组化图片。
102.图8为第18周和22周中/重度异常增生中ki67,pcna和cyclin d1的表达水平图。
103.由于中/重度异常增生阶段有较高的恶变风险，我们着重于研究此阶段时丹酚酸b对细胞增殖和中期标记物水平的影响，从而得出纳米化丹酚酸b对于癌变的化学预防作用。在第18周，4nqo干预结束时，分别在实验组a、b、c观察到了5、5、4个异常增生病变。实验组a中ki-67,pcna,和cyclin d1过表达，但在实验组c(纳米丹酚酸b处理)中的水平显著低于(all p《0.05)实验组b(丹酚酸b处理)。在停药19-22周后的第22周4nqo治疗中，实验组a、b和c分别观察到2、4和4个异常增生。a组、b组和c组在第22周的ki-67、pcna和cyclin d1表达趋势分别与第18周相似。为了评估纳米丹酚酸b停药(19-22周)后持续释放对细胞增殖和细胞周期标志物的影响，我们重点研究了这些标志物在18周和22周表达模式的差异(图8)。a组和b组第22周ki-67、pcna、cyclin d1表达水平均显著高于第18周(均p《0.05,t检验)。有趣的是，两个时间点间，c组ki-67、pcna、cyclin d1表达水平无显著性差异(p》0.05,t检验)，c组表达水平明显弱于a组和b组(均p《0.05,t检验)。此外，与正常对照组(d组)相比，单独给丹酚酸b的(e组和f组)的小鼠(e组和f组)在细胞增殖或细胞周期标记物表达方面没有显著差异。
104.综上可知，丹酚酸b(sal b)对口腔白斑病癌变过程显示出显著的阻断作用，纳米化丹酚酸b(nano-salb)能明显提高其生物利用度、靶向性和抗癌活性。4-硝基喹啉-1-氧化物(4nqo)诱导小鼠舌背白斑形成动物实验证实纳米化能显著提高丹酚酸b的抗癌性能，有效降低舌背白斑的癌变率，抑制口腔白斑组织ki-67、增殖细胞核抗原(pcna)和细胞周期蛋白d1(cyclin d1)的表达。本实施例将丹酚酸b加入传统光敏剂5-氨基酮戊酸中，制成一种新型光敏剂，即丹酚酸b和ala的脂质体纳米颗粒(nano-salb-ala)，证实了nano-salb-ala可以显著提高单线态氧的释放、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，从而提高光动力治疗的疗效。
105.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本技术的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

技术特征：
1.一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂，其特征在于，所述光敏剂包括5-氨基酮戊酸、丹酚酸b及脂质体，所述5-氨基酮戊酸和所述丹酚酸b包载于所述脂质体中形成所述光敏剂，对所述5-氨基酮戊酸的包封率为63％-82％、载药量为5.4％-6.3％，对所述丹酚酸b的包封率为74％-75％、载药量为5.5％-6.7％。2.一种权利要求1所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将脂质体溶解于氯仿中，旋转蒸发成膜，加入5-氨基酮戊酸、丹酚酸b，补充去离子水，超声处理，使用脂质体挤出器过200nm滤膜挤出，得到脂质体混悬液a；s2、使用纳米透析装置对步骤s1中所得脂质体混悬液进行透析，除去未负载于脂质体中的5-氨基酮戊酸和丹酚酸b，补充去离子水定容至10ml，得到脂质体混悬液b；s3、将步骤s2中所得脂质体混悬液b加入曲拉通x-100破膜，即得用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。3.根据权利要求2所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中，在超声功率为120w、频率为40khz下进超声处理1～2min。4.根据权利要求2所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中，脂质体、5-氨基酮戊酸、丹酚酸b之间的质量比为1：1：1。5.根据权利要求2所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中，脂质体包括spc、胆固醇及dspe-peg2000，spc、胆固醇、dspe-peg2000的质量比为80:10:10。6.根据权利要求2所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s3包括以下步骤：将步骤s2中所得脂质体混悬液b加入曲拉通x-100破膜，加入冻干保护剂，冻干，即得用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。7.一种药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1中所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂或按照权利要求2至6中任一项所述的制备方法而制得的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂。8.权利要求1中所述的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂在制备治疗口腔癌前病变药物中的应用。9.权利要求7中所述的药物在制备治疗口腔癌前病变药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂及其制备方法和应用，所述光敏剂包括5-氨基酮戊酸、丹酚酸B及脂质体，所述5-氨基酮戊酸和所述丹酚酸B包载于所述脂质体中。本发明中的用于口腔癌前病变光动力治疗的光敏剂不仅具有光敏特性，还具有精确的药物释放能力、对光刺激的有效反应和更高的活性氧产率，具有改善缺氧微环境增强光动力治疗口腔白斑病的潜能。斑病的潜能。斑病的潜能。


技术研发人员：吴岚 张颖 叶赛 赵晓娴
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2023.02.23
技术公布日：2023/9/13