一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用

1.本发明涉及一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)是一种能够以乳糖为唯一碳源生长的酵母，大多数乳酸克鲁维酵母都分离自以乳糖为碳源的牛奶制品中，是一个食品安全级别较高的菌株，在食品酶和药用蛋白表达上应用广泛。
3.作为新兴非常规酵母，乳酸克鲁维酵母工业化规模的产酶能力使其在生物技术领域具有重要应用。乳糖酶是乳酸克鲁维酵母生产的一种重要的内源糖苷水解酶，主要应用于乳制品工业生产低乳糖乳制品，具有巨大的市场潜力和发展前景。野生型乳酸克鲁维酵母所产乳糖酶多为胞内酶，一般要进行破壁释放胞内物质。
4.目前实验室中乳酸克鲁维酵母的破壁方法很多，包括机械破壁法(高压匀浆法、珠磨法)、基于能量波的破壁法(微波破壁法、超声破壁法)、化学法破壁法(渗透压冲击法、酶法、酸处理、表面活性剂处理)以及生物法破壁等。虽然这些方法经过不断改进，用于实验室中不同胞内产物的提取，但仍存在一些缺点：对仪器要求高、成本高、操作繁琐、破壁时间较长等。复杂的下游工艺大大提高了乳糖酶的工业成本，影响其更大规模的应用。


技术实现要素：

5.针对目前破壁技术复杂、工业应用成本较高的缺点，本发明旨在提供一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌，并将其应用于乳酸克鲁维酵母快速裂解后的胞内活性物质检测。
6.本发明提供甘露糖蛋白编码基因在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的应用。
7.在一种实施方式中，所述甘露糖蛋白编码基因为klla0_e01057g，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
8.在一种实施方式中，所述应用是降低所述甘露糖蛋白编码基因在乳酸克鲁维酵母菌中的表达量。
9.在一种实施方式中，所述应用是敲除或沉默所述甘露糖蛋白编码基因。
10.本发明还提供一种乳酸克鲁维酵母工程菌，所述乳酸克鲁维酵母工程菌的甘露糖蛋白编码基因缺失或沉默。
11.在一种实施方式中，所述乳酸克鲁维酵母工程菌以乳酸克鲁维酵母jnxr-2101为出发菌株，所述乳酸克鲁维酵母jnxr-2101公开于公开号为cn114806906a的专利申请文件中。
12.本发明还提供了含有所述乳酸克鲁维酵母工程菌和裂解酶的试剂盒。
13.本发明还提供了所述乳酸克鲁维酵母裂解工程菌快速裂解释放胞内物质的方法，包括如下步骤：
14.培养重组菌株，加入一定浓度裂解酶lyticase孵育一段时间，使乳酸克鲁维酵母
胞内物质释放到胞外。
15.在一种实施方式中，所述裂解酶lyticase浓度为1～20u/ml，孵育时间为1～60min。
16.在一种实施方式中，所述裂解酶lyticase的反应浓度为5～20u/ml。
17.本发明还提供所述乳酸克鲁维酵母工程菌，或所述试剂盒，或所述方法在酶活检测、蛋白鉴定等方面的应用。
18.有益效果：
19.(1)本发明的操作对象为乳酸克鲁维酵母，一种食品安全级别较高的工业菌株，具有广泛的应用前景；
20.(2)本发明提供了甘露糖蛋白基因的新用途，该基因的敲除对于突变菌株的生长几乎无影响；
21.(3)本发明构建的敲除了甘露糖蛋白基因的乳酸克鲁维酵母裂解时间较短，30min内几乎可使细胞完全裂解，大幅缩短以往乳酸克鲁维酵母裂解的时间；
22.(4)本发明的乳酸克鲁维酵母裂解方法操作简便，处理过程中无需添加额外试剂和玻璃珠，简化实验流程；应用广泛，裂解后的乳酸克鲁维酵母细胞可进行酶活检测、蛋白鉴定。
附图说明
23.图1为重组载体pudp025-cas9-ge01057g质粒图谱；
24.图2为乳酸克鲁维酵母裂解工程菌jnxr-2101δe01057g与野生型jnxr-2101生长产酶状况；
25.图3为乳酸克鲁维酵母突变株对于裂解酶lyticase的敏感度及酶活检测结果；
26.图4为lyticase裂解法和fastprep机械破壁法应用于乳酸克鲁维酵母jnxr-2101δe01057g酶活测定；
27.图5为裂解体系应用于乳酸克鲁维酵母jnxr-2101δe01057g蛋白鉴定结果；
28.图6为乳酸克鲁维酵母突变株jnxr-2101δe01057g与野生型jnxr-2101的冷场发射扫描电子显微镜图；
29.图7为乳酸克鲁维酵母突变株jnxr-2101δe01057g的5l罐发酵结果；
具体实施方式
30.培养基：
31.ypd固体培养基：胰蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l。
32.ypl培养基：胰蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、乳糖20g/l。
33.5l罐发酵培养基成分：乳糖浓度40g/l，玉米浆40g/l、氮源50g/l、硫酸锰0.3g/l、硫酸镁0.5g/l。
34.本发明通过构建pudp025-cas9-ge01057g载体及供体dna，将其转化至乳酸克鲁维酵母jnxr-2101感受态细胞以敲除甘露糖蛋白基因klla0_e01057g，构建一种乳酸克鲁维酵母快速裂解工程菌jnxr-2101δe01057g。通过裂解酶lyticase处理乳酸克鲁维酵母裂解工程菌，获取胞内活性物质进行胞内蛋白快速检测及鉴定，并对其进行5l发酵罐培养。下面对
本发明作进一步的详细描述：
35.乳糖酶活性检测：
36.取0.3ml待测酶液，加入1.5ml onpg(2.5g/l)溶液，30℃水浴10min后加入0.6ml na2co3(50g/l)溶液，在420nm处测定吸光度值。粗酶液需稀释一定梯度使吸光值在标曲范围(0～0.5u/ml)内。
37.乳糖酶酶活(u/ml)＝((δa
420-c0)
×v×
n)/(k
×
t
×
v)；
38.其中，δa
420
为反应后测定吸光度值；c0为标准曲线截距；v为反应总体积；n为酶液稀释倍数；k为标准曲线斜率；t为反应时间；v为酶液体积。
39.裂解率的计算：按如下公式计算裂解率：
40.细胞裂解率(％)＝(od
600
(0)-od
600
(t))/od
600
(0)
41.其中，od
600
(0)为0min测定od
600
；od
600
(t)为加入裂解酶反应t min后测定od
600
。
42.裂解酶lyticase购自北京索莱宝科技有限公司，货号为l8140。
43.实施例1：重组载体pudp025-cas9-ge01057g和供体dna的构建
44.(1)重组载体pudp025-cas9-ge01057g的构建：
45.以购自addgene的pudp025质粒为模板，使用sgrna设计工具设计sgrna(aacgtcggtaacccaagcgg)，使用引物对p1/p2扩增后转化到大肠杆菌jm109中，挑选测序正确的重组载体，即pudp025-cas9-ge01057g(如图1)。
46.(2)供体dna的构建：
47.以乳酸克鲁维酵母jnxr-2101(公开于公开号为cn114806906a的专利申请文件中)基因组为模板，使用引物对p3/p4及p5/6分别扩增得到klla0_e01057g-h1和klla0_e01057g-h2片段。以t载体为模板，p7/p8为引物对扩增得到线性化t载体片段。将klla0_e01057g-h1和klla0_e01057g-h2两个片段融合后使用seamless cloning kit与t载体片段连接，得到t-δklla0_e01057g质粒，转化到大肠杆菌jm109感受态细胞中筛选构建正确的质粒。以t-δklla0_e01057g为模板，使用引物对p3/p6扩增得到供体dna。
48.(3)重组菌株jnxr-2101δe01057g的构建及验证：
49.将步骤(1)构建的pudp025-cas9-ge01057g质粒和步骤(2)构建的供体dna同时转化到乳酸克鲁维酵母jnxr-2101中，电转条件为2000v、400ω。grna协助cas9蛋白定位到klla0_e01057g基因进行dna切割，以供体dna作为模板进行同源重组，实现klla0_e01057g基因的敲除。加入1ml无菌山梨醇溶液(1m)，30℃、220rpm振荡培养1h，涂布ypd固体平板(含200μg/ml潮霉素b)，30℃静置培养2d。挑选乳酸克鲁维酵母转化子，使用引物对p3/p9菌落pcr，将pcr产物测序，成功获得敲除klla0_e01057g基因的裂解菌株k.lactis jnxr-2101δe01057g。
50.表1构建裂解工程菌k.lactis jnxr-2101δe01057g的引物序列
[0051][0052]
实施例2：乳酸克鲁维酵母jnxr-2101δe01057g生长曲线测定
[0053]
挑取乳酸克鲁维酵母突变体jnxr-2101δe01057g和野生型jnxr-2101至50ml ypl液体培养基中，30℃、220rpm培养24h作为种子液。测定种子液的od
600
，以初始od
600
为0.05转接至ypl液体培养基中，间隔8h取样测定发酵液的od
600
及胞内外酶活性。使用fastprep-24破壁乳酸克鲁维酵母细胞，破壁程序为振荡速度6.0m/sec、处理30s、10个循环。
[0054]
结果如图2所示，乳酸克鲁维酵母裂解菌株jnxr-2101δe01057g与野生型jnxr-2101的生长及产乳糖酶状况几乎相同。培养至稳定期(48h)时，野生型jnxr-2101的胞外乳糖酶活性为0.67u/ml，菌株jnxr-2101δe01057g的胞外乳糖酶活性为2.23u/ml，为野生型的3.33倍。以上结果表明甘露糖蛋白e01057p的敲除有利于乳酸克鲁维酵母乳糖酶的分泌，且对于乳酸克鲁维酵母的生长几乎无影响。
[0055]
实施例3：乳酸克鲁维酵母快速裂解体系
[0056]
参照实施例2的方法培养乳酸克鲁维酵母至稳定期(48h)，发酵液5000
×
g离心5min，获得的菌体使用tris-hcl缓冲液(ph 7.5)洗涤2次后使用tris-hcl重悬，使其od
600
为0.7
±
0.03。1.5ml菌悬液加入5ml离心管中，加入不同浓度的裂解酶lyticase(按终浓度计1、5、10、20u/ml)，在30℃、300rpm振荡培养，每个实验设定3个平行，计算细胞裂解率od
600
(％)。
[0057]
结果如图3所示，添加1u/ml裂解酶，乳酸克鲁维酵母jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为24.43％、43.37％；添加5u/ml裂解酶，乳酸克鲁维酵母jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为42.46％、62.11％；添加10u/ml裂解酶，乳酸克鲁维酵母jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为48.28％、67.53％；添加20u/ml裂解酶，乳酸克鲁维酵母jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为44.06％、63.87％。添加1、5、10、20u/ml裂解酶lyticase均导致乳酸克鲁维酵母裂解，且随着反应时间和lyticase浓度的增加，裂解率逐渐增加。突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率始终高于野生型jnxr-2101，表明裂解突变菌株对于lyticase更敏感，细胞更易于快速裂解释放胞内活性物质。
[0058]
实施例4：乳酸克鲁维酵母快速裂解体系应用于酶活测定
[0059]
参照实施例3的方法处理乳酸克鲁维酵母菌悬液，加入lyticase反应不同的时间，
取样测定酶活。相对酶活：以使用fastprep-24破壁后测定的酶活为100％，裂解酶处理后的酶活除以fastprep-24破壁后的酶活即为裂解突变体的相对酶活。fastprep-24破壁是按照破壁程序设置振荡速度6.0m/sec、处理30s、10个循环。
[0060]
结果如图3所示，添加1u/ml裂解酶，野生型jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的相对酶活最高分别为38.89％、72.03％；添加5u/ml裂解酶，野生型jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为62.57％、99.96％；添加10u/ml裂解酶，野生型jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率最高分别为65.06％、95.54％；添加20u/ml裂解酶，野生型jnxr-2101及裂解突变体jnxr-2101δe01057g的裂解率分别为63.78％、89.55％。随着lyticase浓度的提高，乳酸克鲁维酵母快速被裂解。在5u/ml lyticase作用30min，乳糖酶的相对酶活即可达到与使用fastprep-24破壁相似的胞内乳糖酶蛋白释放效果(如图4)。裂解酶的添加可使裂解工程菌jnxr-2101δe01057g在短时间内充分裂解，释放胞内蛋白以用于检测，操作简便、作用条件温和，保证了目的蛋白活性，是一种具有应用前景的细胞破壁方法。
[0061]
实施例5：乳酸克鲁维酵母快速裂解体系应用于蛋白鉴定
[0062]
参照实施案例3的方法处理乳酸克鲁维酵母菌悬液(od
600
＝7.0)，添加裂解酶(1u/ml)，30℃、300rpm反应4h，10000
×
g离心5min收集上清液，通过sds-page和蛋白浓度测定比较突变体和野生型菌株的裂解效果。蛋白浓度使用bca蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天)测定，使用方法参照说明书。
[0063]
如图5a所示，加入1u/ml裂解酶lyticase反应4h，突变体菌株jnxr-2101δe01057g的裂解后释放到胞外的蛋白浓度为5.20mg/ml，野生型jnxr-2101裂解后释放到胞外的蛋白浓度为3.99mg/ml。如图5b所示，乳糖酶的目的条带为118kda，使用sds-page鉴定蛋白时裂解突变体的蛋白条带比野生型亮一些。以上结果进一步表明裂解突变体对于裂解酶的敏感性更强，裂解处理后释放更多的胞内物质。本发明构建的裂解方法作用条件温和、简洁易操作，可广泛应用于乳酸克鲁维酵母胞内物质的释放与鉴定。
[0064]
实施例6：乳酸克鲁维酵母冷场发射扫描电子显微镜观察
[0065]
将乳酸克鲁维酵母突变体jnxr-2101δe01057g和野生型jnxr-2101接种到ypl液体培养基中培养24h，以初始od
600
为0.3将种子液转接到50ml ypl培养基。培养至od
600
为1.0左右，稀释涂布至ypd固体平板，30℃静置培养3d。用无菌涂布棒将菌落轻刮下，使用pbs缓冲液重悬菌体，控制od
600
均为60，添加1000u/ml lyticase，30℃、300rpm分别反应10min，60min，。加入2.5％戊二醛固定液固定24h，用磷酸缓冲液清洗，依次使用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％酒精进行梯度脱水。冷冻干燥后制样并使用冷场发射扫描电镜观察。
[0066]
如图6冷场发射扫描电镜结果所示，klla0_e01057g基因的敲除对于乳酸克鲁维酵母的细胞形态无影响。不添加裂解酶lyticase时，野生型jnxr-2101和突变体菌株jnxr-2101δe01057g细胞几乎未发生裂解；当添加裂解酶lyticase时，突变体菌株jnxr-2101δe01057g裂解细胞多于野生型jnxr-2101裂解细胞。klla0_e01057g基因的敲除对于乳酸克鲁维酵母的细胞形态没有产生明显改变，提高了其对lyticase的敏感性，裂解工程菌的破壁效果优于野生型。
[0067]
实施例7：乳酸克鲁维酵母裂解工程菌5l罐发酵；
[0068]
挑取乳酸克鲁维酵母突变体jnxr-2101δe01057g和野生型jnxr-2101至50ml ypl液体培养基中，30℃、220rpm培养24h作为一级种子液。以初始od
600
为0.1转接到ypl培养基中培养24h作为二级种子液，将40ml种子液转接到5l发酵罐(装有2l发酵培养基)。发酵罐参数设置为培养温度30℃、空气流速4l/min、搅拌转速400rpm，发酵罐ph使用6mhcl和5m naoh自动控制为6.5。间隔8h取样测定发酵液的od
600
、酶活及乳糖浓度，乳糖浓度测定使用高效液相色谱(bio-rad aminex hpx-87h column,shimadzu 20a)。
[0069]
为了测定裂解工程菌大规模工业应用的潜力，使用5l发酵罐测定裂解工程菌jnxr-2101δe01057g和野生型jnxr-2101的酶活。发酵67h时裂解工程菌jnxr-2101δe01057g酶活最高可达159.62u/ml，发酵73h野生型jnxr-2101的酶活为146.70u/ml。表明甘露糖蛋白基因klla0_e01057g的敲除对于菌株的生长和蛋白质合成几乎无影响，酵母细胞更易于裂解，具有工业生产应用的潜能。
[0070]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.甘露糖蛋白编码基因在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的应用，其特征在于，所述甘露糖蛋白具有seq id no.2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是敲除或沉默所述甘露糖蛋白编码基因。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甘露糖蛋白编码基因具有如seq idno.1所示的核苷酸序列。4.一种乳酸克鲁维酵母工程菌，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母工程菌的甘露糖蛋白编码基因缺失或沉默；所述甘露糖蛋白编码基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的乳酸克鲁维酵母工程菌，其特征在于，以乳酸克鲁维酵母jnxr-2101为出发菌株。6.一种促进乳酸克鲁维酵母快速裂解释放胞内物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求4或5所述的乳酸克鲁维酵母工程菌，用一定浓度裂解酶处理所述乳酸克鲁维酵母工程菌的菌体细胞，使乳酸克鲁维酵母胞内物质释放到胞外。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的浓度为1～20u/ml，孵育时间为1～60min。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的反应浓度为5～20u/ml。9.含有权利要求4或5所述乳酸克鲁维酵母工程菌和裂解酶的试剂盒。10.权利要求4或5所述乳酸克鲁维酵母工程菌，或权利要求9所述试剂盒，或权利要求6～8任一所述方法在酶活检测、蛋白鉴定等方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用，属于生物工程技术。本发明提供了甘露糖蛋白在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的新用途，通过敲除甘露糖蛋白编码基因，提高乳酸克鲁维酵母对裂解酶Lyticase的敏感性，可使构建的乳酸克鲁维酵母工程菌裂解时间较短，30min内几乎可使细胞完全裂解。本发明的乳酸克鲁维酵母裂解方法操作简便，在酶活检测、蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。


技术研发人员：张国强 李江华 沈秀茹 陈坚 堵国成 廖灵通
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.12.20
技术公布日：2023/9/13