来源于棕榈炭的microRNA或其组合在制备止血药物中的应用

mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的引物。
11.有益效果：
12.棕榈炭是经过300℃的高温炒炭炮制形成的一味止血药。之前人们普遍认为rna 在这个过程中会被破坏。事实上，我们的数据表明，在经过300℃的高温炒炭炮 制过程，棕榈炭中不仅仍然富含ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p， 而且显著高于棕榈生品中ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的含量。 本研究通过生物信息学分析和体外研究发现ath-mir159a和cpa-mir159b均可以 结合adra2c的3'-utr，同时，ath-mir166a-3p可以结合t-pa的3'-utr并抑制 t-pa的表达。在小血管受到损伤后，受损的血管壁立即回缩，减小血管直径， 降低血流速度，从而导致受损部位血液的流出减少。血管收缩时神经反射、局部 血管肌源性收缩、来自血小板和受损组织释放的体液因子共同作用的结果。其中 肾上腺素和去甲肾上腺素，作用于局部血管，对局部组织血流起到重要调节作用。 adra2c主要分布在肾上腺嗜铬细胞和去甲肾上腺素能神经的突触前膜。通过抑 制腺苷酸环化酶(ac)-环磷酸腺苷(camp)-蛋白激酶a(pka)信号通路，促 进k
+
内流和抑制ca
2+
内流
14.，抑制肾上腺素的分泌。t-pa主要由血管内皮细胞和 受损的组织产生。t-pa激活纤溶酶原生成有活性的纤溶酶，从而促进止血栓溶 解液化
15.。因此，我们推测棕榈炭中ath-mir159a和cpa-mir159b可能通过靶向 adra2c的表达，促进肾上腺素的分泌，降低毛细血管的通透性，能增强毛细血 管对损伤的抵抗力，促进受损毛血管端收缩而参与棕榈炭的止血作用。同时，推 测棕榈炭中ath-mir166a-3p可以靶向抑制t-pa的表达，抑制纤溶系统激活，减 少止血栓溶解，从而进一步止血。因此，ath-mir159a、cpa-mir159b和 ath-mir166a-3p中的任意一种或其组合能够在制备止血药物中应用。
附图说明
13.图1棕榈生品和炭品small rna测序结果。
14.(a)agilent 2100生物分析仪检测图。(b)棕榈生品和棕榈炭small rna测序 结果热图。(c)棕榈生品和棕榈炭small rna测序中cpa-mir159b、ath-mir159a 和ath-mir166a-3p的统计图。
15.图2rt-qpcr检测每克棕榈生品及其制成炭药后所含ath-mir159a、cpa-mir159b 和ath-mir166a-3p水平的统计图。(a)棕榈生品、棕榈炭中ath-mir159a的统 计图。(b)棕榈生品、棕榈炭中cpa-mir159b的统计图。(c)棕榈生品、棕榈炭 中ath-mir166a-3p的统计图。mean
±
sd，n＝4-6。
16.图3生物信息学分析ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的作用靶 点和信号通路。(a)ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的作用靶点 的富集。(b)ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p靶点作用的信号通 路。
17.图4预测ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p与靶基因结合位点示 意图。(a)ath-mir159a与adra2c 3'-utr区结合位点示意图。(b)cpa-mir159b 与adra2c 3'-utr区结合位点示意图。(c)ath-mir166a-3p与t-pa 3'-utr区 结合位点示意图。结合位点(红色矩形)；结合自由能(
△
g)和mirna的种子序 列(红色)。
18.图5荧光素酶报告基因实验检测ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p 与靶基因adra2c和t-pa 3'-utr的结合情况。mean
±
sd，n＝3。
**
p＜0.01，
***
p ＜0.001与ncrna
相比。
19.图6体外检测ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p对adra2c和t-pa 的mrna表达情况。(a)hek293t细胞转染ath-mir159a后ath-mir159a统计图。 (b)hek293t细胞转染cpa-mir159b后cpa-mir159b统计图。(c)huvec细胞转 染ath-mir166a-3p后ath-mir166a-3p统计图。(d)hek293t细胞转染ath-mir159a后adra2c的mrna表达统计图。(e)hek293t细胞转染cpa-mir159b 后adra2c的mrna表达统计图。(f)huvec细胞转染ath-mir166a-3p后t-pa的 mrna表达统计图。mean
±
sd，n＝3。
*
p＜0.05，
***
p＜0.001与ncrna相比。
20.图7western blot检测ath-mir166a-3p对huvec细胞t-pa蛋白表达的影响。 mean
±
sd，n＝3。
**
p＜0.01与ncrna相比。
21.图8ath-mir166a-3p对huvec细胞t-pa分泌的影响。
22.mean
±
sd，n＝3。
**
p＜0.01与ncrna相比。
23.图9ath-mir166a-3p对huvec细胞分泌的t-pa激活纤溶酶原活性的影响。 mean
±
sd，n＝3。
***
p＜0.001与ncrna相比。
具体实施方式
24.一、材料和方法
25.1.实验材料
26.1.1细胞株
27.人体肾上皮细胞(hek293t)和人脐静脉内皮细胞(huvec)购自上海生命科 学院细胞所。
28.1.2主要实验试剂(见表1)
29.表1实验试剂信息
30.[0031][0032]
1.3主要实验仪器(见表2)
[0033]
表2主要仪器信息
[0034]
仪器名称公司5424r台式冷冻离心机eppendorfptc-1148pcr仪bio-raddyy-6c稳流稳压电泳仪普阳科学仪器研究所western blot显影仪天能clariostar全波长多功能酶标仪bmg labtech公司
[0035]
2.实验方法
[0036]
2.1细胞系培养
[0037]
(1)hek293t细胞培养
[0038]
hek293t细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem培养基(青霉素和链霉素各 100u/ml)，然后将细胞放置于温度为37℃，浓度为5％的co2细胞培养箱中培 养。
[0039]
(2)huvec细胞培养
[0040]
huvec细胞培养于含有10％胎牛血清的1640培养基(青霉素和链霉素各100 u/ml)，然后将细胞放置于温度为37℃，浓度为5％的co2细胞培养箱中培养。
[0041]
2.2棕榈炭的炮制
[0042]
煅烧前将棕榈去净杂质，并清洗干净，80℃烘干。锅内装20g棕榈生品， 未超过蒸发皿容量的1/3。焖煅时，上扣小蒸发皿，并加压重物。其衔接处，先 用湿纸堵塞，再用黄泥封固。扣锅上粘一张白纸条，待白纸变深黄色时熄火(300℃ 加热30min)。待药材凉透后，再出锅。
[0043]
2.3棕榈生品和炭药small rna测序
[0044]
将棕榈生品和棕榈炭进行粉碎和研磨，然后用40目滤网过滤。采用通用植物microrna提取试剂盒提取2g棕榈生品和棕榈炭粉末中的smallrna，实验步骤按照说明书操作，然后使用nanodrop2000检测rna浓度。将提取的smallrna送华大公司进行smallrna测序，并由华大公司完成数据分析。
[0045]
2.4rna提取和rt-qpcr检测
[0046]
(1)将棕榈生品和棕榈炭进行粉碎和研磨，然后用40目滤网过滤。取棕榈生品和棕榈炭粉末。取1g榈生品和棕榈炭粉末加入100ml水中煮沸30min，得到5ml榈生品和棕榈炭汤。采用通用植物microrna提取试剂盒提取棕榈生品和棕榈炭粉末及汤中的smallrna，实验步骤按照说明书操作，然后使用nanodrop2000检测rna浓度。采用abi公司的探针法进行植物mirna的定量检测，mirna逆转录反应体系如下：depctreatedwater3.5μl，5
×
amvbuffer2μl，10mmdntp1μl，rtproke1μl，amv酶0.5μl，rna2μl。逆转录程序如下：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃∞。利用探针法进行mirna定量检测，反应体系和程序如下：ddh2o14.77μl，10
×
pcrbuffer2μl，mgcl21.2μl，dntpmixture0.4μl，tmproke0.33μl，taq酶0.3μl，cdna1μl。pcr反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃15sec，退火60℃60sec)40个循环。mirna表达水平mirna标准品进行绝对定量。
[0047]
(2)将细胞加入1ml的trizol，涡旋20sec，室温静置10min；加入200μl的氯仿，涡旋20sec，室温放置10min；4℃，16000g
×
20min离心；吸取上清至一个新的除酶ep管中，加入800ul的异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min；4℃，16000g
×
20min离心，弃上清；然后，加入1ml75％的depc水配置的乙醇，涡旋混匀，4℃，16000g
×
20min离心，弃上清；室温晾干；加入depc水溶解，使用nanodrop2000检测rna浓度。mirna逆转录反应体系如下：depc-treatedwater-3.25μl，5
×
amvbuffer-2μl，10mmdntp-1μl，rtprimer-1μl，amv酶-0.5μl，rri0.25μl，rna-2μl。逆转录程序如下：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃∞；mrna逆转录反应体系如下：depc-treatedwater-3.25μl，5
×
amvbuffer-2μl，10mmdntp-1μl，oligodt-1μl，amv酶-0.5μl，rri0.25μl，rna-2μl。利用sybrrgreen法进行mrna定量检测，反应体系和程序如下：ddh2o-11.5μl，taq酶-0.3μl，10
×
pcrbuffer-2μl，sybrgreen-1μl，mgcl
2-1.2μl，dntpmixture-1μl，forwardprimer-1μl，reverseprimer-1μl，cdna-1μl。pcr反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃15sec，退火60℃60sec，延伸72℃30sec)40个循环，终止延伸72℃10min。adra2c和t-pamrna表达水平采用gapdh作为内参。mrna引物序列由金斯瑞公司合成，引物合成序列如下：
[0048]
表3引物序列
[0049][0050]
2.5蛋白提取和western blot检测
[0051]
收集细胞加ripa裂解液，冰上裂解30min；4℃，16000g
×
20min离心， 取上清于一个新的ep管；然后，采用bca法检测蛋白浓度。加入5
×
loadingbuffer，99℃金属浴加热10min，-80℃保存蛋白样品。根据page凝胶快速制 备试剂盒(12.5％)说明书配制sds-page胶，上样50μg，80v电泳30min， 120v电泳1.5h，300ma转膜1.5h，5％的脱脂牛奶封闭1h。一抗稀释浓度 如下：anti-t-pa antibody(1：2000)，anti-gapdh antibody(1：1000)，一 抗孵育过夜。第二天tbst洗膜10min
×
4次，加入鼠二抗(1：1000)孵育30min，tbst洗膜10min
×
4次。使用omni-ecltm增强型化学发光检测试剂盒于曝光仪上 曝光，使用image j软件分析条带灰度值。
[0052]
2.6荧光素酶报告基因实验
[0053]
为了验证ath-mir159a和cpa-mir159b与adra2c mrna的相互作用及 ath-mir166a-3p与t-pa mrna的相互作用，采用荧光素酶报告基因实验验证 ath-mir159a和cpa-mir159b与adra2c mrna的3'-utr结合及ath-mir166a-3p 与t-pa mrna的3'-utr结合。首先，构建野生型(wild type，wt)荧光素酶报 告质粒，将包含mirna结合位点的mrna的3'-utr序列片段插入到pgl3-basic 载体(金斯瑞公司)。同时，将结合位点序列突变也插入到pgl3-basic载体，构 成突变型(mutant type，mut)荧光素酶报告质粒。采用β-半乳糖苷酶报告质 粒(β-gal)作为对照校正操作误差，与荧光素酶报告质粒同时转染细胞。在 24孔板中分别接种hek293t细胞和huvec细胞，等细胞密度达到70％左右，将 0.2μg的wt/mut荧光素酶报告质粒与0.1μg的β-半乳糖苷酶报告质粒同时转 染到细胞，β-gal质粒作为对照校正操作误差。24h后采用promega公司的 luciferase assay system试剂盒，按照操作说明进行荧光素酶报告基因实验。
[0054]
2.7elisa法检测huvec细胞培养液t-pa水平
[0055]
收集huvec细胞培养液，采用t-pa的elisa试剂盒(dtpa00，r&d systems) 并参照说明书进行检测。
[0056]
2.8合成发光底物法检测纤溶酶活性
[0057]
huvec细胞培养液20μl加入1μg/μl的纤溶酶原(p7999-10un，sigma) 40μl，然后加2mg/ml的入底物(s-2251，chromogenix)至终浓度为0.5mm。 然后，立即用酶标仪405nm波长
pa)的相互作用，采用荧光素酶报告基因实验验证ath-mir159a、 cpa-mir159b和ath-mir166a-3p与靶mrna的3'-utr的结合。如图5所示， hek239t细胞都转染了adra2c荧光素酶报告质粒，与共转染对照mimic相比， 共转ath-mir159a或cpa-mir159b均显著降低了荧光素酶的活性。huvec细胞都 转染了t-pa荧光素酶报告质粒，与共转染对照mimic相比，共转ath-mir166a-3p 显著降低了荧光素酶的活性。另外，转染了插入结合位点突变的荧光素酶报告质 粒后，过表达ath-mir159a、cpa-mir159b或ath-mir166a-3p对荧光素酶的活性 均没有影响(图5)。以上实验结果证实了ath-mir159a、cpa-mir159b可以与 adra2c mrna的3'-utr可以结合，ath-mir166a-3p可以与t-pa mrna的3'-utr 可以结合。
[0071]
6.ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p对靶基因adra2c和t-pa mrna 表达无显著影响
[0072]
如图6所示，采用hek293t细胞，体外分别转染ath-mir159a和cpa-mir159b mimic检测adra2c的mrna表达；采用huvec细胞，体外转染ath-mir166a-3p mimic，检测t-pa的mrna表达。rt-qpcr检测结果显示，hek293t细胞分别转染 ath-mir159a和cpa-mir159b mimic后，显著增加了hek293t细胞ath-mir159a 和cpa-mir159b mimic的表达(图6a-b)，而adra2c的mrna表达没有显著变化 (图6d-e)。huvec细胞转染ath-mir166a-3p mimic后，显著增加了huvec细胞 ath-mir166a-3p mimic的表达(图6c)，而t-pa的mrna表达没有显著变化(图 6f)。
[0073]
7.ath-mir166a-3p抑制huvec细胞t-pa的蛋白表达
[0074]
如图7所示，huvec细胞体外转染ath-mir166a-3p mimic，western blot 检测t-pa的蛋白表达。转染48h后，western blot检测结果显示ath-mir166a-3p mimic显著下调t-pa的蛋白表达。
[0075]
8.ath-mir166a-3p抑制huvec细胞t-pa的分泌
[0076]
如图8所示，huvec细胞体外转染ath-mir166a-3p mimic，采用elisa检测 huvec细胞培养液t-pa的分泌。结果显示，ath-mir166a-3p显著减少huvec细 胞t-pa的分泌。
[0077]
9.ath-mir166a-3p减少huvec细胞分泌的t-pa对纤溶酶原的激活
[0078]
如图9所示，huvec细胞体外转染ath-mir166a-3p mimic，采用合成发光底 物法测定huvec细胞分泌的t-pa对纤溶酶原的激活。结果显示ath-mir166a-3p mimic显著的减少了huvec细胞分泌的t-pa对纤溶酶原的激活。
[0079]
结论：
[0080]
一、本发明鉴定了棕榈炭中的mirnas，并明确了棕榈炮制成炭药之后mirnas 的变化。
[0081]
二、棕榈炭中ath-mir159a和cpa-mir159b可以与adra2c的3'-utr结合。
[0082]
三、棕榈炭中ath-mir166a-3p可以靶向抑制huvec细胞t-pa的表达和分泌。

技术特征：
1.来源于棕榈炭的microrna或其组合在制备止血药物中的应用，所述的来源于棕榈炭的microrna选自ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p中的任意一个。2.ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的组合作为靶标在棕榈炭质量控制或疗效评估中的应用。3.检测ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的试剂在棕榈炭质量控制或疗效评估中的应用。4.一种用于棕榈炭质量控制或疗效评估的试剂盒，其特征在于包含检测ath-mir159a、cpa-mir159b和ath-mir166a-3p的引物。

技术总结
本发明公开了来源于棕榈炭的microRNA或其组合在制备止血药物中的应用。来源于棕榈炭的microRNA或其组合在制备止血药物中的应用，所述的来源于棕榈炭的microRNA选自ath-miR159a、cpa-miR159b和ath-miR166a-3p中的任意一个。本研究鉴定了棕榈炭中的miRNAs，并明确了棕榈炮制成炭药之后miRNAs的变化。棕榈炭中ath-miR159a和cpa-miR159b可以与ADRA2C的3'-UTR结合。棕榈炭中ath-miR166a-3p可以靶向抑制HUVEC细胞t-PA的表达和分泌。PA的表达和分泌。PA的表达和分泌。


技术研发人员：孔令东 高志影 潘颖
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2023/9/13