具有优异的微生物细胞质洗脱效果的新型抗微生物肽的制作方法

1.本公开内容涉及抗微生物肽、其衍生物或其片段；编码所述抗微生物肽、其衍生物或其片段的多核苷酸；以及含有所述抗微生物肽、其衍生物或其片段的用于外用皮肤制剂的载体、化妆品组合物、准药物组合物(a quasi-drug composition)和药物组合物。


背景技术：

2.目前，为了应对疾病大规模流行时代，对具有优异抗微生物能力的产品的需求与日俱增，并且越来越多地，正在进行各种尝试来开发抗微生物产品。为此，正在进行天然抗生素的研究和开发。
3.具体地，尽管天然产物衍生的抗生素，如含有植物提取物作为活性成分的抗微生物组合物(韩国专利公开号10-2020-0017912)是已知的，但天然产物如提取物具有大的粒径，仅从天然产物中难以获得显著效果，并且已经出现了开发抗微生物物质的需求。
4.公开内容
5.技术问题
6.本公开内容的发明人已经通过证实本公开内容的抗微生物肽与其它肽相比在抗微生物效果方面显著优越而完成了本公开内容。
7.技术方案
8.本公开内容的目的是提供抗微生物肽、其衍生物或其片段。
9.本公开内容的另一个目的是提供编码抗微生物肽、其衍生物或其片段的多核苷酸。
10.本公开内容的另一个目的是提供用于外用皮肤制剂的载体，其含有抗微生物肽、其衍生物或其片段。
11.本公开内容的另一个目的是提供包含抗微生物肽、其衍生物或其片段的化妆品组合物。
12.本公开内容的另一个目的是提供包含抗微生物肽、其衍生物或其片段的准药物组合物。
13.本公开内容的另一个目的是提供含有抗微生物肽、其衍生物或其片段的药物组合物。
14.有益效果
15.与其它肽相比，本公开内容具有显著增加的抗微生物活性和降低的毒性，并且可以预期在诸如防腐剂、药物和化妆品的工业中得到工业利用。
16.附图简述
17.图1是说明证实seq id no:1的肽与已知肽相比的抗微生物活性和细胞毒性的结果的图；
18.图2是说明证实seq id no:2的肽与seq id no:1的肽相比的抗微生物活性和细胞毒性的结果的图；
19.图3是说明证实seq id no:2和seq id no:5至seq id no:8的肽的抗微生物活性和细胞毒性的结果的图；
20.图4是说明证实seq id no:2至seq id no:4的肽的抗微生物活性和细胞毒性的结果的图；
21.图5是说明证实本公开内容的抗微生物肽对大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(candida albicans)的抗微生物效果的结果的图；以及
22.图6是说明使用扫描电子显微镜(sem)分析本公开内容的抗微生物肽对大肠杆菌的抗微生物效果的结果的图。
23.发明详述
24.在下文中，将如下详细描述本公开内容的内容。同时，本公开内容中所公开的方面的描述和实施方案也可应用于关于共同事项的另一方面的描述和实施方案。此外，本文所公开的各种元件的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，不能认为本公开内容的范围受以下描述的具体描述的限制。
25.本公开内容的一个方面提供了由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
26.在本公开内容中，“抗微生物肽”意指具有抗微生物活性的肽。由于抗微生物活性不受微生物种类的限制，因此术语“抗微生物”可以与抗细菌、抗真菌和抗生素互换使用。具体地，本公开内容的抗微生物肽可以包括seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个，并且还可以包括seq id no:5至seq id no:8中任一个的衍生物或其片段，只要其具有抗微生物活性即可。
27.抗微生物肽可以是由先天免疫系统(初级防御)表达的物质，以保护各种物种(如植物、昆虫、两栖动物、哺乳动物和人类)中的对象免受微生物(如细菌)的侵害，并且与现有的抗生素相比可以具有优异的抗微生物能力和很小的抗性，但不限于此，只要其作为抗微生物肽起作用即可。
28.本公开内容的抗微生物肽不受限于结构等，只要其具有抗微生物活性即可。微生物不受限制，只要其包括在微生物的类别中，并且可以包括所有细菌、真菌等，并且不受限制，这取决于种类和来源。
29.具体地，由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段可抑制选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌中的任何一种或多种的生长，但不限于此。
30.在本公开内容的实施例中，已经证实了由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽及其衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和/或白色念珠菌具有抗微生物活性(实施例2)。
31.在本公开内容中，“衍生物”意指由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽的衍生物，具体地可以是具有氨基酸序列的肽，在所述氨基酸序列中，一些官能团被添加到seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中或者一些氨基酸序列被缺失、修饰、取代或添加，但不限于此。
32.具体地，本公开内容中的衍生物可以是选自seq id no:1至seq id no:4的任一个
或多个，可以作为抗微生物肽起作用(与由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列组成的抗微生物肽一样)，并且所述抗微生物肽如上所述。
33.由本公开内容的seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列组成的抗微生物肽及其衍生物在具有由以下化学式1表示的序列时可以具有抗微生物活性，但不限于此。
34.[化学式1]
[0035]
[x1–
x2–
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–
phe
–
x3–
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ile
–
leu
–
x5–
tyr
–
leu
–
x6]
[0036]
在化学式1中，x1至x6可以选自碱性氨基酸，并且可以选自精氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。优选地，由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽及其衍生物可以具有由化学式1表示的序列，并且本公开内容的衍生物可以由seq id no:1至seq id no:4的氨基酸序列组成，但不限于此。
[0037]
seq id no:1:h2n
–
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–
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–
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–
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–
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–
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–
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[0038]
seq id no:2:h2n
–
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[0039]
seq id no:3:h2n
–
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–
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[0040]
seq id no:4:h2n
–
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[0041]
seq id no:5:h2n
–
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–
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–
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[0042]
seq id no:6:h2n
–
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–
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[0043]
seq id no:7:h2n
–
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–
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co2h以及
[0044]
seq id no:8:h2n
–
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–
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–
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–
leu
–
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–
tyr
–
leu
–
arg]
–
co2h。
[0045]
具体地，所述衍生物可以是这样的衍生物，其中对应于选自由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽的n-末端的第1位、第2位、第5位、第6位、第9位和第12位的任一个位置的氨基酸被另一种碱性氨基酸取代。
[0046]
氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质而发生。具体地，在带电荷的氨基酸中，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸(r)、赖氨酸(k)和组氨酸(h)，带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸(e)和天冬氨酸(d)；在不带电荷的氨基酸中，非极性氨基酸包括甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)和脯氨酸(p)，极性或亲水性氨基酸包括丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、酪氨酸(y)、天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)以及非极性氨基酸中的芳族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
[0047]
在本公开内容中，“用另一种碱性氨基酸取代”不受限制，只要其用不同于取代之前的氨基酸的碱性氨基酸取代即可。换句话说，所述取代可以是在取代之前用另一种碱性氨基酸取代氨基酸，所述取代存在于选自由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的
任一个组成的抗微生物肽的n-末端的第1位、第2位、第5位、第6位、第9位和第12位的任一个位置，并且具体地可以是在选自x1、x2、x3、x4、x5和x6位置的任何一个位置上存在的氨基酸被另一种碱性氨基酸取代。具体地，碱性氨基酸可以选自组氨酸、赖氨酸或精氨酸，并且可以是赖氨酸或精氨酸，但不限于此。
[0048]
出于本公开内容的目的，由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽的衍生物可以是选自seq id no:1至seq id no:4的任何一个或多个，但不限于此。
[0049]
在本公开内容的实施例中，已经证实了seq id no:5至seq id no:8的肽及其衍生物，seq id no:1至seq id no:4的肽具有由化学式1表示的结构并具有抗微生物活性(实施例2)。
[0050]
具体地，在本公开内容的实施例中，已经证实了由化学式1表示的氨基酸序列组成的抗微生物肽或其衍生物的抗微生物活性是优异的，并且已经证实了更具体地seq id no:1、seq id no:2和seq id no:5至seq id no:8，还更具体地seq id no:5至seq id no:8，特别具体地seq id no:6的抗微生物活性是显著优异的(实施例1和实施例2)。
[0051]
在本公开内容中，“片段”是指具有特定序列的肽的部分序列，可以是由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽或其衍生物的部分序列，并且可以具有与抗微生物肽或其衍生物一样的抗微生物活性。
[0052]
由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段可以衍生自天然产物，但不限于此，并且可以包括与抗微生物肽、其衍生物或其片段具有相同活性的序列，但不限于此。
[0053]
本公开内容中的抗微生物肽被描述为由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段，但不排除在由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段的氨基酸序列之前和之后的无意义的序列添加或者使抗微生物肽能够保持与抗微生物肽相同功能的沉默突变，并且对于本领域技术人员来说，具有与由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段相同或等效活性的那些对应于本公开内容的抗微生物肽是显而易见的。作为具体实例，本公开内容的抗微生物肽可以是由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽，其衍生物，其片段或由与其具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列组成的肽。
[0054]
在本公开内容中，即使当被描述为“含有描述为特定序列号的氨基酸序列的肽”、“由描述为特定序列号的氨基酸序列组成的肽”或“具有描述为特定序列号的氨基酸序列的肽”时，显而易见的是具有其中一些序列被缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的肽也可用于本公开内容中，只要所述肽具有与由相应序列号的氨基酸序列组成的肽的活性相同或等效的活性。其实例包括在氨基酸序列的n-末端和/或c-末端具有不改变肽功能的序列添加的肽，可天然发生的突变，其沉默突变或保守取代。
[0055]“保守取代”意指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。通常，保守取代对肽的活性几乎没有影响或没有影响。
[0056]
本公开内容的肽可以通过在一个或多个氨基酸或者适当保护的氨基酸与恒定键
合到固相的氨基酸主链之间连续形成酰胺键来制备，但不限于此。可以在不显著降低稳定性的范围内用其它氨基酸插入、取代或缺失该肽，并且这也落入在本公开内容的范围内。
[0057]
本公开内容的肽可以制备成其中促进细胞内迁移的细胞可渗透肽与c-末端或n-末端键合的形式。例如，细胞可渗透肽可以是tat肽(arg
–
lys
–
lys
–
arg
–
arg
–
tyr
–
arg
–
arg
–
arg)和tat-ptd肽(gly
–
arg
–
lys
–
lys
–
arg
–
arg
–
gln
–
arg
–
arg
–
arg:tat-ptd)，但本公开内容不限于此，并且可以使用本领域已知的任何细胞可渗透肽，只要其不抑制根据本发明公开内容的肽的活性。
[0058]
本公开内容的肽和化合物可以以金属络合物的形式制备，并且金属可以选自铜、镁、钙、铁、锌、镍、银、锗和镓，但不限于此，并且可以优选使用铜，但金属不限于此。
[0059]
同时，本公开内容的肽可以以盐的形式存在。可用于本公开内容的盐的形式可以在化合物的最终分离和纯化期间形成，或者通过使氨基与适当的酸反应来形成。例如，酸加成盐可以是乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐，但不限于此。可用于形成酸加成盐的酸的实例包括无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸，但不限于此。优选地，本公开内容的肽可以以三氟乙酸盐或乙酸盐的形式制备。
[0060]
用于制备包含在本公开内容的组合物中的肽的氨基酸的氨基或羧基可以被合适的保护基保护。受保护的氨基酸可以在溶液中通过与固体支持物连接或通过在适于形成酰胺键的条件下加入下一个氨基酸而进行反应。在加入用合适的保护基保护的氨基酸之前，可以完全去除保护基。在根据需要连接所有氨基酸后，可以将氨基酸顺序或同时与游离的残留保护基和游离的固体支持物分离，以获得最终所需的肽。
[0061]
作为用于制备本公开内容的肽化合物的最优选的合成方法，可以使用固相肽合成方法，其中使用固相聚合物支持物进行合成，并且通过该方法制备的肽的α-氨基可以被酸或碱敏感官能团保护。此时，要求氨基酸的保护基具有在缩合反应形成肽的条件下稳定的性质，并且要求氨基酸的保护基具有容易去除而不破坏延长的肽链或不使其中包含的任何手性中心外消旋化的性质。因此，合适的保护基可以是9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、叔丁氧基羰基(boc)、苄氧基羰基(cbz)、联苯基异丙基-氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、(α,α)-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、o-硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基羰基等，并且本领域已知的其它合适的保护基也可以在本公开内容的范围内用于该目的。
[0062]
9-芴基甲氧基羰基(fmoc)保护基可以用作本公开内容的肽合成中使用的氨基酸的最优选的保护基。
[0063]
特别地，作为本公开内容的肽合成中使用的氨基酸残基的保护基，叔丁基(t-bu)对于n-甲基谷氨酸是优选的；叔丁氧基羰基(boc)对于赖氨酸是优选的；7叔丁基(t-bu)对于丝氨酸是优选的；叔丁基(t-bu)对于苏氨酸和别苏氨酸是优选的；以及三苯甲基(trt)对于半胱氨酸是优选的，但本公开内容不限于此。
[0064]
在固相肽合成方法中，可以将c末端氨基酸连接到合适的固体支持物或树脂上。用于合成的合适的固体支持物优选是对用于逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件是惰性的并且不溶于所使用的介质中的物质，并且可以是例如2-氯三苯甲基氯树脂、rink酰胺或rink酰胺4-甲基苄基羟胺(4-methylbenzylhydrylamine)树脂(rink amid mbha树脂)。
[0065]
特别地，c-末端肽的优选固体支持物可以是可商购自novabiochem corporation的2-氯三苯甲基氯、rink酰胺或rink酰胺4-甲基苄基羟基胺树脂(rink amid mbha树脂)。
[0066]
在存在或不存在4-二甲基氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)、n-甲基吗啉(nmm)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻-六氟磷酸酯(bop)或双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(bopci)的情况下在溶剂如二氯甲烷、n-甲基吡啶酮(nmp)或dmf中在10℃至50℃的温度下，优选在30℃的温度下通过用羧酸活化n,n
’‑
二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n
’‑
二异丙基碳二亚胺(dic)、[六氟磷酸酯o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓](hatu)或六氟磷酸酯o-苯并三唑-1-基-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲鎓(hbtu)保持1至24小时，可以将c末端酰胺通过缩合而缩合(键合、偶联)到树脂或固相支持物。
[0067]
当固体支持物是rink酰胺4-甲基苄基羟基胺树脂时，作为优选保护基的fmoc官能团在与c-末端氨基酸缩合之前用过量的仲胺溶液，优选哌啶在dmf中的20％溶液切割。用于将所需氨基酸缩合到脱保护的4-(2',4'-二甲氧基苯基-fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂的优选试剂是用于缩合反应的试剂，如在dmf溶剂用于适当保护的氨基酸的n-甲基吗啉(nmm)、1-羟基苯并三唑(hobt)和[六氟磷酸酯o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓](hatu)、六氟磷酸酯o-苯并三唑-1-基-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲鎓(hbtu)、n,n
’‑
二环己基碳二亚胺(dcc)或n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)。
[0068]
在本公开内容中进行的氨基酸的连续缩合可以直接使用相关领域广泛已知的自动肽合成仪或手动进行。作为合成反应的优选条件，用fmoc基团保护的α-氨基酸可以通过用仲胺溶液(优选哌啶)处理来脱保护，然后用足够过量的溶剂洗涤，随后可以以3至7倍摩尔过量添加要缩合的其它相应的受保护的氨基酸，并且该反应可以优选在dmf溶剂中进行。
[0069]
在使用本公开内容的固态树脂的肽合成的最后阶段，可以连续地或在单个操作中从树脂中去除要获得的肽，并且可以将保护相应氨基酸残基的保护基脱保护。作为从树脂中去除肽和使存在于残基中的保护基脱保护的条件，通常切割树脂-肽键的切割试剂的混合物，例如含有三氟乙酸(tfa)、三异丙基硅烷(tis)、茴香硫醚、水或乙二硫醇(edt)等的二氯甲烷混合的混合物溶液可用于处理。以这种方式获得的混合溶液可以用储存在冰箱中的过量乙醚溶剂处理以形成沉淀物。通过离心使如上所述获得的沉淀物完全沉淀，并且首先去除过量的三氟乙酸、三异丙基硅烷、茴香硫醚、水、乙二硫醇等，并且将该程序重复两次或更多次，由此可以获得固化的沉淀物。此时，可以使用由水和乙腈溶剂组成的混合溶剂和反相高效液相色谱(hplc)分离和纯化完全脱保护的肽盐。分离和纯化的肽溶液可以完全浓缩并通过冻干干燥以获得固体肽。
[0070]
本公开内容的另一方面提供了编码由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段的多核苷酸。
[0071]
seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个以及抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0072]
具体地，由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物
肽可以由化学式1表示的序列组成，并且衍生物可以由选自seq id no:1至seq id no:4的任一个序列组成，但本公开内容不限于此。
[0073]
抗微生物肽、其衍生物或其片段可以由选自seq id no:9至seq id no:16的任一个序列编码，但不限于此。
[0074]
在本公开内容中，seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列或其衍生物可以由例如含有seq id no:9至seq id no:16的核酸序列的多核苷酸编码。
[0075]
在本公开内容中，“多核苷酸”是核苷酸的聚合物，其中核苷酸单体通过共价键以长链形状连接，并且意指具有一定长度或更长的dna或rna链。在本公开内容中，多核苷酸可以编码表现出具有seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列的抗微生物肽、其衍生物或其片段的活性的肽，但不限于此。
[0076]
多核苷酸可以包括但不限于编码具有根据本公开内容的抗微生物肽、其衍生物或其片段的活性的肽的任何多核苷酸。
[0077]
具体地，编码表现出抗微生物肽、其衍生物或其片段的活性的肽的多核苷酸可以包括编码如化学式1所述的氨基酸、抗微生物肽、其衍生物或其片段的核酸序列。由于密码子简并性或考虑到在不改变肽的氨基酸序列的范围内旨在表达肽的有机体中优选的密码子，可以对多核苷酸的编码区进行各种修饰。多核苷酸可以包括例如seq id no:9至seq id no:16的核酸序列，并且可以由与其具有80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者更具体地99％或更多同源性或同一性的核酸序列组成，但不限于此。
[0078]
本公开内容的多核苷酸可以在严格条件下与探针，例如与核酸序列的全部或部分互补的序列杂交，以包括但不限于编码seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列、其衍生物或其片段的任何序列。“严格条件”意指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中具体描述(例如，j.sambrook等人)。其实例包括其中具有高度同源性或同一性的多核苷酸，即具有40％或更多，具体地90％或更多，更具体地95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多或者更具体地99％或更多同源性或同一性的多核苷酸彼此杂交的条件，以及具有与其相比更低的同源性或同一性的多核苷酸彼此不杂交的条件；或者其中洗涤在对应于60℃,1
×
ssc和0.1％ sds，具体地60℃,0.1
×
ssc和0.1％sds，更具体地68℃,0.1
×
ssc和0.1％ sds的盐浓度和温度下进行1次，具体地2至3次的条件，其是常规southern杂交的洗涤条件。
[0079]
杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于dna，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容的多核苷酸还可以包括基本上相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。
[0080]
具体地，可以使用杂交条件(包括在55℃的tm值下的杂交步骤)和使用上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地调节。
[0081]
用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些参数是本领域熟知的(参见sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
[0082]
在本公开内容中，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核酸序列
之间的结合程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可互换使用。
[0083]
保守多核苷酸或肽的序列同源性或同一性通过标准比对算法确定，并且可以一起使用由所使用的程序建立的默认空位罚分。基本上同源或相同的序列通常能够在中等或高度严格条件下沿着全长序列的全部或至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。显然，考虑到多核苷酸中的密码子简并性，杂交也包括含有一个或多个常见密码子的多核苷酸。
[0084]
任何两个多核苷酸或肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法，如“fasta”程序，例如，使用与pearson等人,(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:2444中相同的默认参数来确定。可选地，可以使用如在emboss包(emboss:the european molecular biology open software suite,rice等人,2000,trends genet.16:276
–
277)(版本5.0.0或更高)(包括gcg程序包(devereux,j.,et al,nucleic acids research 12:387(1984))的needleman程序中进行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443
–
453)、blastp、blastn、fasta(atschul,s.f.等人,j molec biol 215:403(1990)；guide to huge computers,martin j.bishop,ed.,academic press,san diego,1994以及carillo等人(1988)siam j applied math 48:1073)确定同源性、相似性或同一性。例如，国家生物技术信息数据库中心(the national center for biotechnology information database)的blast或clustalw可以用于确定同源性、相似性或同一性。
[0085]
多核苷酸或肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如gap计算机程序，如needleman等人,(1970),j mol biol.48:443，如例如smith和waterman,adv.appl.math(1981)2:482中所记载的，来比较序列信息确定。总之，使用gap程序，同源性、相似性或同一性可以通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数而获得的值来定义。gap程序的默认参数包括(1)二进制比较矩阵(含有值1用于同一性以及0用于非同一性)和gribskov等人,(1986)nucl.acids res.14:6745(或ednafull(emboss version of ncbi nuc4.4)替代矩阵)的加权比较矩阵，如schwartz和dayhoff编,atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,pp.353
–
358(1979)所公开的；(2)对于每个空位为3.0的罚分和对于每个空位中的每个符号为0.10的另外罚分(或10的空位开放罚分，0.5的空位扩展罚分)；以及(3)对于末端空位无罚分。
[0086]
任何两个多核苷酸或肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下通过southern杂交实验比较序列来证实。所定义的适当杂交条件在本领域技术范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法(例如，j.sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第2版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,1989；f.m.ausubel等人,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,inc.,new york)确定。
[0087]
本公开内容的另一方面提供了用于外用皮肤制剂的载体，其含有由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
[0088]
seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个以及抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0089]
在本公开内容中，“载体”意指可以支持任何物质或组分并且由组合物示例的载
体，并且可以与运载试剂、浸渍试剂或中介物互换使用。作为载体的一个实例的组合物可以通过应用方式如手、蓬松物、尖端或刷子施用和递送至皮肤。
[0090]
载体可以包含在化妆品组合物、药物组合物或准药物组合物中，但不限于此。出于本公开内容的目的，载体可以含有由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
[0091]
在本公开内容中，“外用皮肤制剂”意指应用至皮肤的制剂。在本公开内容中，外用制剂的形状等不受限制，只要外用制剂是应用至皮肤的制剂，并且外用制剂可进一步分为软膏剂、霜剂、洗剂、凝胶等，但不限于此。
[0092]
具体地，软膏剂可以是半固体外用制剂，其中应用至皮肤的主要组分溶解或分散在基质中。取决于组分，基质可以分成油和脂肪软膏剂以及水溶性软膏剂。使用油性基质的软膏剂可具有皮肤软化作用，具有优异的密封性并适合用于伤口，但具有不容易去除的缺点。当局部渗透由于皮肤样脂溶性性质和皮肤软化作用而几乎不渗透皮肤的组分时，使用油性基质的软膏剂可以是有利的制剂。
[0093]
软膏剂通常由油相如油组成，因此保湿性优异，有利于脂溶性组分的渗透，但具有粘性的缺点。霜剂可以是以油包水型乳化的半固体外用制剂，并且可以是其中通过将油相与水相混合来改善软膏剂的粘性的制剂。作为乳化方法，可以使用表面活性剂或通过特殊方法进行混合，以将油相与水相混合。霜剂可以是比软膏剂更容易应用和去除的制剂，洗剂是比霜剂具有更多水样性质的制剂，并且可以是其中将主要组分溶解、乳化或精细分散在水性液体中的外用制剂。洗剂可以是使用主要组分、添加剂和纯净水制成均匀的溶液、悬浮液或乳液。凝胶可以是由被液体渗透的具有高分子量的有机分子组成的半固体外用制剂。在凝胶中，胶凝剂可以分散在水溶液中，并且可以使用胶凝剂，如卡波姆或合成聚合物。根据活性成分、使用目的、使用方法等，可以使用各种溶剂，并且本公开内容的外用制剂不限于此。
[0094]
本公开内容的另一方面提供了化妆品组合物，其含有由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
[0095]
seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个以及抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0096]
在本公开内容中，化妆品组合物可以制备成选自以下的制剂：溶液、外用软膏剂、霜剂、泡沫、营养洗剂、软化洗剂、香料、包裹、软化水、乳状洗剂、化妆基料、香精、液体清洁剂、沐浴添加剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、洗剂、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉末粉底、乳液粉底、蜡状粉底、贴剂和喷雾剂，但不限于此。
[0097]
本公开内容的化妆品组合物还可以含有在一般皮肤化妆品中共混的一种或多种化妆品可接受的载体，并且例如，油组分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、着色剂、防腐剂、芳香剂等可以作为通常的组分适当地共混，但化妆品组合物不限于此。
[0098]
包含在本公开内容的化妆品组合物中的化妆品可接受的载体根据化妆品组合物的配方而变化。
[0099]
当本公开内容的制剂是软膏剂、糊剂、霜剂或凝胶、动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等时，可用作载体组分，但载体组分不限于此。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。
[0100]
当本公开内容的制剂是粉末或喷雾剂时，可以将乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等用作载体组分，特别是在喷雾剂的情况下，可以另外含有推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚，但载体组分不限于此。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。
[0101]
当本公开内容的制剂是溶液或乳液时，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体组分，例如，可以使用水、甘油、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油等，特别是可以使用棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪酸酯和聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，但载体组分不限于此。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。
[0102]
当本公开内容的制剂是悬浮液时，可以将液体稀释剂如水、甘油、乙醇或丙二醇；悬浮剂，如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶用作载体组分，但载体组分不限于此。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。
[0103]
当本公开内容的制剂是肥皂时，可以将脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白水解产物、羟乙基磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪醇、植物油、甘油、糖等用作载体组分，但载体组分不限于此。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。
[0104]
本公开内容的另一方面提供了准药物组合物，其含有由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
[0105]
seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个以及抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0106]
在本公开内容中，“准药物”是指在用于诊断、治疗、改善、减轻、治愈或预防人类或动物疾病的目的的物品中具有比药物更温和作用的物品。例如，根据“药品事务法(pharmaceutical affairs act)”，准药物是不包括用于医药目的的物品的物品，并且包括用于治疗或预防人类/动物疾病的产品，对人体具有较小作用或不具有直接作用的产品等。
[0107]
本公开内容的准药物组合物可以制备成选自以下的制剂：身体清洁剂、泡沫、肥皂、面膜、软膏剂、霜剂、洗剂、香精和喷雾剂，但不限于此。
[0108]
在本公开内容的化妆品组合物或准药物组合物中，由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段可以以0.01重量％至100.0重量％或0.1重量％至10重量％包含在总组合物中。
[0109]
本公开内容的另一方面提供了用于外用皮肤制剂的药物组合物，其含有由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段。
[0110]
seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个以及抗微生物肽、衍生物，片段和外用皮肤制剂如上所述。
[0111]
除了由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列组成的抗微生物肽、其衍生物或其片段之外，本公开内容的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。
[0112]
在本公开内容中，“药学上可接受的”意指该物质在施用时不刺激有机体，并且不抑制所施用的化合物的生物活性和性质，并且可以通常用于制药领域。本公开内容的药物组合物可以与载体一起配制并用作食品、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等。
[0113]
对载体的种类没有特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何载体。载体的非
限制性实例包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、甘油和乙醇。这些可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用，但载体不限于此。
[0114]
必要时，可以将其它药学上可接受的添加剂(如赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、缓冲液或抑菌剂)添加至本公开内容的药物组合物中以供使用，并且可以将填充剂、增量剂、润湿剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂另外添加至本公开内容的药物组合物中以供使用，但药物组合物不限于此。
[0115]
可以制备本公开内容的药物组合物并将其用于适于外用皮肤制剂的各种制剂中。
[0116]
外用皮肤制剂的非限制性实例包括气雾剂、喷雾剂、清洁剂、软膏剂、应用粉末、油、霜剂等，并且外用皮肤制剂不限于此，只要其可作为外用皮肤制剂起作用即可。
[0117]
为了制备用于外用皮肤制剂的本公开内容的药物组合物，可以使用无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳液、冻干制剂、外用制剂等，并且可以将丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和酯(例如油酸乙酯)用作非水溶剂和悬浮剂，但药物组合物不限于此。
[0118]
更具体地，当制备本公开内容的药物组合物时，本公开内容的药物组合物可以与稳定剂或缓冲液一起在水中混合以制备溶液或悬浮液，并且这可以以诸如安瓿的单位来制备。当将本公开内容的药物组合物制备成气雾剂时，可以将推进剂等与添加剂共混以使水分散的浓缩物或湿粉末分散，但药物组合物不限于此。
[0119]
当将本公开内容的药物组合物制备成软膏剂、霜剂等时，可以将动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等用作载体，但药物组合物不限于此。
[0120]
本公开内容的药物组合物可以被制备用于外用皮肤制剂，并且更优选地可以在选自以下的制剂中：凝胶、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、搽剂、糊剂和巴布剂(cataplasmas)，但不限于此。
[0121]
本公开内容的药物组合物的药物有效量和用于外用制剂的有效剂量可以根据药物组合物的制备方法、施用方法、施用时间、施用途径等而变化，并且可以根据各种因素而变化，所述因素包括通过施用药物组合物实现的响应的种类和程度，种类、年龄、体重、一般健康状况，疾病的症状或程度，待施用的对象的性别、饮食和排泄，同时(simultaneously)或同时(at the same time)用于对象的药物和组合物的其它组分；以及在医学领域中熟知的类似因素。本领域普通技术人员可以容易地确定和推荐用于所需治疗的有效剂量。本公开内容的药物组合物可以以分开的方式每天施用一次或每天施用数次。因此，剂量不旨在以任何方式限制本公开内容的范围。
[0122]
在本公开内容中，施用可以作为外用制剂施用，并且本公开内容的药物组合物的优选剂量可以是1mg/kg至1,000mg/kg/天。
[0123]
本公开内容的药物组合物的施用途径和施用方法可以各自是独立的，并且所述方法没有特别限制，并且可以采用任何施用途径和任何施用方法，只要药物组合物可以达到目标区域即可。药物组合物可以以外用皮肤制剂的形式施用。具体地，可以使用将组合物涂抹或喷雾到患病区域的方法，但所述方法不限于此。
[0124]
本公开内容的药物组合物可以优选地以应用或喷雾的方式施用，并且可以具体地以局部应用至需要改善皮肤病况或者预防、改善或治疗皮肤疾病的区域的方式施用。
[0125]
本公开内容的另一方面提供了本公开内容的抗微生物肽、其衍生物或其片段用于抗微生物的用途。
[0126]
抗微生物意指表现出抗微生物活性，抗微生物活性不受微生物种类的限制，并且术语“抗微生物”可以与抗细菌、抗真菌和抗生素互换使用。
[0127]
抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0128]
本公开内容的另一方面提供了抗微生物方法，其包括用本公开内容的抗微生物肽、其衍生物或其片段治疗对象。
[0129]
对象不受限制，只要它是需要用抗微生物肽、其衍生物或其片段治疗的抗微生物治疗的对象即可。治疗是喷雾、涂抹等，并且不受限制，只要它能够使需要抗微生物治疗的对象与抗微生物肽、其衍生物或其片段接触即可。抗微生物肽、衍生物和片段如上所述。
[0130]
[实施本发明的形式]
[0131]
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例和实验例旨在说明本公开内容，并且本公开内容的范围不限于这些实施例和实验例。
[0132]
制备例1：抗微生物肽的制备
[0133]
为了检查抗微生物肽的功能，制备seq id no:5至seq id no:8的肽及其衍生肽。
[0134]
i-1：seq id no:1的肽的合成
[0135]
本公开内容中使用的氨基酸的缩写和名称如下所示。
[0136]
phe：苯丙氨酸/ile：异亮氨酸/lys：赖氨酸/leu：亮氨酸/arg：精氨酸/tyr：酪氨酸
[0137]
称量71.4mg(0.10mmol)购自novabiochem公司的2-氯三苯甲基氯树脂(1.4mmol/g负载树脂)，用7.5ml甲基氯将树脂溶剂化并反应5分钟，然后去除甲基氯。
[0138]
此后，将fmoc
–
lys(boc)
–
oh(281.1mg,0.60mmol)完全溶解在7.5ml的mc溶剂中，加入0.21ml，1.2mmol的n,n
’‑
二异丙基乙胺(dipea)，并将溶液加入到树脂中。将反应溶液在室温下摇动12小时，然后用10ml dmf溶剂洗涤4次。
[0139]
此后，加入7.5ml的哌啶在dmf中的20％(w/v)溶液，并进行摇动15分钟以从加入到树脂中的物质中完全去除9-芴基甲氧基羰基(fmoc)保护基，并用10ml的dmf溶剂洗涤4次(每1次洗涤10ml,4次)。在这一阶段，通过进行kaiser试验(e.kaiser等人，anal.biochem.,1970,34(2),595
–
598)证实了fmoc保护基的脱保护反应。
[0140]
同时，将fmoc-leu-oh(212.0mg，0.60mmol)、六氟磷酸酯苯并三唑四甲基脲鎓(hbtu)(227.6mg，0.60mmol)和羟基苯并三唑(hobt)(81.0mg，0.6mmol)完全溶解在7.5ml的dmf溶剂中，然后加入dipea(0.21ml，1.2mmol)，并将溶液加入到树脂中。将反应溶液在室温下摇动3小时，然后每1次洗涤使用10ml dmf溶剂进行4次洗涤。在这一阶段，进行kaiser试验以证实反应的完成。
[0141]
接下来，根据如下相同的合成循环连续缩合(偶联)肽。
[0142]
(1)用dmf溶剂(10ml)洗涤四次；
[0143]
(2)使用哌啶在dmf(7.5ml)中的20％(w/v)溶液脱保护15分钟；
[0144]
(3)用dmf溶剂(10ml)洗涤4次；
[0145]
(4)加入fmoc-氨基酸、hbtu、hobt和dipea；
[0146]
(5)加入hbtu、hobt和dipea缩合试剂用于氨基酸活化和缩合3小时；
[0147]
(6)用dmf溶剂(10ml)洗涤4次；
[0148]
连续重复上述(1)至(6)，并且此时，在fmoc-leu-oh之后，将fmoc保护的氨基酸(0.60mmol)以下述顺序加入到树脂反应容器中并缩合。
[0149]
(i)fmoc
–
tyr(tbu)
–
oh；
[0150]
(ii)fmoc
–
lys(boc)
–
oh；
[0151]
(iii)fmoc
–
leu
–
oh；
[0152]
(iv)fmoc
–
ile
–
oh；
[0153]
(v)fmoc
–
lys(boc)
–
oh；
[0154]
(vi)fmoc
–
lys(boc)
–
oh；
[0155]
(vii)fmoc
–
phe
–
oh；
[0156]
(viii)fmoc
–
leu
–
oh；
[0157]
(ix)fmoc
–
lys(boc)
–
oh；
[0158]
(x)fmoc
–
lys(boc)
–
oh；
[0159]
在fmoc-lys(boc)-oh缩合后的(6)后，进行最后用哌啶在dmf(7.5ml)中的20％(w/v)溶液处理，然后每1次洗涤使用10ml dmf溶剂进行3次洗涤，用mc溶剂洗涤3次以及用乙醚溶剂洗涤3次。
[0160]
在如上所述的合成完成后，立即用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95:2.5:2.5)(10ml)的混合物(10ml)处理其中缩合肽的树脂3小时，以从树脂上切割肽。通过用储存在冰箱中的100ml乙醚溶剂处理如此获得的混合溶液形成沉淀。通过离心使所获得的沉淀物完全沉淀，首先去除三氟乙酸，并将上述程序(加入100ml乙醚溶剂以洗涤沉淀物并进行离心工作以去除三氟乙酸的步骤，尝试首先去除三氟乙酸)重复2次以获得固化的沉淀物。
[0161]
使用c-18柱通过hplc使用含有0.001％三氟乙酸的5％至100％乙腈/水浓度梯度溶剂系统在50分钟内纯化沉淀物(肽)。将纯化的纯级分冻干，获得呈白色粉末状三氟乙酸盐的155mg seq id no:1的抗微生物肽。
[0162]
seq id no:1:h2n
–
[lys
–
lys
–
leu
–
phe
–
lys
–
lys
–
ile
–
leu
–
lys
–
tyr
–
leu
–
lys]
–
co2h,
[0163]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1550.17；(155mg)
[0164]
1-2：seq id no:2至seq id no:8的肽的合成
[0165]
通过与制备例1-1相同的制备方法制备seq id no:2至seq id no:8的肽，不同之处在于改变用fmoc保护的氨基酸的顺序。
[0166]
seq id no:2:h2n
–
[arg
–
arg
–
leu
–
phe
–
arg
–
arg
–
ile
–
leu
–
arg
–
tyr
–
leu
–
arg]
–
co2h,
[0167]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1718.23；(171mg)
[0168]
seq id no:3:h2n
–
[arg
–
phe
–
leu
–
phe
–
arg
–
leu
–
ile
–
leu
–
arg
–
tyr
–
leu
–
arg]
–
co2h,
[0169]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1666.18；(166mg)
[0170]
seq id no:4:h2n
–
[arg
–
arg
–
leu
–
phe
–
arg
–
leu
–
ile
–
leu
–
arg
–
tyr
–
leu
–
phe]
–
co2h,
[0171]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1666.18；(166mg)
[0172]
seq id no:5:h2n
–
[arg
–
lys
–
leu
–
phe
–
lys
–
arg
–
ile
–
leu
–
arg
–
tyr
–
leu
–
lys]
–
co2h,
[0173]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1634.2；(153mg)
[0174]
seq id no:6:h2n
–
[lys
–
arg
–
leu
–
phe
–
arg
–
lys
–
ile
–
leu
–
lys
–
tyr
–
leu
–
arg]
–
co2h,
[0175]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1634.2；(143mg)
[0176]
seq id no:7:h2n
–
[lys
–
arg
–
leu
–
phe
–
lys
–
arg
–
ile
–
leu
–
arg
–
tyr
–
leu
–
lys]
–
co2h,
[0177]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1634.2；(132mg)
[0178]
seq id no:8:h2n
–
[arg
–
lys
–
leu
–
phe
–
arg
–
lys
–
ile
–
leu
–
lys
–
tyr
–
leu
–
arg]
–
co2h
[0179]
ms(esi)m/e,[m+h]
+
＝1634.2；(172mg)
[0180]
实施例1：seq id no:5至seq id no:8及其衍生物的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0181]
为了证实作为本公开内容的抗微生物肽的功能，评价了抗微生物活性和细胞毒性。评价了本公开内容的由选自seq id no:5至seq id no:8的任一个氨基酸序列组成的抗微生物肽及其衍生物seq id no:1至seq id no:4的抗微生物活性和细胞毒性。
[0182]
具体地，为了评价抗微生物活性，测量针对大肠杆菌的抗微生物活性，用抗微生物肽处理大肠杆菌，并测量和比较细胞活力。
[0183]
为了起到抗微生物肽的作用，肽仅需要抑制微生物的存活并表现出最小的细胞毒性。因此，还通过用抗微生物肽处理人类角质形成细胞并测量细胞活力来评价对人类角质形成细胞的细胞毒性。
[0184]
抗菌活性评价方法
[0185]
该实验中使用的大肠杆菌从韩国生物科学和生物技术研究所，韩国典型培养物保藏中心(korean collection for type cultures,ktcc)分发，并使用lb培养基培养。人类角质形成细胞(hacat)购自atcc(美国典型培养物保藏中心，usa)，并在含有10％胎牛血清(fbs，gibco，usa)和1％抗生素-抗真菌剂(gibco，usa)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium，dmem，gibco，usa)中在37℃下在5％ co2培养箱中培养。
[0186]
为了测试抗微生物肽的抗微生物功效，将大肠杆菌在lb培养基中培养约8小时，然后将培养的细菌分配到96孔板中。将各种浓度的抗微生物肽样品加入到相应的孔中，并在37℃下孵育24小时。使用酶标仪在600nm处测量吸光度，并且结果表示为相对于未用样品处理的组的吸光度的百分比(％)。
[0187]
对人类角质形成细胞的细胞毒性的评价
[0188]
进行mtt测定以确定hacat细胞对抗微生物肽的活力。将hacat细胞在96孔板中以2
×
105个细胞/ml培养24小时，然后用不同浓度的样品处理，并再次培养24小时。去除培养基，并用mtt溶液(0.5mg/ml在pbs中)处理细胞。4小时后，去除mtt溶液，向每个孔中加入dmso，并在37℃下溶解甲瓒30分钟。使用酶标仪(molecular devices spectra max,sunnyvale,ca,usa)在570nm处测量吸光度。在所有实验中，通过取每个浓度的3个孔的平均值对结果进行统计学处理，并且表示为相对于未用样品处理的组的相对活力(％)。
[0189]
1-1：seq id no:1的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0190]
在seq id no:1至seq id no:8的肽中，首先测量seq id no:1的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性，并且比较和分析seq id no:1和已知的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性。本实施例中使用的抗微生物肽的序列如下。
[0191]-已知肽(bp-100)的序列：kklfk kilky l
[0192]
作为评价针对大肠杆菌的抗微生物活性的结果，已经证实了seq id no:1的肽的抗微生物活性与已知肽的抗微生物活性相比显著增加(图1a)。此外，已经证实了seq id no:1的肽对人类角质形成细胞的毒性水平维持在与已知肽相似的水平(图1b)。
[0193]
根据这一事实，已经证实了seq id no:1作为抗微生物肽与已知肽相比具有显著的效果，即使通过向已知肽的序列中进一步添加一个氨基酸获得seq id no:1。
[0194]
1-2：seq id no:2的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0195]
比较和分析seq id no:1和seq id no:2的抗微生物活性和细胞毒性。
[0196]
作为评价针对大肠杆菌的抗微生物活性的结果，已经证实了seq id no:1的肽的抗微生物活性与seq id no:2的肽的抗微生物活性相比显著增加(图2a)。此外，已经证实了seq id no:1的肽对人类角质形成细胞的毒性水平维持在与已知肽相似的水平(图2b)。
[0197]
根据这一事实，已经证实了seq id no:2作为抗微生物肽具有显著的效果。
[0198]
1-3：seq id no:5至seq id no:8的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0199]
比较和分析seq id no:5至seq id no:8的抗微生物肽的抗微生物活性和细胞毒性。
[0200]
为了评价针对大肠杆菌的抗微生物活性，除了在实施例1-1和1-1中进行的实验之外，还另外测量了mic(最小抑制浓度)和ic
50
。
[0201]
具体地，使用抗微生物功效实验作为实验方法，并且通过分别用吸光度和od值评价最小抑制浓度和50％抑制浓度来计算实验结果的mic和ic
50
值。
[0202]
结果，已经证实了seq id no:5至seq id no:8的肽的抗微生物活性优于seq id no:2的肽的抗微生物活性。已经证实了在这些中，seq id no:6和seq id no:8的肽的抗微生物活性是最显著优异的，随后是seq id no:5和seq id no:7的肽的抗微生物活性(图3a和表1)。
[0203]
已经证实了seq id no:5至seq id no:8的肽对人类角质形成细胞的毒性水平显著低于已知肽，以及与seq id no:2的肽相比降低(图3b)。
[0204]
根据这一事实，已经证实了seq id no:5至seq id no:8的肽，特别是seq id no:6和seq id no:8作为抗微生物肽具有显著的效果，因为其抗微生物活性与seq id no:1的肽相比显著增加，并且其细胞毒性与seq id no:1的肽相比显著降低。
[0205]
[表1]
[0206][0207]
比较例：seq id no:3和seq id no:4的肽的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0208]
为了评价具有相似大小和相似序列的肽是否都具有相同的抗微生物活性，分析了
与seq id no:2相比，seq id no:3和seq id no:4的抗微生物活性和细胞毒性。
[0209]
作为评价针对大肠杆菌的抗微生物活性的结果，已经证实了seq id no:2的肽的抗微生物活性与seq id no:3和seq id no:4的肽的抗微生物活性相比是显著优异的(图4a)。此外，已经证实了，与seq id no:3和seq id no:4的肽相比，seq id no:2的肽对人类角质形成细胞的毒性水平大大降低(图4b)。
[0210]
根据这一事实，已经证实了，尽管seq id no:3和seq id no:4具有与seq id no:2的肽类似的序列，但seq id no:2的肽的抗微生物活性与seq id no:3和seq id no:4的肽相比显著提高，并且seq id no:2的肽的细胞毒性与seq id no:3和seq id no:4的肽相比降低，因此，seq id no:2作为抗微生物肽的效果大大优于seq id no:3和seq id no:4的肽，并且不是所有具有与本公开内容的那些相似大小和相似序列的肽都具有优异的抗微生物活性。
[0211]
实施例2：抗微生物肽对其它细菌的抗微生物活性和细胞毒性的评价
[0212]
为了评价本公开内容的抗微生物肽是否对大肠杆菌以外的细菌具有抗微生物活性，检查了对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抗微生物效果，所述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌是由食品和药品安全部(the ministry of food and drug safety)宣布的菌株。
[0213]
具体地，使用lb培养基培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，并且使用ym培养基培养白色念珠菌，然后将培养的细菌分配到96孔板中。将各种浓度的抗微生物肽样品加入到相应的孔中，并在37℃下进行24小时孵育。使用酶标仪在600nm处测量吸光度，并且结果表示为相对于未用样品处理的组的吸光度的百分比(％)。
[0214]
结果，显示seq id no:1至seq id no:8的肽对四种细菌的抗微生物效果的ic
50
值如下，以及除seq id no:3和seq id no:4外的所有seq id no对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌显示出强的抗微生物效果(表2)。
[0215]
[表2]
[0216]
[0217][0218]
为了对四种细菌进行圆盘扩散试验，进行了以下实验。
[0219]
在各自的培养基中培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌后，将一定量的培养的细菌涂布在未硬化的固体培养基上，然后将培养基硬化。在硬化的固体培养基的表面上，放置10μl抗微生物肽样品，在其上放置干燥的3m纸盘，然后在37℃下进行孵育16小时，并观察抑制区的大小。
[0220]
结果，已经证实了当将seq id no:6的肽置于用于盘扩散方法(kirby-bauer)的涂布有各种种类的细菌的培养基上时，在涂布有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的所有培养基上观察到具有清晰边界的透明抑制区(图5)。
[0221]
因此，已经证实了本公开内容的seq id no:5至seq id no:8的抗微生物肽及其衍生物不仅对大肠杆菌，而且对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌表现出显著的抗微生物活性。
[0222]
实施例3：通过破坏微生物细胞膜的抗微生物肽的抗微生物效果
[0223]
为了仔细检查本公开内容的抗微生物肽对微生物的作用，用seq id no:6的肽处理大肠杆菌30分钟，然后使用扫描电子显微镜(sem)分析抗微生物效果。
[0224]
具体地，对于sem分析，使用lb培养基培养大肠杆菌，然后取一定量的培养的大肠杆菌，用seq id no:6的肽处理30分钟，用pbs洗涤2次，然后用pbs中的2％多聚甲醛的初级固定剂固定2小时。固定后，用pbs洗涤2次，在每个步骤中用30％、50％、70％、80％、95％和100％乙醇脱水10分钟(将用100％乙醇的最后处理重复3次)，并冻干沉淀物。在使用涂布机进行铂涂布后，进行sem分析。
[0225]
结果，当用seq id no:6的肽处理时，大肠杆菌的整个细胞膜被破坏以形成大孔，并且观察到细菌的细胞内容物的洗脱(图6)。
[0226]
根据上述结果，已经证实了本公开内容的抗微生物肽、其衍生物或其片段具有优异的抗微生物活性和降低的细胞毒性，并且因此作为抗微生物肽具有显著的效果。
[0227]
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开内容可以以不同的具体形式实现，而不改变其技术精神或基本特征。因此，应理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开内容的范围由所附权利要求书而不是由其之前的描述来限定，因此落入权利要求书的界限和范围或者这种界限和范围的等同物内的所有改变和修改旨在由权利要求书涵盖。

技术特征：
1.抗微生物肽、其衍生物或其片段，所述抗微生物肽由seq id no:5至seq id no:8的氨基酸序列中的任一个组成。2.根据权利要求1所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段，其中在所述衍生物中，对应于选自由seq id no:5至seq id no:8中的任一个组成的抗微生物肽的n-末端的第1位、第2位、第5位、第6位、第9位和第12位的任一位置的氨基酸被另一种碱性氨基酸取代。3.根据权利要求2所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段，其中所述碱性氨基酸是赖氨酸或精氨酸。4.根据权利要求1所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段，其中所述衍生物是选自seq id no:1至seq id no:4的任一个或多个。5.根据权利要求1所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段，其中所述抗微生物肽、其衍生物或其片段抑制选自大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(candida albicans)中的任何一种或多种的生长。6.编码权利要求1至5中任一项所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段的多核苷酸。7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述抗微生物肽、其衍生物或其片段由seq id no:9至seq id no:16的任一序列编码。8.用于外用皮肤制剂的载体，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段。9.化妆品组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段。10.准药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段。11.用于外用皮肤制剂的药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗微生物肽、其衍生物或其片段。

技术总结
本公开内容涉及抗微生物肽、其衍生物或其片段；编码所述抗微生物肽、其衍生物或其片段的多核苷酸；以及含有所述抗微生物肽、其衍生物或其片段的用于外用皮肤制剂的载体、化妆品组合物、准药物组合物和药物组合物。准药物组合物和药物组合物。准药物组合物和药物组合物。


技术研发人员：成敏圭 朴宝璟 崔原硕 郑永弼 朴智显 朴载厚
受保护的技术使用者：愢丽科恩株式会社
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2023/9/13